Abstract

Objectivo

Para determinar os padrões de expressão de reguladores de NF-kB e genes alvo em células claras carcinoma de células renais (ccRCC), sua correlação com von Hippel Lindau (BVS) estado mutacional, e sua associação com os resultados de sobrevivência.

Métodos

as meta-análises foram realizadas na expressão do gene ccRCC publicada conjuntos de dados por RankProd, um método estatístico não paramétrico. Degs com uma falsa Descoberta Taxa de 0,05 por este método foram considerados significativos, e cruzou com uma lista com curadoria de reguladores e metas NF-kB para determinar a natureza e extensão da NF-kB desregulamentação em ccRCC.

Resultados

A altamente fração -disproportionate (~ 40%;

p Art 0,001) de reguladores de NF-kB e genes alvo foram encontrados para ser regulada para cima no ccRCC, indicativo de elevada atividade de NF-kB na esse tipo de câncer. Um subconjunto destes genes, que compreende um regulador chave de NF-kB (

IKBKB

) e mediadores de estabelecidos os-sobrevivência celular e respostas pró-inflamatórias de NF-kB (

MMP9

,

PSMB9

, e

SOD2

), correlacionados com maior risco relativo, pior prognóstico, e reduziu a sobrevida global dos pacientes. Surpreendentemente, os níveis de vários factores reguladores do interferão (IRFs) e genes alvo interferão foram também elevados em ccRCC, indicando que uma “assinatura interferão ‘podem representar uma nova característica desta doença. A perda de expressão do gene de VHL fortemente correlacionada com o aparecimento de assinaturas gene do interferão NF-κB- e em ambos os casos familiares ou esporádicos de ccRCC. Como NF-kB controla a expressão de nós principais interferon sinalização, nossos resultados sugerem uma relação causal entre a perda BVS, elevada actividade de NF-kB, e o aparecimento de uma assinatura de interferon durante ccRCC tumorigênese.

Conclusões

Estes resultados identificam a NF-kB e assinaturas de interferão como as características clínicas da ccRCC, fornecem forte razão para a incorporação de inibidores do NF-kB e /ou e a exploração da sinalização interferon no tratamento de ccRCC, e fornecer novos alvos de NF-kB para o potencial intervenção terapêutica nesta doença maligna atualmente incurável

Citation:. Peri S, Devarajan K, Yang DH, Knudson AG, Balachandran S (2013) Meta-análise identifica NF-kB como um alvo terapêutico no cancro renal . PLoS ONE 8 (10): e76746. doi: 10.1371 /journal.pone.0076746

editor: Edward W. Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de julho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 07 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Peri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por uma sociedade da Cancer Research Scholar Grant americano (RSG-09-195-01-MPC) para SB. Fundos adicionais foram fornecidos pelo Centro de Câncer Fox Chase através do apoio institucional do Programa Keystone cancro do rim, e pelo NIH concede N01 CN-95037 e P30 CA 06927. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinomas de células renais conta (RCC) para cerca de 3% de todos os cânceres de adultos, e causar ~ 116.000 mortes anuais em todo o mundo [1]. Vários sub-tipos histológicos de RCC foram descritas, incluindo cromófobo, papilar e célula clara, de que a variante de células claras (ccRCC) é responsável por ~ 85% de todos os casos de RCC [2,3]. Early-stage ccRCC é geralmente curável por cirurgia, e os pacientes diagnosticados com massas renais localizadas de 4 cm. tem excelente prognóstico [4]. ccRCC é, no entanto, em grande parte, uma doença assintomática, e aproximadamente um terço de todos os pacientes com cancro presentes localmente avançado ou metastizado no momento do diagnóstico. Em contraste com ccRCC em estágio inicial localizada, ccRCC avançada é a quimioterapia resistente ao câncer letal, [1,5].

ccRCC avançada é tratada principalmente por pequenas moléculas abordagens farmacológicas. opções de primeira linha incluem a tirosina quinase inibidores sunitinib e sorafenib, eo mTOR inibidores temsirolimus e everolimus. Estes agentes, no entanto, apenas fornecem benefícios a curto prazo ao atrasar a progressão da doença, e não são curativos [6-8]. Além disso, esses agentes exigem a administração contínua, expondo os pacientes a efeitos colaterais significativos [7,9]. O tratamento de carcinoma de células renais metastático é, por conseguinte, ainda um desafio terapêutico em necessidade de novas opções

.

