Abstract

Fundo

O objectivo global deste projecto é estabelecer um câncer de bexiga derivado do paciente xenotransplante plataforma (PDX), anotado com sequenciamento profundo e informação clínica do paciente, para acelerar o desenvolvimento de novas opções de tratamento para pacientes com câncer de bexiga. Aqui, descrevemos a criação, caracterização inicial e uso da plataforma para esta finalidade.

métodos e resultados

Vinte e dois PDXs com informações clínicas anotada foram estabelecidas a partir de amostras não selecionadas incultos câncer da bexiga clínica em ratinhos imunodeficientes NSG. A fidelidade morfológica foi mantida em PDXs. sequenciamento exome toda revelou que PDXs e cânceres de pacientes parental partilhada 92-97% de aberrações genéticas, incluindo múltiplos alvos druggable. Para reaproveitamento de drogas, um EGFR /HER2 lapatinib inibidor duplo foi eficaz em PDX BL0440 (sobrevida livre de progressão ou PFS de 25,4 dias contra 18,4 dias no controlo, p = 0,007), mas não em PDX BL0269 (12 dias contra 13 dias em o controle, p = 0,16), embora ambos expressos

HER2

. Para tela para o MTT mais eficaz, avaliamos três drogas (lapatinib, ponatinibe e BEZ235) combinado com aberrações na PDX BL0269; mas apenas um inibidor BEZ235 PIK3CA foi eficaz (p 0,0001). Para estudar os mecanismos de resistência secundária, um receptor do factor de crescimento de fibroblastos 3 inibidor BGJ398 prolongada PFS de PDX BL0293 de 9,5 dias de controle para 18,5 dias (p 0,0001), e as biópsias em série revelou que a MAPK /ERK e vias PIK3CA-AKT foram ativados durante a resistência. A inibição destas vias prolongou significativamente o PFS de 12 dia do controlo a 22 dias (p = 0,001). Para triagem de medicamentos quimioterápicos eficazes, quatro dos seis primeiros PDXs foram sensíveis à combinação de cisplatina /gemcitabina, e chemoresistance a uma droga poderia ser superada pela outra droga.

Conclusão

O PDX modelos descritos aqui mostram uma boa correlação com o paciente, a nível genómico e a resposta do paciente ao tratamento conhecido. Isto suporta uma avaliação mais aprofundada das PDXs por sua capacidade de prever com precisão a resposta de um paciente a novas estratégias de combinação alvo e para o câncer de bexiga

Citation:. Pan Cx, Zhang H, Tepper CG, Lin Ty, Davis RR, Keck J, et ai. (2015) Desenvolvimento e caracterização de cancro da bexiga xenoenxertos Paciente-derivadas de Terapia Molecularly Guided alvejado. PLoS ONE 10 (8): e0134346. doi: 10.1371 /journal.pone.0134346

editor: Chandan Kumar-Sinha, da Universidade de Michigan, Estados Unidos

Recebido: 20 Janeiro, 2015; Aceito: 08 de julho de 2015; Publicação: 13 de agosto de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability: Informação sobre todo o cancro da bexiga modelos PDX estão disponíveis no portal JAX PDX organizada pelo mouse Tumor Biology (MTB) de banco de dados (http : //tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxSearch.do)

