Abstract

Mediador de proteína checkpoint de danos ao DNA 1 (MDC1) desempenha um papel precoce e do núcleo em ruptura Repair Double-Strand (DDR ) e a ataxia (ATM) resposta mediada mutado para DNA-telangiectasia quebras de cadeias duplas (DSB), e assim envolve a patogénese de doenças relacionadas com danos de vários ADN, tais como o cancro. Trabalhamos com a hipótese de que os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de

MDC1

que têm potências de afectar a expressão ou função MDC1 foram associados com risco de câncer de pulmão. Em um estudo de caso-controle de dois estágios, foi testada a associação entre 5 SNPs putativamente funcionais de

MDC1

eo risco de câncer de pulmão na população do sul da China, e validado a associação promissora em uma população oriental chinesa. Nós encontramos o SNP rs4713354A C que está localizado na região 5 ‘não traduzida de

MDC1

foi significativamente associada com o risco de câncer de pulmão em ambas as populações (

P

= 0,024), com um odds proporção que 1,23 (95% de intervalo de confiança = 1,35-1,26) para o rs4713354C (CA + CC) genótipos em comparação com o genótipo rs4713354AA. No entanto, não foi observada associação significativa entre outros SNPs e risco de câncer de pulmão. A análise à base de gene descansou com esses SNPs sugeriu o

MDC1

como um gene suscetível a câncer de pulmão (

P

= 0,009). Além disso, por meio de consulta a base de dados de expressão de genes, que ainda verificado que os genótipos rs4713354C confere uma expressão de ARNm significativamente menor do que o de MDC1 genótipo rs4713354AA em 260 casos de células linfoblastóides (

P

= 0,002). Nossos dados sugerem que o SNP rs4713354A C de

MDC1

pode ser um biomarcador genética funcional para a susceptibilidade ao câncer de pulmão em chinês

Citation:. Wang B, Zhang L, Qiu F, Fang W , Deng J, Y Zhou, et al. (2014) A Associação Newfound entre

MDC1

polimorfismo funcional e Lung Cancer Risk em chinês. PLoS ONE 9 (9): e106794. doi: 10.1371 /journal.pone.0106794

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 08 de abril de 2014; Aceito: 02 de agosto de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional Natural Científico da China concede 30671813, 30872178, 81072366, 81273149 (JCL), e em parte por 81.001.278 e 81171895 (YFZ), 81.271.350 (WJ); o Guangdong Provincial Investigação Científica Grants 8251018201000005 (JCL), Guangdong Provincial Alto Nível de peritos Grants 2010-79, Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa Inovativa em IRT0961 concessão University e Guangdong ciência fundamento natural concessão equipa 10351012003000000 (JCL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

DNA danos resposta (DDR) é um procedimento celular sofisticado que envolve várias moléculas para reparar danos no DNA e manter a integridade do genoma e fidelidade. Normalmente, o dano de ADN pode ser causada por agentes cancerígenos do tabaco ou de radiação ionizante ou de outras fontes, que desencadeia DDR, incluindo a activação de checkpoint do ciclo celular, o início do programa de transcrição, e a execução de reparação de ADN, ou a iniciação de apoptose quando o dano é grave [1 ] – [3]. A falha para reparar lesões do ADN iria resultar em instabilidade genómica e uma variedade de doenças transmitidas geneticamente, tais como o cancro. DDR pode proteger o ADN celular contra danos por recrutamento de uma série de proteínas DDR que actuam como sensores, transdutores, mediadores e efectores em DDR. A cascata DDR começa com os sensores que detectam o dano e transportar o sinal inicial para os transdutores. Os transdutores, ajudados pelos mediadores, amplificam o sinal e transmiti-lo para os efetores, que realizam diversas funções, tais como a reparação, a ativação do ponto de verificação e, se necessário, a apoptose [4].