A marca genética de ccRCC é inativação do gene von Hippel Lindau (VHL) supressor de tumores [10]. O

gene VHL é inactivado por mutação ou hipermetilação em até 90% dos casos esporádicos ccRCC [10-12]. Em seu best-descreveu o papel, pVHL, o produto da

gene VHL

, funções como parte de uma degradação E3 complexo ubiquitina ligase que controla rigidamente os níveis de proteína de hipóxia inducible factor (HIF), um fator de transcrição e mestre regulador da resposta celular à hipoxia [11,13]. Quando pvhl está ausente, HIF acumula mesmo sob condições de normóxia e de forma inadequada transactiva a expressão dos seus genes-alvo. Tantos alvos HIF são potencialmente tumorigénico, mis-expressão de genes alvo de HIF são considerados os orchestrators primárias de

BVS

progressão tumoral ccRCC -deficient, e as vias destinadas a jusante da HIF (por exemplo, sinalização VEGF) representa uma abordagem farmacológica primária para o tratamento de carcinoma de células renais [11].

Além de regular o HIF, pvhl tem sido demonstrado em vários estudos de cultura de células para controlar igualmente a actividade do factor de transcrição NF-kB [14]. Quando a expressão pVHL está perdido (ou ablação por RNAi), atividade de NF-kB é elevada; Por outro lado, re-introdução de pVHL em

BVS

células RCC -null reduz a atividade de NF-kB [15-17]. Estas observações têm implicações clínicas importantes. Em primeiro lugar, como o NF-kB (como HIF) é um regulador central de respostas inflamatórias e de células-sobrevivência, é muito provável que níveis elevados de sinalização de NF-kB após perda pvhl irá contribuir para etapas na génese, progressão, a sobrevivência e /ou propagação do ccRCC. Segundo, se NF-kB é, de facto elevados em tumores ccRCC – e não apenas em linhas de células RCC – então alvo de NF-kB fornece uma nova opção terapêutica interessante para ccRCC avançado. A este respeito, estudos iniciais demonstraram que a inibição de pequena molécula de NF-kB sensibiliza células ccRCC resistentes a outra forma de (1) a actividade tumoricida de inibidores de EGFR, (2) a apoptose pela citocina TRAIL anti-tumoral, e (3) oncólise por vírus da encefalomiocardite [14,18-21]. Por estas razões, a obtenção de insights sobre a natureza e extensão da NF-kB de-regulação em tumores ccRCC torna-se um objectivo importante.

Iniciamos este estudo para determinar através de bioinformática em larga escala se aproxima da prevalência de NF-kB desregulamentação transcriptomic em amostras ccRCC derivado do paciente. A partir dessas análises, descobrimos que NF-kB parece ser constitutivamente ativa em uma alta porcentagem de casos ccRCC, e que um número desproporcional de reguladores e metas NF-kB (a ccRCC “assinatura NF-kB ‘) Exibição consistentemente elevados de expressão em ccRCC, comparativamente ao tecido renal normal. Outras investigações revelaram também a presença de uma “assinatura de interferão (IFN) ‘robusta em ccRCC. Mostra-se que a aparência de ambas as assinaturas de NF-kB e IFN está bem correlacionada com o estado mutacional de VHL, e identificar um subconjunto chave dos reguladores e dos alvos cuja expressão elevada se correlaciona com maior risco relativo de NF-kB, pior prognóstico, e reduzida global sobrevivência no ccRCC. Colectivamente, estes resultados indicam que a elevada sinalização de NF-kB e IFN pode representar características comuns de ccRCC pVHL-negativos, e fornecer justificativa para a segmentação de NF-kB nesta doença.