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por: Veterano Carreira de Desenvolvimento Award Administration (PI:. Pan); Mérito Veteran Administration (PI: Pan; Grant #: 1I01BA001784); Suporte Grant NCI Cancer Center (PI: de Vere Branco; Grant #: 2 P30 CA 0.933.730); A Laney Foundation (PI: de Vere Branco). Não há organismos de financiamento teve qualquer papel na concepção do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer de bexiga está entre os dez tipos de câncer mais comuns [1], no entanto, a maioria pouco estudados e subfinanciadas, [2]. Há dois grupos principais de cancro da bexiga: não myoinvasive e câncer avançado. câncer de bexiga não-myoinvasive (NMIBC) é responsável por 80% dos casos no momento do diagnóstico. Eles são normalmente tratados com ressecção transuretral e, na maioria dos casos, a terapia intravesical. No entanto, aproximadamente 60% dos pacientes se repita em dois anos, e 25% evoluem para estágios avançados [3-5]. É nesses casos 20%, com estágios avançados no momento do diagnóstico e 25% dos casos NMIBC que evoluíram para estágios avançados que são responsáveis ​​pela alta mortalidade de cancro da bexiga. quimioterapia à base de platina altamente tóxico é comumente utilizada no tratamento do cancro avançado da bexiga com uma taxa de resposta de cerca de 50% [6]. Embora as linhas celulares são comumente usados ​​para estudos pré-clínicos, a correlação entre a sensibilidade ao fármaco das linhagens celulares e ensaios clínicos é, em geral, pobre [7]. Até agora, nenhum teste está disponível para identificar quimioterapia eficaz antes da administração da terapia. Se os pacientes são diagnosticados com câncer de bexiga localmente avançado sem metástase, cistectomia radical é geralmente realizada que está associado com a pior qualidade de saúde da vida por causa da cirurgia em si e associadas complicações pós-operatórias [8,9]. Em caso de recorrência da doença ou prognóstico, não existe um padrão de quimioterapia de segunda linha. Não há nenhuma terapia-alvo aprovada por os EUA Food and Drug Administration (FDA), apesar de aberrações genéticas recorrentes foram identificados. Não há nenhuma melhoria significativa na sobrevida global e prognóstico ao longo dos últimos trinta anos [10]. Portanto, há uma necessidade não atendida crítica no cancro da bexiga para seleccionar primeira linha eficaz e salvar a quimioterapia, e desenvolver terapia-alvo.

Este projeto é desenvolver xenotransplantes derivados do paciente (PDXs) para melhorar os resultados do tratamento de bexiga Câncer. Muitos modelos animais são actualmente utilizados na pesquisa do câncer, tais como enxertos de rato desenvolvidos a partir de linhas celulares de cancro e modelos de ratos geneticamente modificados (GEMM). Mesmo que estes modelos têm feito grandes contribuições para a investigação do cancro, eles ficam aquém na satisfação das necessidades individuais específicas do paciente na era da medicina precisão. Evolução recente e convergência da biologia do câncer nos domínios «ómicos”, tecnologias, biologia computacional e desenvolvimento de medicamentos estão a revolucionar terapia-alvo e levando a um novo nível de “terapia-alvo molecularmente guiada (MTT)”, ou seja, combinando terapia-alvo com genética específica para cada paciente aberrações no câncer. No entanto, dois ensaios clínicos recentes mostraram que MTT correspondência contra aberrações genéticas específicas do paciente foi associado com taxas de resposta decepcionantes de 12% e 9%, respectivamente [11,12]. A baixa taxa de resposta de MTT é em parte atribuído ao fato de que a maioria dos cânceres de abrigar várias aberrações genéticas [13-16], e que os atuais tecnologias de biologia computacional são incapazes de distinguir de forma robusta mutações driver (aqueles que são críticos para as funções celulares de cancro) a partir de mutações de passageiros (aqueles que têm pouca importância funcional para células cancerosas). Propusemos que a plataforma PDX específicas do paciente desenvolveu aqui não só pode, potencialmente, ser usado para a tela para o MTT mais eficaz para direcionar os condutores moleculares e de primeira linha eficaz e salvar a quimioterapia, mas também para reaproveitamento de drogas e estudar de mecanismos de resistência secundárias para orientar a terapia ainda mais personalizado e desenvolvimento de medicamentos.

Métodos

desenvolvimento de xenoenxertos de cancro da bexiga derivadas de pacientes

O protocolo para recolher informação e câncer de espécimes clínicos de pacientes foi aprovado pelo da Universidade da Califórnia Davis Institutional Review Board (protocolo n ° 218.204). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da participação neste estudo e antes de quaisquer amostras ou informações clínicas foram coletadas. O protocolo animal foi aprovado pelo Laboratório Jackson (JAX) Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC, protocolo n ° 12027) e da UC Davis IACUC (protocolo n ° 17794).

espécimes clínicos cancro frescos (3 -5mm

3) foram implantados subcutaneamente nos flancos de 4-5 semanas de idade NOD.Cg-

Prkdc

scid

IL2RG

tm1Wjl

/SZJ (aka, NSG) camundongos. Para cada amostra de pacientes, cinco ratos NSG foram implantados e monitorados para o crescimento do tumor por até cinco meses. Um modelo PDX ortotópico foi gerado através de injeção de suspensão única célula de PDXs subcutâneos na parede do rato bexiga.