Mediador de DNA proteína danos checkpoint 1 (MDC1), também conhecido como factor nuclear com BRCT domínios 1 (NFBD1), é um agente importante no DDR que regula a activação da fase intra-S e G2 /M do ciclo celular de fase em resposta a danos no ADN [5 ], [6]. MDC1 funções majorly como um mediador na RDA, que medeia o recrutamento de outras proteínas de DDR, tais como ataxia mutado-telangiectasia (ATM), cancro da mama 1, início precoce (BRCA1), Mre11 /Rad50 /NBS1 (MRN) complexa, o local do dano [7] – [10]. Evidências recentes também mostraram que MDC1 tem um papel direto na reparação de DNA quebras de cadeia dupla (LAP), participando nas duas principais vias de reparação do DNA, a recombinação homóloga e resposta de juntar final não homóloga [11] – [13], e na activação do checkpoint21 decatenation mitose e [14], [15]. Disfunção de MDC1 foi relatado para causar várias desordens [16], [17], tais como a espermatogénese defeituoso [18]. Hoje em dia, MDC1 mais e mais evidências suportado para ser um supressor tumoral potencial com papéis na reparação de danos no ADN e inibindo o crescimento de tumores [19] – [24]. MDC1 foi encontrado para ser expressa humilde de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, carcinomas da mama [25] e carcinoma gástrico [26].

Human

gene MDC

está localizado no cromossomo 6p21.3, uma região que tem sido relatada como sendo uma região susceptível de cancro do pulmão em asiáticos por um estudo de associação de todo o genoma (GWAS) [27]. Estudos anteriores descobriram que as variantes genéticas do

MDC1

foram associados com o vírus Epstein-Barr (EBV) títulos de anticorpos em chinês e radiossensibilidade em Americana [28], [29]. EBV e radiossensibilidade são dois fatores de alto risco de câncer humano, portanto, estas variantes genéticas de

MDC1

também podem afetar a susceptibilidade de câncer. No entanto, o estudo sobre este aspecto ainda está faltando. polimorfismos nucleotídicos singulares (SNPs) que estão localizados no promotor ou exões de genes têm potências de afectar a expressão ou função do gene, e, assim, influenciar a susceptibilidade de doenças humanas [30] – [32]. No presente estudo, foi testada a hipótese de que esses SNPs putativamente funcionais de

MDC1

foram associados com o risco de câncer de pulmão com base em um estudo de caso-controle de dois estágios, e avaliou a função dos SNPs promissores por meio de análise bioinformática .

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais da Universidade de Medicina Guangzhou (Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Guangzhou: GZMC2007-07-0676 ) e da Universidade Soochow (Comitê de Ética da Universidade de Soochow: SZUM2008031233). Todos os participantes foram agendados para uma entrevista face a face após consentimentos informados por escrito foram obtidas.

assunto Estudo

Depois tem a aprovação dos conselhos de revisão institucionais da Universidade de Medicina Guangzhou e da Universidade de Soochow, realizamos dois estudos de caso-controle independentes no sul chinês chineses e orientais, respectivamente. Conforme descrito em estudos previamente publicados [33] – [35], 1.056 casos histologicamente confirmados de câncer de pulmão e 1056 controles saudáveis ​​que estavam com casos na idade-correspondida frequência (± 5) e sexo, foram recolhidas na cidade de Guangzhou e área circundante; e 503 casos de câncer de pulmão e 623 controles pareados por freqüência foram recrutados na cidade de Suzhou. A população do sul da China foi usado como um conjunto descoberta, enquanto os chineses orientais foi usado como um conjunto de validação. Todos os participantes foram agendados para uma entrevista face a face depois foram obtidos consentimentos informados por escrito. Eles foram convidados a fornecer dados sobre idade, sexo, tabagismo, maços-anos fumados, beber status e histórico familiar de câncer com um questionário estruturado, bem como uma amostra de sangue periférico 5 ml. As definições de tabagismo, maços-anos fumados, estatuto e história familiar de câncer de beber foram descritas em estudos publicados anteriormente [33] – [35].

selecção SNP e genotipagem

utilizado o bloco FuncPred da web Server SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov/) para selecionar SNPs putativamente funcionais de