Materiais e Métodos

ética declaração

o uso de amostras de tecidos humanos de pacientes no Fox Chase Cancer Center foi aprovado pela Fox, Chase Institutional Review Board. consentimento informado por escrito, aprovado pela comissão de ética, foi obtido para o uso dessas amostras.

Imunohistoquímica

Um microarray tecido renal (TMA), contendo fatias duplicadas de 20 tumores ccRCC e 8 normais rins, foi construído a partir de formalina de arquivo fixo, amostras de pacientes e embebidas em parafina Fox Chase Cancer Center. TMA secções de tecido foram cortadas com uma espessura de 5 microns, desparafinadas por xileno e re-hidratadas em reduzir a concentração de etanol. A recuperação de antígenos foi atingida por secções de ebulição em tampão de citrato 10 mM durante 20 minutos. Após o bloqueio da peroxidase endógena com 3% de peroxidase de hidrogénio em metanol, as secções foram incubadas com fundo atirador (Biocare Médico) à temperatura ambiente durante 30 minutos. As secções foram em seguida incubadas com anticorpos primários, NF-kB (Cell Signaling) na diluição de 1: 500, e STAT1 (BD Biosciences) a uma diluição de 1: 100, a 4 ° C durante a noite. Após lavagem em PBS, as secções foram incubadas com Labeled Polymer-HRP anti-coelho e o anticorpo secundário anti-ratinho (DAKO) a TA durante 1 h, expostas a diaminobenzidina solução tetracloridrato, e contrastadas com hematoxilina. Após desidratação em concentrações crescentes de etanol e limpando em xileno, as secções foram montadas em Permount. As imagens foram tiradas em um microscópio Nikon Eclipse E600 com o software NIS Elements D3.0.

Meta-análise

Para meta-análises, nós compilamos uma lista de estudos RCC publicados de expressão Gene Omnibus ( GEO) ou ArrayExpress (Tabela S1), cujos dados foram (i) gerado usando Affymetrix U133A plataformas, U133B e U133Plus2; (Ii) anotada com precisão quando depositadas em bases de dados; e (iii) continha os controlos de tecido normal. Para estudos que empregam os chips U133A e U133B, só consideramos os que perfilado amostras em

ambos

fritas; este maximizou o número de genes disponíveis para subsequente meta-análise. Os dados brutos foram normalizados utilizando Robust Multi-gama média (RMA) [22]. Nos casos em que as amostras foram perfiladas em duas plataformas diferentes (por exemplo Affymetrix U133A e U133B), sonda define com maior média de valores de expressão foram selecionados se vários conjuntos de sondas mapeadas para mesmo gene. Os conjuntos de dados foram incorporadas com base no símbolo do gene usando o pacote MergeMaid (https://astor.som.jhmi.edu/MergeMaid) disponível através Bioconductor [23]. As meta-análises foram realizadas utilizando o método RankProd [24], um método estatístico não paramétrico, que utlilzes fileiras de genes diferencialmente expressos (degs) entre os diferentes estudos para gerar uma lista de degs entre duas condições (por exemplo, ccRCC vs normal). O significado do diferencial gene-expressão é então calculado com base no percentual de previsões de falsos positivos (isto é, o Falso taxa de detecção, ou FDR). Para este estudo, foram selecionados nossas listas de degs com base em um FDR de 0,05 (5%) calculado com base em 10.000 permutações. Para definir as assinaturas de NF-kB e IFN, com curadoria de NF-kB e genes IFN foram cruzaram com degs up-regulamentados. Para examinar assinaturas NF-kB e IFN em amostras com inativação mono ou bialélico de

BVS

, degs foram calculados utilizando limma [25] e os dados RMA-normalizados. Nossa metodologia é resumida no fluxograma apresentado na Figura S1

A análise de sobrevida

A expressão gênica e dados de sobrevivência disponível para 55 pacientes ccRCC no banco de dados TCGA (https:. //tcga-data.nci .nih.gov /TCGA /) foi utilizado para análise de sobrevivência utilizando perigos univariadas proporcional de Cox (PH) e modelos acelerado Falha Time (AFT) [26]. Um teste goodness-of-fit (GOF) do modelo PH Cox foi realizada [27]. Enquanto o modelo PH Cox assume implicitamente que as curvas de perigo e sobrevivência correspondentes a dois valores diferentes de uma co-variável não se cruzam, o modelo AFT permite cruzamento de curvas [28,29] e é responsável por não proporcionalidade dos riscos (ou risco de morte ) nos dois grupos. Todos os testes foram em frente e verso e usou um erro tipo I de 0,05 para determinar a significância estatística. Além do

P

-Valores para cada modelo de encaixe, as estimativas de risco relativo (RR) do PH Cox e coeficiente (β) a partir dos modelos de popa, respectivamente, foram utilizados para determinar a magnitude da associação entre a expressão do gene e sobrevida global. Uma estimativa RR em excesso de um ou de uma estimativa negativa β indicam mau prognóstico com o aumento da expressão. Para visualizar a associação dos níveis de expressão de genes com a sobrevida global, perfis de expressão de genes individuais foram dicotomizados pela divisão mediana em grupos de expressão ‘alto’ ou ‘baixa’, e curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados para cada grupo. Cálculos foram feitos usando os pacotes

sobrevivência

e

LSS

na R linguagem estatística e meio ambiente (https://www.r-project.org).

Resultados

Meta-análise identifica NF-kB desregulamentação em ccRCC

Ao examinar um conjunto de dados de DNA microarray publicamente disponíveis de ccRCC e amostras normais emparelhados [30,31], notamos que vários mRNAs do gene alvo NF-kB estabelecidos foram sobre-expressos em amostras ccRCC, comparados aos seus controles normais. Dadas as ramificações terapêuticas destas observações, procurou-se determinar se NF-kB é constitutivamente ativo na ccRCC. Estudámos, portanto, espécimes ccRCC derivadas de pacientes para a localização nuclear do clássico NF-kB sub-unidade RelA /p65. Nós focada em RelA /p65, como estudos anteriores mostraram que RelA contendo complexos diméricos são a forma dominante de NF-kB em linhas celulares ccRCC, e que estes complexos re-localizar a partir do citoplasma para o núcleo quando activa [32-34 ]. Dos 20 espécimes ccRCC distintas analisados, 16 (80%) apresentaram coloração nuclear robusta de RelA em 50% das células, indicativas da actividade constitutiva do NF-kB nestas células. Outros dois casos mostraram uma coloração nuclear fraco em 20% das células, e os outros dois não manifestou nenhum sinal detectável RelA no núcleo. Em contraste, nenhum (0/8) das secções renais normais examinados apresentada RelA coloração nuclear detectável. Um exemplo típico de uma intensa coloração nuclear RelA ccRCC em – mas não tecido renal normal – é mostrado na Figura 1a; note que as células normais do epitélio tubular proximal, a partir do qual ccRCC é pensado para ocorrer, mostram evidências de

citoplasmática RelA (Figura 1a, setas). Estes resultados sugerem que constitutivamente activo nuclear de NF-kB pode ser uma característica comum em ccRCC, talvez como uma consequência da activação do NF-kB em epitélio tubular durante RCC tumorigénese.

(A) Imuno-histoquimica que mostra a coloração sinal proeminente RelA nuclear em amostras ccRCC, mas não em tecido de rim normal. A seta indica a coloração RelA citoplasmática em células do epitélio tubular proximal. Barra de escala = 100 uM. (B) Até regulamentados genes (eixo X) da meta-análise dos quatro conjuntos de dados ccRCC foram plotados contra a taxa de falso-descoberta (FDR, eixo Y). -Regulada genes com FDR 0,05, mostrado em vermelho, foram usadas para definir a NF-kB e IFN assinaturas. (C) mc_ui_heatmap que mostra a expressão de genes de assinatura do NF-kB em cada um dos quatro estudos indicados. N = normal, T = tumor. níveis de calor bar = expressão (log

2 escala).

Para investigar o grau de NF-kB desregulamentação gene-alvo na ccRCC, primeiro definiu uma lista de genes cuja expressão é conhecida por regular e /ou ser regulado pelo NF-kB. Raciocínio que aberrante atividade NF-kB será refletido na expressão alterada desses genes, combinamos uma lista disponível publicamente da anotados genes alvo NF-kB [(HUhttp: //bioinfolifl.fr/NF-KBUH, baseada principalmente na [ ,,,0],35]] com os nossos próprios conjuntos de dados [36,37] para reunir um total de 137 genes (Tabela S2) que são conhecidos para regular NF-kB, cujos promotores contêm sítios de ligação putativos /validado NF-kB, e /ou cuja expressão possui foi demonstrado que contar com a atividade de NF-kB em vários contextos.

a seguir examinado por meta-análise dos perfis de expressão desses 137 genes alvo NF-kB em dados transcriptomic todo o genoma de 61 ccRCC e 34 amostras normais em quatro estudos independentes que nos referimos aqui pelos nomes de seus primeiros autores:.. Cifola, Gumz, Lenburg e Yusenko [31,38-40] Critérios para seleção desses estudos estão resumidos na Figura S1 por esta meta-análise, usamos RankProd, um método estatístico não paramétrico capaz não só de integração de dados a partir de uma variedade de plataformas, mas também a manipulação de variabilidade experimental entre conjuntos de dados [24]. De ~ 18.000 genes total examinada, 3560 foram encontrados para ser uniformemente sobre-regulada em ccRCC (Figura 1b), enquanto que os genes foram consistentemente 2,797 regulada para baixo, a uma taxa de falsos descoberta (FDR) de ≤ 0,05. Destes, 58 genes (~ 42% de toda a curadoria alvos NF-kB) foram regulados positivamente em amostras ccRCC, em comparação com controles normais. A proporção de genes NF-kB-se regulamentados no ccRCC (58/137) é altamente significativa, (

p

-valor proporção de 0,001, uma cauda

Z

-teste), quando em comparação com a percentagem de todos os genes regulados positivamente em ccRCC (3560/17997; ~ 20%). Por outro lado, três vezes menos genes alvo NF-kB (18 genes, o que representa 13% das metas de NF-kB) foram regulados negativamente em ccRCC; verificou-se não ser significativa (p = 0,74). Os resultados desta análise indicam que as amostras de ccRCC exibir expressão selectiva, uniformemente elevado de um subconjunto de genes alvo de NF-kB. Nós designar esses genes a ccRCC ‘NF-kB assinatura genética “. A Figura 1C representa os perfis da assinatura do gene de NF-kB em cada um dos quatro estudos de expressão

O gene assinatura ccRCC NF-kB foi classificáveis ​​em quatro categorias distintas:. Pró-inflamatória, célula-a sobrevivência, o NF- reguladores kB, e, surpreendentemente, os reguladores de interferão (Tabela S3). A maioria dos alvos de NF-kB foram supra-regulados pró-inflamatória (43/58). Dos genes restantes, sete estavam envolvidos na sobrevivência da célula, e cinco foram alimentá-forward ou reguladores feed-back da própria resposta NF-kB. Inesperadamente, três alvos NF-kB (

IRF1, IRF2

, e

IRF7

) consistentemente sobre-regulada em todos os espécimes ccRCC fatores regulatórios interferão codificado (IRFS), uma família de fatores de transcrição tipicamente associados com a resposta inata-imune mediada por interferão a infecções microbianas [41]. perfis de expressão de dois genes individuais representativos de cada categoria são apresentados na Figura 2. Estes resultados identificam dentro da assinatura ccRCC NF-kB vários mediadores bem conhecidos das respostas pró-inflamatórias e célula-sobrevivência de NF-kB, assim como uma inesperada subconjunto de reguladores de IFN.

(a) genes Cell-de sobrevivência

BCL2

e

SOD2

, (b) genes pró-inflamatórios

CCL5

e

ICAM1

, (c) reguladores de NF-kB

NFKB1

e

TNFAIP3 Comprar e fatores regulatórios (d) interferão

IRF1

e

IRF7

. Os dados foram normalizados utilizando RMA. Dobrável mudanças para Tumor (T) versus normal (N) de comparação foram obtidos por limma. Eixo Y mostra o nível de expressão RMA-normalizado (no log

2 escala) de cada mRNA. As caixas azuis representam os níveis de expressão de genes no tecido normal, eo vermelho representa a expressão em ccRCC. A linha branca dentro de cada caixa é a mediana, e a distância entre a caixa e bigodes indicam intervalos interquartil. Cada um dos quatro gráficos por gene representam perfis de expressão em matrizes geradas por (da esquerda para a direita) os estudos Cifola, Gumz, Lenburg e Yusenko.

Uma assinatura interferon em ccRCC

Intrigado com a observação de que os genes que codificam IRF-foram regulados positivamente em ccRCC, a hipótese de que, além de elevada atividade de NF-kB, as células ccRCC exibição provável aumento tipo tónico I (α /β) de sinalização de IFN. Três observações publicadas fundamentam esta hipótese. Em primeiro lugar, os genes que codificam IRFs 1,2, e 7, para além de ser alvos do NF-kB, também são bem descritos genes de IFN-estimulada (ISGs) [42,43]. Em segundo lugar, a maioria das células manter baixos níveis de tipo I autócrino de sinalização de IFN (/β α), ostensivamente em preparação para infecções virais agudas [44-46]. Em terceiro lugar, temos anteriormente relatado que constitutiva de sinalização de NF-kB é necessário para a manutenção de sinalização de IFN autócrino [36,44]. Juntas, estas observações nos permitem propor um modelo no qual elevou NF-kB sinalização ‘rampas até “tipo tónico I IFN sinalização, que então aumenta a expressão de ISGs (como

IRFs

) em ccRCC.

para testar este modelo, examinaram amostras de RCC para o tipo tónico hiperativo I IFN sinalização. Como medida direta do tipo tónico I IFN níveis no tecido infectado é desafiador e não confiável [36], que, em vez examinada uma consequência jusante do IFN activa: localização nuclear do fator de transcrição IFN-responsiva chave STAT1. Como a própria NF-kB, STAT1 é normalmente citoplasmática quando inativo, mas rapidamente transloca para o núcleo para dirigir a expressão ISG com a estimulação IFN [47]. Se a sinalização de IFN é constitutivamente elevada em carcinoma de células renais, o STAT1 será esperado que se localizam no núcleo em RCC – mas não é normal – tecido. Descobrimos que 16/20 amostras de RCC, mas nenhum dos espécimes renais normais (0/8) – exibido forte STAT1 coloração nuclear (Figura 3a). Notavelmente, e de acordo com um nexo de causalidade entre a elevação de sinalização NF-kB e aumento da atividade tônica IFN, totalmente 100% das amostras ccRCC Rela-positivos nucleares também foram positivos para STAT1 nuclear.

(a) Imuno-histoquímica mostrando coloração nuclear de STAT1 sinal robusto em amostras ccRCC, mas não em tecido de rim normal. (B) Mapa de calor que mostra a expressão de genes de assinatura IFN após a estimulação de IFN de fibroblastos de embrião de ratinho. Calor bar = fold-change (log

escala 2). Os níveis de expressão de células não tratadas foram arbitrariamente definida como 1 (bege). (C) mc_ui_heatmap que mostra a expressão dos genes IFN assinatura em cada uma das quatro estudos indicados. N = normal, T = tumor. níveis de calor bar = expressão (log

2 escala).

Foram identificados a partir de nosso trabalho anterior [36] um total de ~ 400 genes que são induzidos pelo menos duas vezes por IFNs do tipo I (Figura 3b), para o qual os dados de expressão também estavam presentes nos quatro estudos ccRCC. Quando se analisou a expressão destes ISGs em conjuntos de dados ccRCC, um total de 164 ISGs foram encontrados para ser regulada para cima em ccRCC (~ 40% de todos os ISGs testados, valor de p 0,001 por unicaudal proporção Z-teste) , enquanto que apenas 51 ISGs foram regulados [~ 13%, valor de p = 0,94]. Estes resultados indicam que, como com o tipo de NF-kB, I constitutivamente elevado IFN sinalização ocorre em ccRCC. O 164-gene “assinatura gene de IFN ‘está listada na Tabela S4, e o seu perfil de expressão em cada um dos quatro estudos individuais é mostrado na Figura 3c.

próxima utilizada análise Ingenuity Acesso para a construção de uma rede que identificar relações inter-moleculares entre assinaturas de gene IFN NF-kB e. Esta análise revelou ligação forte entre as assinaturas de IFN NF-kB e através de IFN-β (codificada por

IFNB1

) e gânglios IRF (Figura 4). Como era de esperar, pró-inflamatória e célula-aglomerados de sobrevivência foram observadas no interior do braço de NF-kB da rede, enquanto numerosos mediadores bem estabelecidos inata-imunes foram representados no braço assinatura IFN (Figura 4). Tomados em conjunto, estes resultados suportam um nexo de causalidade entre o NF-kB e IFN assinaturas mediadas por sinalização de IFN /IRF autócrina

A rede foi construída por software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, HUhttp:. //Www. ingenuity.comUH), utilizando todos os genes nas assinaturas de NF-kB e IFN. Importantes Clusters em NF-kB (marrom) e IFN (azul) braços são identificados e moléculas reguladoras que controlam nós gene-rede são mostrados como grandes círculos.

estado mutacional BVS se correlaciona com a expressão de NF- kB e IFN assinaturas

os resultados dos estudos de cultura celular sugerem um nexo de causalidade entre a ausência de proteína pVHL funcional e elevada atividade de NF-kB na ccRCC [15-17]. Tendo em conta estas observações, indagado se o estado mutacional de

BVS correlacionada com o aparecimento de NF-kB e IFN assinaturas em ccRCC. Para esta análise, foram comparados a seus respectivos controles normais (1) culturas de células epiteliais de lesões renais pré-neoplásicas de seis casos familiares de pacientes VHL abrigando uma cópia funcional do

BVS

[48], (2) ccRCC tecidos de 32 casos familiares de biallelically-inativado

BVS

[49], e (3) tecido ccRCC de 20 casos esporádicos de biallelically-inativado

BVS

[49]. Descobrimos que nem assinaturas de NF-kB nem IFN estavam presentes em pacientes com uma cópia funcional do

BVS

. Em contraste, as amostras ancorando ccRCC perda bialélico de VHL (seja familiar esporádica ou de origem) exibido expressão robusta de ambas as assinaturas de NF-kB e de IFN (Figura 5). Estes dados fornecem um forte apoio à ideia de que BVS inativação é provável relação causal com a aparência de elevada atividade de NF-kB e IFN no ccRCC.

Heatmaps mostrando dobrável mudanças nos níveis de genes assinatura NF-kB de expressão ( a) ou IFN genes de assinatura (B) entre VHL +/- amostras de casos de doença de VHL familiar em comparação com

BVS + /+ epitélio renal normal (coluna 1); BVS – /- casos de ccRCC familiar comparativamente ao tecido renal normal (coluna 2); ou BVS – /- casos de ccRCC esporádica em comparação ao tecido renal normal (coluna 3). bar Calor = fold-change (log

escala 2).

expressão elevada de subconjunto de metas de NF-kB correlacionam com pior desempenho em ccRCC pacientes

Para determinar se o aumento da atividade de NF-kB foi associada com os resultados de sobrevivência pobres em ccRCC, examinamos a correlação entre a expressão de genes em nossa assinatura NF-kB e sobrevida global para pacientes 55 ccRCC cuja expressão gênica e sobrevivência de dados estavam disponíveis em The Cancer Genome Atlas (TCGA) . A partir desta análise, verificou-se que a expressão elevada de quatro reguladores de NF-kB e genes-alvo (

IKBKB

,

MMP9, PSMB9

, e

SOD2

) foi significativamente associada com maior em relação ao risco (RR), pior prognóstico, e reduziu a sobrevida global paciente pelo modelo PH Cox (

p

-valor 0,05, RR 1) ou pelo modelo AFT (

p

-valor 0,05 ou coeficiente β 0; ver Métodos). Estes quatro genes compreendem um regulador chave do NF-kB em si sinalização (

IKBKB

) e mediadores estabelecidos das respostas da célula para a sobrevivência de NF-kB e pró-inflamatórios (

MMP9, PSMB9

, e

SOD2

), levantando a possibilidade emocionante que visam seletivamente membros deste subconjunto terá benefício clínico em ccRCC. A Figura 6 apresenta as curvas de Kaplan-Meier para estes genes e S5 Tabela resume os resultados dessas análises.

curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para os genes na assinatura de NF-kB cuja aumentou os niveis de expressão significativamente correlacionada com a sobrevivência global mais pobre resultados são mostrados. perfis de expressão de genes individuais foram dicotomizados pela divisão mediana em “alta” (azul) grupos de expressão “baixos” (vermelho) ou. nomes de genes são indicadas por cima de cada gráfico. Por favor, consulte a Tabela S5 para

p

-Valores.

De nota, a expressão aumentada de um quinto gene (

NFKB1

, que codifica a sub-unidade de NF-kB p105 /p50) também foi significativamente associada à sobrevida global mais pobre pelo modelo AFT (

p

-valor = 0,041). No entanto, um coeficiente de valor positivo β (33,6) e ausência de significância pelo modelo Cox PH (valor-p = 0,41, RR = 0,5) nos impedido de esclarecer sua associação com a progressão ccRCC, razão pela qual nós nos concentramos em

IKBKB

,

MMP9, PSMB9

, e

SOD2

.

Discussão

neste estudo, nós determinamos que o NF-kB é constitutivamente activo na maioria das amostras de ccRCC testados e mostraram por meta-análise que os reguladores-chave e alvos de NF-kB são uniformemente sobre-regulada em quatro estudos independentes. Nós também relatam a descoberta de uma assinatura de IFN em ccRCC, e fornecem evidências convincentes de que a perda da função de VHL é necessário para ambas as assinaturas de NF-kB e IFN. Finalmente, nós identificamos um subconjunto dos reguladores e alvos potencialmente-druggable NF-kB cuja expressão elevada correlaciona-se com mau prognóstico e sobrevivência. De nota, a indisponibilidade de dados dos pacientes nos impedido de examinar se o /ou assinaturas IFN correlacionadas com ccRCC fase /série NF-kB e.

Apesar de sobrevivência NF-kB mediada por sinalização provavelmente evoluiu para proteger as células de fluxo mitocondrial inerente a respostas fisiológicas normais (por exemplo, durante as respostas anti-microbianas impulsionado por citocinas), diversas observações tornam plausível que a resposta de sobrevivência celular NF-kB foi usurpado pelas células tumorais para promover a sua própria viabilidade. Por exemplo, o membro fundador da família NF-kB – o gene retroviral aviária

v-Rel viajantes – é um

bona fide

oncogenes e genes que codificam subunidades NF-kB e componentes de sinalização de exibição activação de mutações em vários tumores [revisto em [50-52]]. alvos de sobrevivência celular de NF-kB codificam enzimas antioxidantes que protegem as mitocôndrias durante os tempos de aumento da procura bioenergética, bem como outras proteínas (tais como os membros da família Bcl-2, Bcl-X

L e Bfl-1) que impedem activamente as mitocôndrias de induzir a morte celular durante genotóxico e metabólica salienta inerente ao processo de tumorigénese [51,52].

Perda de pvhl foi mostrado para resultar num aumento da actividade de NF-kB, indicando que a activação de NF-kB pode representam uma consequência comum a jusante de

BVS

-deficiência [15-17,33]. