Abstract

A medicina câncer segura e eficaz é necessário devido ao aumento da população de doentes oncológicos cuja doenças em particular não pode ser curada com o tratamento actualmente disponível . Adenovírus (Ad) vetores representam um medicamento terapêutico promissor para a terapia do cancro humano. No entanto, diversos melhoramentos são necessários para vectores Ad ser terapêutica eficaz do cancro, que incluem, mas não estão limitados a, melhoria da absorção celular, actividade de morte celular de cancro aumentada, e a capacidade de visualização de vector e de seguimento uma vez injectado nos pacientes . Para este fim, buscou-se desenvolver um anúncio como uma plataforma multifuncional que incorpora segmentação, de imagem e motivos terapêuticos. Neste estudo, exploramos a utilidade desta plataforma proposto pela geração de um vector Ad contendo o poli-lisina (PK), o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) timidina cinase (TK), e a proteína fluorescente vermelha monomérica ( mRFP1) como segmentação, morte de células tumorais, e motivos de imagem, respectivamente. O nosso estudo demonstra aqui a geração do vector Ad mosaico triplo com PK, HSV-1 TK, e mRFP1 no terminal carboxilo de Ad menor proteína da cápside IX (pIX). Além disso, as funcionalidades do pKa, o HSV-1 TK, e proteínas mRFP1 no vector Ad foram retidos como confirmado por ensaios funcionais correspondente, indicando a potencial aplicação multifuncional deste novo vector Ad para a terapia genética do cancro. A validação dos vectores Ad mosaico triplos também defende a capacidade de modificação pIX como base para o desenvolvimento de vectores Ad multifuncionais

Citation:. Tang Y, Wu H, Ugai H, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) Derivação de um mosaico Adenovirus triplo para Câncer Gene Therapy. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10.1371 /journal.pone.0008526

editor: Maciej Lesniak, The University of Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de outubro de 2009; Aceito: 07 de dezembro de 2009; Publicado: 31 de dezembro 2009 |

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão 5R01CA111569 (Dr. DT Curiel) e Juvenile Diabetes Research Foundation concessão 1-2005-71 (Dr. H. Wu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro continua a ser a segunda principal causa de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 7,9 milhões de mortes (13% de todas as mortes), em 2007, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS, “os 10 principais causas de morte”) . A terapia génica representa um novo paradigma para o tratamento de doenças humanas através da inserção de material genético em células do indivíduo para fins terapêuticos [1]. Entre todos os métodos de tratamento para o cancro, a terapia génica representa uma medida molecular romance que tem o potencial de eficácia anti-tumor, com selectividade e segurança [2].

Até à data, 65,2% de todos os ensaios clínicos de terapia genética têm como alvo cancro [3]. Dentre uma série de estratégias de terapia génica do cancro, no entanto, muito poucos deles têm demonstrado um efeito terapêutico potente, em pacientes humanos. Para além da complexidade e ambiguidade de tumorigénese, outros obstáculos que podem ser responsáveis ​​pela falha de muitas aplicações de terapia génica do cancro incluem a baixa eficiência de transdução dos agentes anti-cancro e a incapacidade para transduzir toda a população de células de tumor; a fraca selectividade e ausência de duração a longo prazo de agentes anti-cancro em tumores, resultando em baixa eficiência terapêutica, bem como questões de segurança. O conceito de célula de tumor de segmentação endereços estes obstáculos e pode representar uma melhoria significativa no desenvolvimento da terapia génica como uma terapêutica anti-cancro. Dada focalização eficiente, este agente anti-câncer pode não apenas atingir mortes de células tumorais altamente seletivos e específicos, mas também evitar a absorção pelas células normais e toxicidade subsequente. Um

in vivo

imagiologia modalidade, que fornece um meio para estudar a distribuição (por exemplo, acumulação, disseminação, retenção e etc.) de terapias anti-câncer, pode abordar as principais questões que são fundamentais para a concepção e teste de terapias anti-cancro, especialmente para novos agentes terapêuticos à base de vírus replicativos [4] – [7]. Para combinar estas funcionalidades, e num esforço para criar mais potentes e fiáveis ​​agentes terapêuticos anti-cancro, uma tentativa para gerar um vector adenoviral multifuncional (Ad) para a detecção e tratamento do cancro. Este anúncio incorpora segmentação, imagem e modalidades terapêuticas do cancro.

Anúncio é um dos vetores virais mais comumente utilizados em numerosos ensaios clínicos de terapia genética do cancro [3]. Nestes estudos, a utilização de vectores adenovirais de primeira ou de segunda geração demonstrou a expressão do transgene terapêutico, mas a eficácia clínica global tem sido fraca devido às limitações acima mencionadas. Para superar as limitações, muitos esforços têm sido focados na modificação do capsídeo do anúncio em uma base tipo de câncer individual. Por exemplo, a modificação do capsídeo anúncio com segmentação ligantes dirigidos contra antígenos tumorais impulsionado transdução Ad nas células tumorais

in vitro

e

in vivo

[8], [9]. Outros esforços que visam a visualização de anúncios e acompanhamento resultou em rotular o capsídeo anúncio com bioluminescência ou fluorescência. Esta estratégia permitiu a monitoração dinâmica e direta da localização física e replicação de partículas virais

in vivo

[4], [10], [11]. Além disso, a incorporação do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) cinase de timidina (TK) sobre a superfície da cápside Ad permitido para a aplicação funcional directo desta proteína na terapia de gene suicida e microPET imagiologia [12].

o nosso laboratório e outros validaram o papel com capacidade de Ad tipo 5 menor proteína da cápside IX (pIX) para a incorporação e exibição funcional de polipéptidos e proteínas heterólogas, tais como poli-lisina (pK) [13], proteínas de fluorescência verdes e vermelhas (GFP e RFP) [4], [10], [11], ou HSV-1 TK [12], [14]. Demonstramos ainda mais a possibilidade de criar um anúncio mosaico triplo, apresentando três epítopos heterólogos diferentes em locais pIX em um único vector Ad usando modificações genéticas ou não genéticas [15]. Neste estudo, nós exploramos pIX para exibir três epítopos funcionais – pK (para segmentação), RFP monomérica (mRFP1) (para imagens), e HSV-1 TK (para terapêutica) em um único vector Ad em nosso esforço de gerar Ad multifuncional vetores.

Materiais e Métodos

Os anticorpos

O anticorpo específico para pIX era uma simpática oferta do Dr. I. Dmitriev (Gene Therapy Center, Universidade de Alabama em Birmingham) . O anticorpo anti-TK policlonal de coelho era uma simpática oferta do Dr. J. M. Mathis (Gene Therapy Programa do Departamento de Biologia Celular e Anatomia da LSU Health Sciences). O anticorpo de ratinho anti-His

6 monoclonal foi adquirido de Qiagen (Valencia, CA). O anticorpo policlonal de cabra anti-A

6 anticorpo foi comprado de Abcam (Cambridge, MA.). O anticorpo monoclonal M2 anti-FLAG e o anticorpo anti-c-myc policlonal de coelho foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO.). O anticorpo anti-RFP policlonal de coelho foi adquirido à Chemicon (Temecula, CA). Peroxidase de rábano (HRP) -conjugated cabra anti-ratinho e de cabra anti-coelho de anticorpos secundários, fosfatase alcalina (AP) -conjugated cabra anti-murganho, anticorpos secundários anti-coelho de cabra, e microscopia electrónica (EM) de grau 18 nm ouro- coloidal anticorpo anti-cabra de burro conjugado foram adquiridos a Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, PA.). grau EM 10 nm de ouro conjugada de burro anti-rato, e EM grau 25 nm burro anti-coelho de ouro conjugado com anticorpos secundários foram adquiridos de Microscopia Eletrônica de Ciência (EMS, Ft. Washington, PA.).

Células

As células de rim embrionário humano (293), células de carcinoma de pulmão humano (A549) e as células de cancro da mama humano (AU-565) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora humidificada. As células AU-565 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (2 mM de L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 4,5 g /L de glucose, 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 10% de soro bovino Fetal). Todas as outras linhas celulares foram cultivadas em modificado meio-Ham F12 de Eagle da Dulbecco (50/50) forma (Sigma) contendo soro de vitelo fetal a 10% (HighClone, Logan, Utah), 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina.

Construção de plasmídeos recombinante

Geração de plasmídeos de transporte. Todos os plasmídeos parentais foram adquiridos a partir de fontes comerciais ou foram previamente caracterizados: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-Flag-sr39tk [12], pShuttle-CMV e pAdEasy-1 (Stratagene, La Jolla, CA). Os plasmídeos vaivém foram construídos utilizando restrição e clonagem por PCR como se segue. pShldpIX = pShlpIXNhe /BglII /NheI /franco /SL (auto-ligação); O produto de PCR (pcrIXpK) contendo a sequência de codificação da proteína de fusão de pIX-PK foi gerado usando pShlpIXNhe como um molde e os iniciadores 5′-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG e 5′-GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC; pShlpIXflagpK = pShldpIX /KpnI + pcrIXpK /KpnI. O produto de PCR (pcrH6TK) contendo a sequência de codificação de proteína H6-sr39tk foi gerado usando pShuttle-IX-Flag-sr39tk como um molde e os iniciadores 5′-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC e 5′-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC; pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /NheI + pcrH6TK /NheI. O produto de PCR (pcrMycmRFP1) contendo a sequência de codificação da proteína de c-myc-mRFP1 foi gerado usando pShuttle-IX-mRFP1 como um molde e os iniciadores 5′-CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT e 5′-CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG; pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /NheI + pcrMycmRFP1 /NheI. Todos os clones foram verificados por digestão de restrição e sequenciação.

Geração de genomas de adenovírus pIX modificados por recombinação homóloga em

Escherichia coli

[16]. O shuttle vectors pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, e pShlpIXmycmRFP1 foram linearizados com a enzima de restrição Pmel e homologamente recombinado com pAdEasy-1 em electrocompetentes BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). O genoma adenoviral contém gerado IX-PK, IX-sr39tk, ou IX-mRFP1 modificado do gene pIX na região E1 suprimida. As construções de plasmídeos Ad resultantes pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK e pAdpIXmycmRFP1 foram confirmadas por digestão de restrição e sequenciação.

Virus Resgate, Propagação e purificação

pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, e plasmídeos pAdpIXmycmRFP1 foram linearizados com a enzima de restrição PacI e transf ectados para 293 células cultivadas em 25 cm

2 frascos utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram recolhidas quando foi observado efeito citopático evidente (CPE) seguido por disrupção através de quatro ciclos de congelamento e descongelamento. Os lisados ​​foram centrifugados a 3000 x g durante 5 min a 4 ° C para remover os restos celulares. Os vírus libertados no sobrenadante foram posteriormente utilizados para a propagação até que uma quantidade suficiente de células 293 foram infectadas (dez de 175 cm

2 frascos). O anúncio em células infectadas foram purificadas essencialmente como descrito anteriormente [15]. Em resumo, as células foram lisadas através de quatro ciclos de congelamento e descongelamento e centrifugada a 3800 × g durante 30 min a 4 ° C para remover os restos celulares. Os extractos celulares contendo os vírus foram carregados no topo de um gradiente por passos de 1,33 /1,45 de CsCl e centrifugadas a 55000 × g durante 3 horas a 4 ° C. A banda inferior, que contêm partículas de vírus infecciosas, foi re-centrifugada num outro passo em gradiente de 1,33 /1,45 CsCl a 100000 × g durante a noite a 4 ° C. A banda resultante de adenovírus foi recolhido e dialisado contra quatro vezes 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 10% de glicerol, 2 horas de cada vez. Os anúncios gerados foram designados como Ad-IX-flag-PK, Ad-IX-H6-sr39tk e Ad-IX-myc-mRFP1. partícula viral (VP) títulos foram determinados por espectrofotometria a OD260 utilizando procedimentos padrão [17].

Anúncio Geração de Triple pIX-Modificado por Co-Infecção

Ten 175 cm

2 frascos de 293 células foram infectadas com Ad-IX-flag-pK, Ad-IX-H6-sr39tk e Ad-IX-myc-mRFP1 em um MOI total de 200-300 VP /célula. As células infectadas foram recolhidas para purificação Ad tal como descrito em cima.

Proteína A electroforese e Western Blotting

5 × 10

9 VP de vírus purificados foram fervidas em tampão de amostra de Laemmli durante 5 min e separados em 4 a 15% de dodecil de sódio gradiente de electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE). As proteínas separadas foram então transferidas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas, que foram bloqueadas em leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBS-T), seguido por incubação com anticorpos primários (rato anti-Flag, 1 :1000; coelho anti-TK, 1:500; coelho anti-RFP, 1:500). Após a lavagem e re-bloqueio, a membrana foi incubada com os anticorpos secundários apropriados, conjugados com peroxidase de rábano (HRP) em 1:1000 diluição. O sinal de HRP foi desenvolvido com ECL além de sistema de detecção de Western blot (cuidados de saúde GE, Little Chalfont, Reino Unido), e depois detectado com filmes BioMax RM científica (Kodak, Chalon-sur-Saone, França) e um processador de filmes médicos SRX-101A (Konica, Tóquio, Japão).

ELISA

em fase sólida ensaios de imunoabsorção de ligação a enzima (ELISA) foram realizados essencialmente tal como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, 10

9 VP de vírus foram sujeitos a diluição em série (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128) em 100 ul de 100 mM de tampão de carbonato (pH 9,5), e imobilizada em triplicado em uma placa de 96 cavidades (Nunc Maxisorp) por incubação durante a noite a 4 ° C. Após 4 lavagens com TBS-T e bloqueando com TBS-T contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA), os vírus foram sondadas com o anticorpo primário, e anticorpos secundários, em seguida, AP-conjugados em TBS-T contendo 0,5% de BSA à temperatura ambiente durante 2 horas, com lavagens extensas e bloqueio no meio.

fosfato de p-nitrofenilo

(Sigma) foi utilizado para o desenvolvimento da cor tal como descrito pelo fabricante, e a absorvância (405 nm) foi obtido por um leitor de microplacas (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski, VT). Depois incubação durante 150 min à temperatura ambiente.

microscopia imunoelectrónica

imunoelectr�ica microscopia foi realizada essencialmente como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, os vírus foram aderiu às redes de níquel de 400 malha suportados com filme Formvar revestidas de carbono (EMS). Após lavagem com 1% de BSA /PBS duas vezes durante 10 minutos cada, grelhas foram sondadas com 1% de BSA /PBS, diluídos anticorpos primários (1:200 M2 anti-Flag, de cabra anti-His

6, e de coelho anti-c- myc) e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Após 2 ciclos de 1% BSA /lavagens com PBS, as redes foram incubadas com anticorpos secundários 1:10 diluído (10 nm de ouro-burro anti-rato, de 18 nm de ouro-burro anti-cabra, e 25 nm de ouro-burro anti-coelho) à temperatura ambiente durante 45 min. Após a fixação com 1% de glutaraldeído /PBS durante 20 minutos, as redes foram submetidos a coloração negativa em 2% acetato de uranilo por 12 segundos e examinadas sob microscopia eletrônica de transmissão de 60 KV na Facility UAB alta resolução Imaging.

celular ensaio de inibição de ligação

O ensaio de inibição de ligação foi realizado essencialmente como descrito anteriormente [13]. células AU-565 foram libertados dos frascos utilizando Versene, lavadas uma vez com PBS e sedimentadas e ressuspensas a 0,5 x 10

7 células /ml em tampão de ligação (DMEM /F12 com 1% de BSA). Alíquotas de 100 jil de células foram transferidas para cada tubo de ensaio de 5 ml, e foram adicionados com 50 ul de inibidor (CAR solúvel (SCAR), heparina, ou PBS). Após 30 min com agitação a 4 ° C, os vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 500 VP /célula em 50 ul de tampão de ligação foram adicionados a cada tubo, e foram agitados a 4 ° C durante 1,5 horas. As células foram lavadas uma vez com 4 ml de tampão de ligação, e o seu ADN total foi extraído e submetido a quanti-PCR em tempo real (TaqMan) para medir o número de cópias do E4 de Ad5. O ADN total em cada amostra foi quantificado por OD260.

morte celular Ensaio

A morte celular ensaio foi realizado essencialmente como descrito anteriormente [12]. As células de carcinoma do pulmão A549 foram semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 10.000 células /poço, um dia antes da infecção Ad. vectores Ad transportando proteínas de fusão de pIX-TK em várias MOI foram então utilizados para infectar células A549. Depois de 2 horas ou 12 horas de incubação, o pró-fármaco, o ganciclovir (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), foi adicionado às células a uma concentração final de 1 mM. Após 24 ou 48 horas de incubação, a viabilidade de células A549 foi avaliada utilizando CellTiter 96® AQ

ueous kit de Ensaio de Proliferação celular não radioactivo (Promega, Madison, WI) e um leitor de microplacas (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski , VT) de acordo com a instrução das fábricas.

análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando

t

-Testes entre grupos bicaudal de Student não pareado.

valores P

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Geração de um anúncio Triplo pIX-Modificado por Co-Infecção

A fim de gerar o anúncio triplo pIX-modificados transportando poli-lisina (pK), HSV-1 mutante da cinase de timidina (HSV-1 sr39tk), e monomérico proteína fluorescente vermelha (mRFP1) por co-infecção, três vírus parentais foram primeiro geradas: Ad- IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, e Ad-IX-myc-mRFP1. Estes três vírus expressar pIX-PK, pIX-TK, ou pix-mRFP1 proteína de fusão com a bandeira, Sua

6 ou tag c-myc, respectivamente (Fig. 1A). A menos que especificado, todos os vírus utilizados no estudo são a replicação incompetente (E1 /E3 suprimidas), e a transcrição de genes pIX modificadas em cada um dos vírus parental foi conduzida pelo promotor endógeno de pIX. Além disso, os anúncios pIX-modificado apenas expressam a proteína de fusão de pIX vez que os genes pIX nativos foram substituídos com os genes pIX modificados. Os três vírus parentais foram utilizados para co-infectar células 293 que suportam a replicação do AD para gerar o vírus triplo pIX-modificado. Uma vez que as três proteínas de fusão de pIX diferentes foram todas expressas e podem ser montadas em cada partícula viral, era esperado que os viriões resultantes para conter uma mistura de três tipos de proteínas de fusão de pIX (Fig. 1B). Progenies Ad geradas e purificadas em CsCl (designados como coAdpIXPTM # 1) tinha um rendimento normal, em comparação com os anúncios individuais pIX-modificados no nosso laboratório (dados não mostrados). A incorporação de proteínas de fusão de pIX foi analisada por Western blotting com anti-Flag, anti-RFP, e anticorpos anti-TK. A detecção de bandas de proteína de fusão de pIX com massas moleculares esperadas confirmou que as três proteínas de fusão de pIX (ou seja de pIX-PK, pix-TK, e pIX-mRFP1) estavam contidas nas partículas virais de piscina viral purificado (Fig. 1C).

(a) as construções dos genes pIX modificados em genomas de três vírus parentais: Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, e Ad-IX-myc-mRFP1. genes pIX modificados (marcadas com a bandeira, Sua

6 e c-myc, respectivamente) foram conduzido pelo promotor pIX nativa. (B) Diagrama estrutural de triple pIX-modificado Ad (coAdpIXPTM 1 #) gerado pela estratégia de co-infecção. PK, TK, e peptídeos mRFP1 /proteínas foram incorporadas na terminais C de pIX. (C) Análise de Western blot de vector Ad contendo modificações pIX triplos. 5 × 10

9 VP de controlo de CsCl-Ad5 purificado (pista 1) e o triplo pIX-modificado coAdpIXPTM # 1 (pista 2) foram sujeitos a SDS-PAGE. As proteínas separadas foram coradas com Azul Gelcode (Pierce, Rockford, IL.) Para detectar as proteínas virais totais (painel esquerdo) ou sondadas com anti-Flag, anti-RFP, ou anticorpo anti-TK (painel da direita).

Tela superfície pixs modificado de Ad Partículas

para testar se ou não os polipeptídeos /proteínas incorporadas no C-terminal de pIX foram apresentados na superfície viral e acessível aos anticorpos, realizamos Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA). No experimento de ELISA, anti-Flag, anticorpos anti-His

6, e anti-c-myc foram utilizados para detectar os três tipos de pixs modificados. O controlo de Ad5 de tipo selvagem contendo pIX não foi reconhecido por qualquer um destes anticorpos. Os vírus coAdpIXPTM # 1 foram reconhecidas pelo anti-Flag, e anticorpos anti-c-myc (Fig. 2). No entanto, os vírus não puderam ser reconhecidas por anticorpos anti-A

anticorpo 6 (Fig. 2), quer de anticorpos ou anti-TK (dados não mostrados). Este resultado sugere que o PK e mRFP1 foram incorporados os vectores Ad pIX modificados triplos. A ligação insignificante de anti-His

6 ou anticorpo anti-TK para os vírus indica que TK era ou não eficaz da superfície exposta nas cápsides virais ou a acessibilidade destes dois anticorpos para proteínas de TK em uma tal configuração foi insuficiente para ser detectados em ELISA. análise

ELISA do vector Ad contendo modificações pIX triplos. 10

9 VP de Ad5 purificado em CsCl (controlo negativo) ou coAdpIXPTM # 1 foram submetidas a uma diluição em série (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) e imobilizado numa placa de ELISA. Os vírus foram sondadas com anti-Flag (1:2000), anti-His

6 (1:1000), e anti-c-myc (anticorpos 1:1000), seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (1:1000). Após o desenvolvimento da cor, a absorvância da luz foi medida e representada graficamente no eixo Y contra as concentrações virais. Cada ponto representa a média e o desvio padrão (DP) de determinações em triplicado. Algumas barras de erro em pé de SD são menores do que os seus símbolos.

Mosaicismo do Triplo pIX-Modified Ad

Western blot e análise ELISA das partículas virais purificadas demonstraram que três tipos de proteínas de fusão de pIX foram incorporadas nas partículas Ad produzidos por co-infecção (Fig. 1). Para examinar se uma partícula viral único anúncio pode exibir todos os três tipos de proteínas funcionais, foi realizada microscopia eletrônica immunogold de visualizar diretamente partículas Ad pIX-modificados. Anti-Flag, anti-His anticorpos

6 e anti-c-myc foram utilizados para detectar pIX-PK, pix-TK e proteínas pIX-mRFP1 nas partículas virais, respectivamente, seguido de três anticorpos secundários correspondentes conjugado com 10 , 18 e 25 partículas de ouro nm, respectivamente. Como mostrado na Figura 3, nenhuma partícula de ouro foi ligado ao controlo de Ad5 visualizadas tipo selvagem pIX, enquanto que as partículas virais Ad contendo uma única proteína de fusão de pIX (Ad-IX-Flag-PK, o Ad-IX-H6-TK, e Ad -IX-myc-mRFP1) foram coradas por partículas de ouro correspondente. Os vírus modificados triplos coAdpIXPTM # 1 foram reconhecidas pelo anti-Flag, anti-His

6 e anticorpos anti-c-myc e marcadas com 10, 18 e 25 nm de partículas de ouro. Os resultados demonstraram que os três tipos de proteínas de fusão de pIX podiam coexistir em uma única partícula viral e foram expostos na superfície do vírus.

Controlo ou vectores Ad-pIX modificadas foram carregadas em grelhas EM, sondadas com anticorpos conjugados de nanopartículas de ouro e observadas ao microscópio de electrões a 60 KV. De ratinho anti-Flag, de cabra anti-His

6, e anticorpos de coelho primários anti-c-myc foram utilizados para a detecção de três tipos de etiquetas em PK, HSV-1 TK, e mRFP1, respectivamente. anti-rato, 18 nm de ouro-burro anti-cabra, anticorpos 10 nm de ouro por burros e 25 nm de ouro de burro anti-coelho secundários foram utilizados para a marcação posterior ouro de partículas de anúncios. setas finas sólidas indicam 10 partículas de ouro nm, setas vazias indicam 18 partículas nm de ouro, e as setas grossas sólidas indicam 25 partículas nm de ouro. A barra de escala em cada painel representa 50 nm de comprimento.

É de salientar que, embora existam 240 cópias de moléculas pIX em cada partícula viral, a poucos anticorpos de partículas de conjugado de ouro foram presos à as partículas virais Ad modificada-pix. Estes dados são consistentes com relatos anteriores [15], [19], [20]. Isto é provavelmente devido à baixa acessibilidade relativa de pIX a partir da superfície da cãpside [20] – [22] e efeito de impedimento espacial de partículas de ouro de anticorpo conjugado com um contra o outro durante a coloração. Nós escolhemos grandes partículas de ouro para facilitar a diferenciação entre os três epítopos, os quais têm ainda uma maior proporção de anticorpos /ouro e um efeito de impedimento espacial mais elevada do que a de partículas de ouro pequenas que são vulgarmente usados. Além disso, anti-His

6 anticorpo não se liga de forma eficiente pIX-TK como mostrado na Figura 2. Além disso, a baixa eficiência de coloração tripla pode ser outra razão do padrão de coloração dispersa mostrado na Figura 3. Por conseguinte, é não é surpreendente que a frequência dos anúncios triplamente-rotulados é baixa -. partículas virais apenas cerca de 1% foram coradas com os três tipos de partículas de ouro (Tabela 1)

Segmentação Atividade de Incorporated Poly-Lisina em o Triplo pIX Ad Mosaico

Ad5 foi demonstrada para se ligar ao seu receptor celular primária, o vírus coxsackie B e receptor de adenovírus (CAR), como o passo inicial de infecção através da sua proteína globular da fibra [23]. A poli-lisina (PK) incorporados em locais em pIX AdLucIXpK foi mostrado para mediar a interacção com Ad proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs celulares), resultando na ligação independente de CARRO vírus-célula e na transdução [13]. Portanto, a fim de examinar se os peptídeos pk incorporadas ao triplo pIX mosaico vector Ad tiveram atividade segmentação semelhante ao HSPGs, realizamos célula de ligação e ensaios de inibição com (baixo nível de CAR) CAR deficientes au-565 células na presença ou ausência de heparina ou CAR proteína (SCAR) solúvel

Outra versão do triple vector Ad pIX-modificado foi criado usando três vírus pIX-modificados parentais previamente caracterizados:. AdLucIXpK [13], Ad-dE1-IX- sr39tk [12], e Ad-IX-mRFP1 [4] (etiquetas Flag estavam presentes em todas as três proteínas de fusão de pIX). A incorporação de pIX-PK, pix-TK, e proteínas pIX-mRFP1 no Ad mosaico triplo derivado (designado como coAdpIXPTM # 2) foi verificada por transferência de Western sobre os vírus purificados utilizando anticorpos anti-Flag, anti-RFP, e anti- anticorpos TK (Fig 4C.)

(a) as construções dos genes pIX modificados em genomas de três vírus parentais:. AdLucIXpK, Ad-dE1-IX-sr39tk e Ad-IX-mRFP1. genes pIX modificados (marcadas com a bandeira) foram conduzido pelo promotor pIX nativa. (B) Diagrama estrutural de triple pIX-modificado Ad (coAdpIXPTM 2 #) gerado pela estratégia de co-infecção. (C) 5 × 10

9 VP de controlo de CsCl-Ad5 purificado (pista 1) e o triplo pIX-modificado coAdpIXPTM # 2 (pista 2) foram sujeitos a SDS-PAGE. As proteínas separadas foram coradas com Azul Gelcode (à esquerda) ou sondadas com anti-Flag, anti-RFP, ou anticorpo anti-TK. A longa exposição do blot anti-Flag foi incluído para mostrar a proteína pIX-PK, que está incorporada em partículas de anúncios em um nível muito baixo. O “*” asteriscos indicam produtos de degradação de proteína de fusão de pIX-mRFP1.

Observou-se que o AdLucIXpK controlo positivo, no qual todas as moléculas de pIX foram modificados por PK, exibiram, tanto quanto duas vezes de de ligação celular em células AU-565 CARRO deficiente em relação ao tipo selvagem Ad5. O mosaico triplo Ad5 (coAdpIXPTM # 2), em que apenas uma porção das moléculas de pIX continha a modificação de pK, mostrou actividade de ligação de aproximadamente 1,5 vezes maior em comparação com células do tipo selvagem Ad5 (Fig. 5). Além disso, mais de 90% a capacidade de AdLucIXpK e 50% do coAdpIXPTM # 2 de ligação celular foram inibidos por heparina livre a uma concentração final de 500 ug /ml, enquanto que a ligação da célula de controlo de Ad5 não foi afectado de forma significativa (Fig. 5). A adição de 200 ug /mL inibiu a ligação cicatriz mais do que 80% de células de controlo de Ad5, apesar de terem um efeito relativamente modesto no AdLucIXpK (60%) e coAdpIXPTM # 2 (25%) (Fig. 5). Em conjunto, os nossos dados sugerem que os péptidos exibidos em pK coAdpIXPTM # 2 cápsides podem mediar celular independente de CARRO direccionamento através da interacção com os receptores celulares de sulfato de heparano.

UA-565 células foram incubadas com Ad5, AdLucIXpK, ou coAdpIXPTM # 2 a uma MOI de 500 VP /célula, na presença de 500 ug /ml de heparina ou /ml de proteína cicatriz 200 ug a 4 ° C. Ad partículas ligadas foram quantificadas por quantitativa PCR em tempo real e normalizado com o ADN celular total. Cada barra representa a média e DP de determinações em triplicado, e asteriscos indicam diferença significativa entre os grupos especificados.

Actividade Enzimática da Incorporated TK no Triplo pIX Mosaic Ad

proteína TK

HSV-1 pode ser geneticamente incorporados em Ad em locais pIX com a sua actividade enzimática nativa retido, que pode ser utilizado para a terapia genética do cancro com o pró-fármaco ganciclovir (GCV), e pode ser utilizado para

in vitro

e

in vivo

imagem quando combinada com o sistema microPET [12], [14]. Para investigar se as proteínas de fusão de pIX-TK pode funcionar normalmente, avaliou-se a citotoxicidade induzida por TK na presença de GCV, a uma concentração farmacológica por ensaio de MTS. Para avaliar a proteína de fusão de pIX-TK diretamente libertado a partir de partículas AD Após a entrada celular de sucesso, foram utilizadas células de carcinoma de pulmão A549, em que a replicação de Ad não replicativo e a expressão do gene pIX são mínimas. As células A549 foram infectadas com Ad único PIX-modificado (Ad-dE1-IX-sr39tk) ou triplo pIX mosaico Ad (coAdpIXPTM # 2) a várias MOI. GCV foi adicionado em células infectadas duas horas após a infecção e a morte celular mediada pela proteína de fusão de pIX-TK foi avaliada por ensaio de MTS 24 horas depois. Os dados sugeriram que não havia citotoxicidade significativa associada-GCV induzida tanto por Ad-dE1-IX-sr39tk ou infecção coAdpIXPTM # 2 a uma MOI elevada (10.000 VP /célula) (Fig. 6A). No entanto, a uma MOI inferior (5000 VP /célula), Só Ad-dE1-IX-sr39tk infecção mostrou GCV induzida por citotoxicidade significativa. Isto indicou que a actividade de pIX-TK no Ad triplo pIX-modificado foi menor do que a de Ad-TK-pIX modificado única, o que pode ser atribuído às diferenças no número de cópias de pIX-TK incorporadas nas partículas virais.

As células A549

(a) foram infectadas com Ad5 (controle negativo), Ad-dE1-IX-sr39tk ou coAdpIXPTM # 2 em várias MOI. 2 horas mais tarde, pró-fármaco GCV foi adicionado para as células com a concentração final de 1 mM. 24 horas mais tarde, a actividade de morte celular induzida por GCV convertido mediada através pIX-TK foi avaliada por ensaio de MTS. As células infectadas com vírus foram normalizados com a de células não infectados como a sobrevivência celular relativa. (B) células A549 foram infectadas com Ad-dE1-IX-sr39tk único PIX-modificado ou coAdpIXPTM # 2 em várias MOI. 12 horas mais tarde, com GCV foi adicionado para células numa concentração final de 1 mM. 48 horas mais tarde, a actividade de morte celular de TK /GCV foi avaliada como o mesmo que descrito acima.