MDC1

com uma frequência comum (ou seja, menor freqüência do alelo, MAF 5%) em chinês. Nós encontramos e escolheu cinco SNPs satisfazer o critério acima mencionado. Eles foram rs4713354A C (+ 39A C: localizando na 39 posição das sequências de cDNA), rs9262152G A (Arg268Lys: causando uma alteração de aminoácidos de arginina para lisina na codão 268), rs2075015G A (Glu371Lys: causando um mudança de aminoácido de ácido glutâmico para lisina na codão 371), rs28986465C T (Pro386Leu: causando uma alteração de aminoácidos de prolina para leucina no códão 386), rs9461623T C (Ser1180Pro: causando uma alteração de aminoácido de serina para prolina no codão 1180). Foram genotipados acima de cinco SNPs utilizando o ensaio Taqman discriminação alélica no sistema ABI7900HT (Applied Biosystems por Life Technologies, Foster City, CA) com primers e sondas desenhadas pelo software Primer Express 3.0 (Applied Biosystems por Life Technologies). Os iniciadores e sondas para cada SNP foram apresentados na Tabela S1 S1 Arquivo.

A análise estatística

A distribuição de cada um dos genótipos SNP e Hardy-Weinberg (HWE) de SNPs nos controles de freqüência, foram testadas pelo teste do qui-quadrado. O odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) implicando associação entre cada SNP de

MDC1

eo risco de câncer de pulmão foram calculados utilizando o modelo de regressão logística incondicional com ou sem ajuste para idade, sexo , tabagismo, status e histórico familiar de câncer de beber. A associação à base de gene foi testado usando o software Vegas [36]. Interação entre SNPs promissoras e fatores selecionados foi avaliada pela análise da interação multiplicativa [37]. A homogeneidade dos resultados em conjuntos de dois e em sub-grupos foi testada pelo teste de Breslow-dia. Além disso, o poder estatístico foi calculado usando o PS Software [38]. Todos os testes foram dois lados usando o software SAS (versão 9.2; SAS Institute, Cary, NC).

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Associação entre

MDC1

SNPs e cancro do pulmão risco

a tabela 1 mostra a distribuição de frequência dos cinco SNPs em casos e controlos. As distribuições genotípicas de todos os SNPs nos controles de chineses do sul estavam todos de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (

P Art 0,05 para todos). Dos cinco SNPs, apenas os genótipos de rs4713354A C exercida uma diferença significativa na distribuição de frequência entre os casos e controles no conjunto de descoberta (

P

= 0,006). Como mostrado, em comparação com indivíduos portadores do genótipo rs4713354AA comum, os portadores do genótipo rs4713354CA e rs4713354CC genótipo existiu 1,32 dobras (odds ratio [OR] = 1,32, 95% intervalo de confiança [IC 95%] = 1.08-1.61) e 1.96- dobras (OR = 1,96, 95% CI = 1,03-3,61) no risco de câncer de pulmão, respectivamente. Depois de combinados os dois genótipos de risco, os genótipos variantes rs4713354C (isto é, CA + CC) conferiu um aumento significativo no risco de câncer de pulmão (OR = 1,36, IC = 1,12-1,65 95%). As associações do quadro foram também verificados na oriental chinesa e os resultados foram consistentes (teste Berslow-Day:

P

= 0,768), como mostrado na Tabela 1. A distribuição dos genótipos rs4713354C frequência foi maior nos casos em que os controles em o conjunto de validação (33,2% vs. 27,3%). A diferença de freqüência do genótipo estava se aproximando significativa (

P

= 0,098). Enquanto isso, os genótipos variantes rs4713354C contribuído para um aumento significativo do risco de cancro do pulmão (OR IC = 1,32, 95% = 1,02-1,71), em comparação com o genótipo rs4713354AA. Em seguida, fundiu as duas populações para aumentar o poder do estudo. Descobrimos que os indivíduos com os genótipos variantes rs4713354C tinha 1,33 dobras risco de câncer de pulmão em comparação com os portadores do genótipo rs4713354AA (OR = 1,33, IC 95% = 1,14-1,55) aumentaram. A análise de associação à base de gene também revelou que o

MDC1

gene a ser associada com o risco de cancro do pulmão com uma significância estatística aproximando (

P

= 0,057) com base nos resultados de cima de cinco SNPs, e o mais significativos associados-SNP foi rs4713354A C (

P

= 0,003). Além disso, as distribuições das características demográficas do conjunto de descoberta e conjunto de validação de frequência são apresentados na Tabela S2 em S1 Arquivo

análise de estratificação da associação entre rs4713354A . C e risco de câncer de pulmão

a Tabela 2 mostra as distribuições de freqüência de rs4713354A genótipos C em casos e controles e associações entre o SNP eo risco de câncer de pulmão em cada sub-grupo estratificada pelos fatores de confusão. Nenhuma associação significativa entre o SNP rs4713354A C e risco de câncer de pulmão foi observada em indivíduos com maços-anos fumados 20 ou ≥20 e em indivíduos com história de câncer. No entanto, isto pode ser devido à dimensão limitada da amostra de teste porque a homogeneidade indicaram que não houve diferença significativa entre estes stratum-RUP em cada sub-grupo (

P

0,05 para todos). Além disso, não se observou interacção significativa para os fatores selecionados e o SNP no aumento do risco de câncer de pulmão (

P Art 0,05 para todos), que pode ser devido a uma falta de poder do estudo para análise de interação. Além disso, os resultados da análise de regressão logística múltipla mostrou que o fumo e o genótipo de risco de SNP rs4713354A C ainda estavam associados com risco aumentado de cancro de pulmão, como mostrado na Tabela 3 (

P

0,001 para ambos) .

correlação genótipo-fenótipo por análise bioinformática

o SNP rs4713354A C está localizado na região 5 ‘não traduzida (5’-UTR) do

MDC1

gene, pode afetar a atividade transcrição da

promotor MDC1

. Por isso, realizamos análises de bioinformática para explorar a possível função desse SNP na expressão MDC1. Ao consultar a base de dados Snpexp (https://app3.titan.uio.no/biotools/tool.php?app=snpexp), encontramos uma correlação significativa entre a rs4713354A genótipos C e os níveis de expressão de mRNA de MDC1 em 260 casos de células linfoblastóides em toda a população sob o modelo genético dominante (

P

= 0,002). Células que transportam os genótipos variantes rs4713354C expressa significativamente mais baixos níveis de mRNA de MDC1 (CA: 9,066 ± 0,184; Cc: 9,030 ± 0,185) do que células portadores do genótipo rs4713354AA (9,138 ± 0,237). Utilizou-se ainda mais o servidor Web SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov/) para prever o mecanismo molecular possível deste SNP em que afecta a expressão do gene e verificou que a A a C transvertion de rs4713354A C resultaria numa perda de sítios de ligação de três fatores de transcrição (TFS) que são CEBPA, CEBP e NR2F2.

Discussão

Várias evidências suportadas que o

MDC1

gene a ser um tumor potencial supressor de repouso com as suas funções essenciais na reparação de danos no DNA e as suas interacções com vários genes importantes relacionados com o tumor, tais como p53, e NBS1 53BP1 [19] – [24], [39], [40]. Aqui, descobrimos que o SNP rs4713354A C de

MDC1

foi associado com o risco de câncer de pulmão em chinês. Os genótipos variantes rs4713354C poderia causar uma baixa expressão de MDC1

in vivo

e, assim, contribuído para um aumento do risco de cancro do pulmão. No entanto, não encontramos nenhuma associação significativa entre outras quatro SNPs putativamente funcionais de

MDC1

e pulmão risco de câncer. Uma análise mais aprofundada suportado o

MDC1

gene seja um gene susceptível e rs4713354A C a ser suscetíveis de um loci de cancro do pulmão. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório sobre variantes genéticas de

MDC1

e susceptibilidade de câncer.

Foi observada redução aberrante ou a falta de MDC1 em tecidos de câncer de pulmão [25], e a regulação negativa da expressão MDC1 em células de cancro do pulmão que resultam em apoptose induzida por radiação defeituoso [41]. Além disso, a cantaridina toxina pode causar danos ao DNA através da inibição da expressão MDC1 em células de cancro do pulmão [42]. Assim, a expressão perda de MDC1 é uma condição importante durante a carcinogênese de pulmão. O SNP rs4713354A C está localizado na extremidade 5 ‘UTR de

MDC1

, uma região geralmente reconhecido como promotor ou elemento de emenda exônico de genes. análises de bioinformática mostraram que o A a C transvertion de rs4713354A C provoca uma perda de sítios de três TFs que são CEBPA, CEBP e NR2F2 vinculativo, e os genótipos variantes rs4713354C exercer uma expressão MDC1 diminuiu

in vivo

. Isto é consistente na plausibilidade biológica com nossa observação de genótipos variantes rs4713354C conferidos um risco aumentado de câncer de pulmão. Curiosamente, não só os três TFs envolve o desenvolvimento do cancro do pulmão [43] – [45], mas também CEBPA desempenha um papel importante no ciclo celular [46]. É possível que as duas moléculas, CEBPA e MDC1 pode ter um cross-talk na regulação do ciclo celular, que precisa de um estudo mais aprofundado.

Alguns estudos investigaram a associação entre o

MDC1

SNPs e risco de doenças humanas. No entanto, os resultados foram controversos. Uma variante sinónimo de

MDC1

foi relatado para ser associado com o aumento da radiossensibilidade mas não o risco de câncer de próstata [29]. Um estudo chinês relatou um alelo variante do

MDC1

exibiram uma associação significativa com EBV soropositividade [28]. Um estudo Caucasiano relataram nenhuma variante do

MDC1

foi associado com o risco de câncer de mama, bem como efeitos prejudiciais de ADN da terapia de radiação [47]. No entanto, os estudos acima foram todos falta de poder do estudo por causa de seus tamanhos de amostras limitadas. No estudo atual, com base em um estudo de caso-controle de dois estágios com um tamanho relativamente grande amostra, mostrou que um promotor SNP de

MDC1

contribuiu para um aumento significativo do risco de câncer de pulmão em chinês. O poder do estudo era forte no estudo atual, conseguimos um poder 94,47% do estudo (teste bilateral, α = 0,05) para detectar uma OR de 1,33 para os genótipos variantes rs4713354C, que ocorreu com uma frequência de 24,7% no controlos. Uma análise mais aprofundada com base nos resultados dos cinco SNPs putativamente funcionais de

MDC1

sugeriu

MDC1

ser um gene suscetível a câncer de pulmão.

Uma vez que nosso estudo foi um hospital- com base estudo caso-controle, que tinha algumas limitações, como viés, incluindo viés de seleção e viés de informação. Estes podem causar associações espúrias entre os SNPs estudados eo risco de câncer. No entanto, quatro pontos apoiado nossos resultados não foram alcançados por acaso e a associação significativa foi credível. O primeiro foi que conseguimos dois resultados consistentes em duas populações independentes. A segunda foi que conseguimos um forte poder de estudo. A terceira foi que os bioinformática análises demonstraram uma consistência na plausibilidade biológica com a nossa observação. Além disso, os resultados do GWAS chinês também mostrou que a frequência de rs4713354A genótipos C foi diferente entre os casos e controles com aproximando significância estatística (

P

= 0,078) [48]

Na. Concluindo, nossos dados mostraram que o promotor SNP rs4713354A C de

MDC1

e

gene MDC1

foram associados com o risco de câncer de pulmão em chinês, influenciando a expressão MDC1. Tanto o SNP rs4713354A C e

MDC1

pode ser um biomarcador genético para susceptibilidade de câncer de pulmão em chinês. Validações com estudos populacionais baseados maiores em diferentes grupos étnicos são garantidos.

Informações de Suporte

arquivo S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0106794.s001

(DOC)

Tabela S1.

Os iniciadores e sondas para os cinco SNPs putativamente funcionais de MDC1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106794.s002

(DOC)

Tabela S2. As distribuições de freqüência

de variáveis ​​selecionadas em casos e controles

doi: 10.1371. /journal.pone.0106794.s003

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Zhanhong Xie, Ms. Wanmin Zeng e Ling Liu para os seus atendimentos em assuntos de recrutamento.