isolamento do RNA

hematoxilina e eosina foi realizada e as lâminas foram revistos para assegurar que a menos 85-90% das células eram células cancerosas antes da coleta da amostra. O ARN celular total foi isolado a partir de qualquer pedaços de tumor de xenoenxerto de fresco congelado utilizando o kit TRIzol Além disso ARN Purificação (Life Technologies) ou a partir de amostras fixadas com formalina, embebidos em parafina (FFPE) (8 secções x 12 mm) utilizando o Kit de miRNeasy FFPE (Qiagen), de acordo com os protocolos do fabricante. O ARN total foi eluído das colunas em água isenta de nuclease e armazenado a -80 ° C. concentração e pureza RNA foram avaliados com um NanoDrop 2000 Espectrofotômetro (Thermo Scientific) e avaliações de qualidade (

e

.

g

., integridade do RNA) foram feitas usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) . Para miARN perfil de expressão, o ARN celular total (incluindo a fracção de ARN pequeno) foi isolado a partir de FFPE espécimes de cancro da bexiga, utilizando o Kit de miRNeasy FFPE (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.

isolamento do DNA

DNA foi isolado de fresco congelado ou FFPE tumor do paciente e de xenotransplante de amostras (5 seções x 20 mícrons) usando DNA padrão QIAamp ou Kits de tecido QIAamp DNA FFPE (Qiagen).

transcriptoma profiling pela RNA-Sequencing (RNA -Seq)

RNA-Seq preparação biblioteca e sequenciamento.

transcriptoma perfis de P0 (passagem 0) tumores de xenoenxerto de cancro da bexiga foi realizada por análise de RNA-Seq. Sequenciação de ARN (ARN-SEQ) bibliotecas foram preparados a partir de 1 ug do ARN total utilizando o ARN TruSeq Preparação da Amostra V2 Kit (Illumina, San Diego, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o ARNm poli-adenilada foi purificado a partir de ARN total e ARN ribossomal removidos por dois ciclos de ligação a contas magnéticas oligo-dT, seguido por fragmentação do ARN, eluição, e priming por incubação a 94 ° C durante 8 minutos. ADNc de cadeia dupla foi então gerado por síntese de primeira cadeia preparado-aleatória com Superscript II de transcriptase reversa e a subsequente síntese da segunda cadeia com ARNase H e ADN-polimerase I. O cDNA foi dotado de extremos cerses com T4 e ADN-polimerases Klenow para remover o 3 ‘ -overhangs e preencha 5′-saliências, fosforilada com T4 PNK, e em seguida 3’-a cauda de incubação com Klenow Fragment (3’→ 5’exo) e dATP. Ilumina-emparelhado final (PE), os adaptadores foram então ligados indexados, seguido de purificação com contas AMPure XP. A biblioteca foi então enriquecida por alta-fidelidade de amplificação por PCR (15 ciclos) e iniciadores específicos do adaptador. A concentração molar das bibliotecas foi determinada medindo a concentração com um fluorómetro Qubit (Invitrogen), a determinação do comprimento de inserção com um Agilent Bioanalyzer 2100, e, em seguida, quantificação baseia-qPCR (KAPA Biblioteca Quantificação Kit). Bibliotecas foram submetidos ao Genome Center de Nova York para 100 pb emparelhado-end, sequenciamento multiplex em um 2000 sistema de HiSeq sequenciamento (8 bibliotecas por pista; 2 pistas).

análise de dados RNA-Seq

.

O processamento de imagem, chamada base, pontuação de qualidade (Phred) e demultiplexing amostra foram executados por HiSeq software de controle com o real Time Analysis (HCS 1.5 /RTA 1,13) e casava 1,8 software (Illumina, San Diego, CA). Análise de dados de RNA-Seq foi efectuada utilizando um fluxo de trabalho TopHat botão de punho-padrão [17]. Sequência lê (formato FASTQ) foram classificados como humana (enxerto) ou mouse (host) usando Xenome [18] e, posteriormente, alinhado à montagem do genoma humano de referência (fevereiro 2009, GRCh37 /hg19) com TopHat, permitindo um máximo de dois incompatibilidades; TopHat utiliza o alinhador Bowtie [19] e inclui uma ferramenta para junções mapeamento de emenda [20] para o RNA-Seq ler alinhamento com a sequência do genoma humano de referência (GRCh37 /hg19). Gene- e expressão em nível de transcrição foi exaustivamente quantificados com software Abotoaduras [21] para

1)

transcrição montagem,

2)

identificação de variantes de processamento, e 3) quantificação da expressão normalizada como FPKM (fragmentos por quilobases de transcrição por milhão mapeadas lê) valores.

Whole-exome sequenciamento (WES)

Preparação de bibliotecas de sequenciamento exome de captura integrais e sequenciamento.

DNA as amostras foram preparadas para a sequenciação de todo o exome na plataforma Illumina utilizando o SureSelect

XT alvo Sistema de Enriquecimento (Agilent) em conjunto com o SureSelect

XT Humano Todos Exon V4 + UTRs biblioteca de captura. Isto foi realizado de acordo com os protocolos do fabricante e procedeu em 3 passos gerais que começam com a fragmentação do ADN, seguida por preparação da biblioteca, e o enriquecimento alvo para todos os exões e regiões não traduzidas (UTRs). DNA de alto peso molecular (3 g) foi cortado em fragmentos de tamanho médio do pico de 150-200 bp usando um Covaris S220 concentrou-ultrasonicator e depois purificado usando Agencourt AMPure XP esferas magnéticas. Os protocolos padrão foram utilizados para a ligação do adaptador, indexação, de alta fidelidade de amplificação por PCR. Posteriormente, o enriquecimento exome foi realizada por captura híbrida com o Todo Exon v4 biblioteca de captura de + UTRs (789.141 biotinilados, ultra-longas iscas RNA oligômero) para capturar as sequências alvo abrangendo 71MB do genoma e abrangentes de 20,965 genes e 334,378 exons. bibliotecas de captura foram amplificados, agrupados e apresentados ao Genome Center de Nova York para 100 pb emparelhado-end, de sequenciamento multiplex em um sistema de sequenciamento HiSeq de 2000 (4 bibliotecas por pista).

análise de dados WES.

a análise secundária dos dados WES consistiu de alinhamento de leitura para a sequência do genoma de referência (GRCh37 /hg19) usando o Burrows-Wheeler alinhador (BWA) [22] e aplicando o Genome Analysis Toolkit (GATK) [23] para a base recalibração qualidade pontuação, realinhamento INDEL, remoção duplicada, e realizando SNV ea descoberta INDEL e genotipagem em todas as amostras simultaneamente, utilizando parâmetros de filtragem rígido padrão ou índice de qualidade variante recalibração [24]. Antes de alinhamento, lê estavam antes da ocorrência de uma base de baixa qualidade-aparado erro (Phred marcar ≤20). Além disso, para a análise de dados WES derivadas de tecidos de xenoenxerto, bem como dados relativos aos tumores de pacientes utilizados em comparações, Xenome foi utilizado para ler do rato classificação humana /e determinação de níveis de contaminação genómica de rato [18]. estatísticas de desempenho para sequenciamento de última geração e análises subsequentes, incluindo o número total de leituras, mapeamento percentual e humana /leitura do mouse classificação, estão incluídas na Tabela S1 e S2 Table.

Na sequência da aplicação da GATK, variantes foram filtrados para aqueles que confirmaram a presença da mutação somática e /ou sido identificado como uma mutação somática em pelo menos um tumor através da utilização do catálogo completo de mutações somáticas no cancro (cósmica) e The Cancer Genome Atlas (TCGA) bases de dados. De modo a definir ainda mais a probabilidade de uma variante somática previamente confirmado como sendo uma aberração somática nestes tumores PDX, um filtro adicional foi aplicada para seleccionar fracções por alelo variante no intervalo de 10-40% ou 60-90%, sugerindo assim a presença de heterogeneidade do tumor e que a variante foi derivada a partir de uma sub-população do tumor. Ao longo destas linhas, várias variantes com status “inferida somática” satisfeito estes critérios e também foram incluídos nos resultados. Embora estes não correspondem a uma correspondência exacta a COSMIC ou TCGA, filtragem foi realizada com Ingenuity Variant Analysis (Qiagen, Inc.) para

1)

excluir variantes que estão associados com a variação genética humana normal identificados a partir de grande- projetos de seqüenciamento de escala, incluindo o Projeto 1.000 Genomas, Complete Genomics Genomas Pública, NHLBI GO exome sequenciamento do Projeto (ESP), e dbSNP, e 2) para identificar “não-dbSNP” variantes com freqüências alélicas intermediários que seriam característica de variantes presentes em um tumor heterogêneo, em vez de na linha germinativa.

estudo de Eficácia

Este protocolo foi aprovado pelo Institutional animal Care UC Davis e Use Committee (IACUC, Protocolo # 17794) antes do início do estudo. Todos os estudos com animais seguiu as diretrizes IACUC. camundongos NSG feminino com a idade de 4-5 semanas foram encomendados à JAX, e foram dadas pelo menos uma semana para se aclimatar ao novo ambiente antes de entrar no estudo. Para estabelecer múltiplos PDXs para permitir estudos de eficácia com múltiplas drogas, PDXs de passagem 2-4 foram cortados em fragmentos de 3-5 mm

3 e injectada em vários ratos por via subcutânea no flanco ou ortotopicamente na camada muscular da parede da bexiga. Quando os tamanhos de tumores subcutâneos atingiu ~ 200 mm

3, os ratinhos foram tratados com agentes terapêuticos alvo combinado com as alterações genéticas identificados através de sequenciação profundo como descrito acima (Fig S1). As seguintes drogas foram usadas neste estudo: sEphB4-HSA foi desenvolvido através da conjugação de EphB4 solúvel a albumina de soro humano. Ele foi fornecido por Parkash Gill, MD, da Universidade do Sul da Califórnia. Outras drogas, incluindo BGJ398 e BEZ235, foram adquiridos de Selleck Chemicals (Houston, TX). Para cada grupo de tratamento, 8-10 ratinhos foram utilizados para permitir uma análise estatística. Os ratinhos foram monitorizados para o crescimento do tumor e alterações nos parâmetros clínicos, tais como mudanças de peso, eliminação de resíduos, textura da pelagem, cor, manchas de urina, crostas ao redor dos olhos, níveis de atividade, e postura. Os ratinhos foram sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu cinco vezes o tamanho de linha de base (cerca de 1,000 milímetros

3). Vários ratinhos foram sacrificados antes do início do tratamento ou durante o tratamento para determinar a actividade da via de sinalização a jusante, utilizando Western blot, coloração imuno-histoquímica, ou a coloração por imunofluorescência. Os ratinhos foram sacrificados por overdose de pentobarbital (180 mg /kg) ou overdose de pentobarbital (60 mg /kg), seguido por deslocação cervical.

A análise estatística

As experiências foram repetidas, pelo menos em triplicado. A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad InStatTM (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e ANOVA (análise de variância) foi realizado para comparar as diferenças entre os três grupos de tratamento. Todos os resultados foram expressos como a média ± erro padrão, a menos que indicado de outra maneira. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Criação do paciente derivado xenotransplantes (PDX) a partir urothelial carcinoma

Até agora, nós estabelecemos 22 PDXs de. doentes com cancro da bexiga, o que representa 41% dos tumores implantados. Entre estes 22 PDXs, 13 PDXs foram derivadas de cancro da bexiga avançado e 9 PDXs de NMIBC. As características clínicas são mostrados na Tabela 1. A idade mediana dos pacientes era de 74 anos de doadores (gama: 54-83). Cinco dos 13 PDXs derivadas de cancro da bexiga avançado receberam quimioterapia neoadjuvante antes antes da implantação, enquanto nenhum dos NMIBC fez.

Vinte e dois PDXs foram desenvolvidos, incluindo 13 por câncer de bexiga avançado e 9 de cancro da bexiga não-myoinvasive .

fidelidade morfológica entre os tumores de pacientes e enxertos correspondentes

Nós comparamos a morfologia dos tumores da bexiga de pacientes e correspondentes PDXs em diferentes passagens. A fidelidade morfológica foi mantida a partir de amostras tumorais de pacientes através da passagem 6 (Fig 1A). A morfologia do PDXs câncer de bexiga subcutâneos e ortotópicos também foi mantida (Fig 1A painéis da direita). As células cancerosas em PDXs foram coradas positivamente com um anticorpo anti-humano de Ki67, confirmando que as células de cancro foram de facto em PDXs de origem humana. Mais de 90% de células cancerosas da bexiga PDX expresso de Ki67, um marcador de proliferação celular (Fig 1B). Consistente com este achado, o volume do tumor PDX tempo de duplicação foi entre 10-20 dias. Embora PDXs foram desenvolvidos a partir da inoculação de amostras clínicas que incluem células de suporte de estroma humano, sem células estromais em PDXs foram coradas positivamente com um anticorpo anti-vimentina humana, sugerindo que as células estromais em PDXs eram de origem de rato (Fig 1C). Isto é ainda validado pela observação de níveis variáveis ​​de sequência derivadas de ratinho lê presente na sequenciação da próxima geração de dados (NGS) (S2 Tabela). Algumas células humanas de cancro da bexiga e células do estroma nos espécimes clínicos cancro, bem como as células cancerosas em PDXs, foram coradas positivas para vimentina humana. Como estes ratos NSG não têm qualquer assassino natureza linfócitos (NK), T e B, nenhum dos linfócitos, pela morfologia, foi observada em PDXs.

(A) Comparação da morfologia entre as amostras dos pacientes e PDXs, subcutânea e PDXs ortotópicos, de PDX BL0293 e BL0440. Hematoxilina e eosina (H E mancha) mostraram que a morfologia das células foi mantida durante o estabelecimento de PDX e durante passaging em ratos, tanto no local subcutâneo (SC, a passagem 6) e na parede da bexiga ortotópico (na passagem 4) . No entanto, mais células mitóticas foram observadas em PDXs, especialmente na passagem de seis. (B) coloração de Ki67 humano. Ambos os PDXs foram coradas positivamente com anti-Ki67 humano, apoiando que estas células eram PDX na verdade, de origem humana. Em PDX BL0440, mais as células foram coradas positivamente com Ki67 na passagem seis PDX em comparação com a amostra de cancro de bexiga humana, sugerindo mais células estavam em proliferação celular, e este efeito foi consistente com a observação de mais células mitóticas no Grupo A de H coloração de E. (C) A coloração de vimentina humana. Algumas células cancerosas da bexiga humana (painel da esquerda) e de células do estroma (painel do meio) foram coradas positivas para vimentina humana nas amostras dos pacientes. Na amostra de PDX na passagem 0, apenas algumas células de câncer de bexiga foram coradas positivas para vimentina humana, sugerindo que as células estromais em PDX não foram derivados das células estromais humanas.

Conservação de variantes genômicas em tumores P0 PDX

perfil abrangente de aberrações cromossômicas nos PDXs dos primeiros 8 pacientes foi realizada por toda exome seqüenciamento análise (WES) de loci 20.965 gene, abrangendo 334,378 exons e abrangendo 71MB do genoma (Agilent Todos Exon v4 + UTRs biblioteca de captura). Para determinar se PDXs manteve as aberrações genéticas de cancros dos pais de pacientes, resultados WES foram comparados em dois modelos PDX, BL0429 e BL0440, na passagem 0 (P0). Variantes foram filtrados para aqueles que têm uma profundidade de leitura de 20 e que ocorrem com uma frequência de alelos de ≥0.5. Do número total variantes identificadas em BL0429 (n = 15653) e BL0440 (n = 16916) tumores de pacientes, 91,8% e 97,6% destes foram conservadas no tumor P0 (Figura 2). Para mutações somáticas presumidos (

e

g

, nonsynonymous e indels, não encontradas em dbSNP..), Foi observado um alto nível similar de conservação molecular: 92,7% (101 de 109) e 94,4% (135 de 143) das variantes em BL0429 e BL0440, respectivamente (Figura 2). Em resumo, as variações genómicos presentes nos tumores de pacientes com cancro da bexiga foram altamente conservadas nas PDXs. Análise

WES foi realizada em amostras de DNA genómico isolado a partir de tumores de doentes e parentais enxertadas tumores PDX P0. dados WES foi filtrada para as variantes que ocorrem a uma frequência de 0,5 e, em seguida, em comparação entre as amostras com base nos tipos de variantes. O número eo tipo de variantes que ocorrem em cada tumor parental e no tumor P0 PDX foram quantificados e descrito como percentagem de conservação no gráfico. Para todas as variantes, 91,8% e 97,6% foram conservados em BL0429 e BL0440, respectivamente.

Análise de genes funcionalmente ativos conhecidos e genes mutados significativamente

A seguir, avaliou o estado de mutação de conhecidos genes funcionalmente ativos e genes mutados significativamente previamente identificado em grande escala, multi-center análises dos cancros da bexiga [15,25-27], muitos dos quais demonstraram papéis na supressão do tumor, cromatina /dinâmica de cromossomos, regulação da transcrição, e de sinal transdução. Uma vez que os tecidos normais correspondentes não foram incluídos neste estudo, as análises foram dirigida principalmente à identificação de variantes que tenham anteriormente estado confirmado somática em um ou mais tipos de cancro de acordo com a cósmica e /ou bases de dados TCGA. Para os 236 genes considerados, um total de 71 variantes de um único nucleótido não sinónimas (SNVS) levando a missense ou sem sentido foram identificadas mutações em 51 genes diferentes, com diferentes fracções de alelos alternativos que vão 0,160-,982 (Figura 3, Tabela S3 e S4 Mesa). Embora 15 genes foram encontrados para ser alterada em dois ou mais tumores, apenas 5 mutações ocorreram em mais de um modelo de tumor (

ADCY2

p.V147L,

ERBB2

p.I655V,

NCF2

p.H308Q,

SYNE1

p.L885V, e

ZNF814

p.158V). A maioria dos PDXs 3-10 continha mutações somáticas (em 3-10 genes), excepto para PDXs BL0269 BL0293 e que tinha mutações cada 13 em 11 e 13 genes diferentes, respectivamente. Notavelmente, mutações em genes funcionalmente activos foram identificados em cada PDX, incluindo

ARID1A

,

ATM

,

CASP8

,

CDH1

,

KALRN

,

KMT2C

,

NCF2

,

MTOR

,

PIK3CA

,

TSC1

, e

TP53

; 6-10 mutações em genes motorista de cancro da bexiga foram encontrados em 5 de 8 modelos (S4 tabela). Integração de dados de RNA-Seq com estes resultados sugerem que, das 71 mutações encontradas, havia aproximadamente 29 “expresso” mutações em 20 genes (

e

.

g

.,

ARID1A

,

CASP8

,

KLF5

,

MLH1

,

NOTCH1

,

PIK3CA

, e

SYNE2

) que excedeu o corte de baixa abundância transcrição /moderada (

i

.

e

., ≥10 FPKM ou fragmentos por quilobases do exão por milhão de fragmentos mapeados) (S5 tabela).

WES foi realizada em tumores P0 de cada modelo PDX. Subsequentemente, o GATK foi utilizado para a detecção e anotação variante funcional. Os resultados foram filtrados para mutações somáticas que ocorrem em uma lista consolidada de 130 conhecidos de câncer de bexiga genes funcionalmente activos [27] e genes mutados significativamente [15,25,26]; estes casos são indicados no painel do lado direito como

BLCA Driver (IntOGen)

,

TCGA Significativamente mutadas

, ou

BGI Significativamente mutadas

. Mutações somáticas foram encontrados em 51 genes diferentes (indicadas ao longo do lado da mesa) (S3 e S4 Tabela Tabela). O número do modelo PDX é indicado através da parte superior da grelha. Frequências (0,3-1,0) para cada alelo mutante são indicados para cada variante e representado por reforçar a intensidade da cor.

análise mutacional das vias supressores tumorais

Três quartos do cancro da bexiga PDXs aberrações contido em um ou mais dos genes supressores de tumor in

TP53

,

RB1 ​​

, e

CDKN2A

(Figura 4). Especificamente, estes incluíram mutações somáticas de

TP53

(R248Q, R280T, E177 * e E285K) e

RB1 ​​

(R358X), e copiar variantes número de

RB1 ​​

( em BL0293, BL0429, e BL0479) e

CDKN2A

(em BL0269, BL0382, BL0429, e BL0479). A maioria das mutações somáticas TP53 foram heterozigotos (freqüência do alelo = 0,5), com excepção de R280T em BL0479 e E177X truncando mutação no BL0382, o último dos quais foi também acompanhado por uma redução marcada

TP53

níveis de transcrição (Fig 4A e 4B). A diminuição correspondente no

MDM2

expressão foi observada nos tumores BL0293 e BL0479 que contêm mutações R248Q e R280T em

TP53

, respectivamente. Cópia perdas numéricas ou deleções, ocorrendo no

RB1 ​​

e

CDKN2A

loci, foram validados por comparação com os dados de RNA-Seq demonstrando uma quase completa ausência de expressão na maioria dos casos.

(a) análise integrada de

mRNA Expression

,

as mutações

, e

Copy Number

foi realizada por genes no

TP53

e

RB1 ​​

vias supressores de tumor. expressão de nível Gene (FPKM) valores para os genes de membros da via são apresentados e expressão do gene relativo para cada um dos genes ao longo do painel de modelos PDX é indicado pelo mapa de calor (verde = menor do que a mediana, vermelho = maior do que a mediana). Mutações (alterações de aminoácidos) em

TP53

e

RB1 ​​

são indicados. número de cópias do gene são apresentados, e variantes indicado como perdas (

i

e

, .. 2) ou ganhos (

i

e

, . 2) apresentada por tons mais escuros de vermelho e verde, respectivamente. (B) Os níveis de expressão (FPKM) de genes da via supressores de tumor em cada PDX são mostrados no gráfico de barras.

perfis do transcriptoma de tumores PDX

Além dos 20 genes mutantes que estavam encontrado para ter pelo menos um nível mínimo de expressão (

acima

), uma avaliação mais aprofundada de expressão em nível de gene para toda a lista consolidada de genes 236 cancro da bexiga funcionalmente ativos e significativamente mutantes demonstraram que 85-104 destes teve moderada a níveis muito elevados de expressão (FPKM = 15-2,417) em pelo menos uma PDX (Figura a Figura em S2, S6 Tabela). Além disso, vários exibiu universalmente elevada expressão nos modelos PDX, incluindo

AHNAK

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CTNNB1

,

HRAS

,

RHOA

, e

YWHAZ

. Do mesmo modo, a avaliação do condutor 291 de alta confiança (HCD) genes identificados através de análise de pan-cancro de conjuntos de dados TCGA [27], e utilizando os mesmos critérios para análise, conforme descrito acima, demonstraram que 199 genes HCD foram expressas no painel (Figura B em S2 Fig, S7 Tabela). Como uma abordagem para a definição de vias de condução da biologia dos tumores, PDX agrupamento anotação funcional dos genes mais altamente expressos (≥50 FPKM) ao longo do painel de PDXs foi realizada utilizando ferramentas da bioinformática DAVID recursos [28]. Este revelou a participação de várias vias celulares fundamentais e os seus componentes moleculares, incluindo a via da ubiquitina-proteassoma, factores de tradução, e enzimas metabólicas (glicólise, a gluconeogénese, a fosforilação oxidativa). Notavelmente, os genes que regulam negativamente a apoptose também foram significativamente enriquecido (25 genes,

p

= 3,95 X 10

-06), como

DAD1

,

MCL1

,

SOD1

,

TPT1

e YWHAZ, implicando a presença de uma vantagem de sobrevivência generalizada.

plataforma de PDX para orientar molecularmente terapia-alvo

um objetivo importante impulsionando o desenvolvimento destes modelos PDX foi estabelecer uma plataforma para ajudar a identificar a mutação driver correto e sua terapia direcionada correspondido. Com base em todo os dados de sequenciamento exome e transcriptoma, há muitos alvos druggable com inibidores que são aprovados pela FDA ou em ensaios clínicos (Fig 5A) (S7 Mesa, S8 Tabela e S9 tabela). Nós selecionamos um subconjunto desses alvos para informar combinado testes terapia (S1 Fig): receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (

FGFR3

), receptor de tipo ephrin B 4 (

EphB4

), proto-oncogene tirosina-cinase de proteína

Src

, receptor do factor de crescimento epidérmico humano -2 e 3 (

HER2 /3

) e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato-3-quinase, alfa subunidade catalítica (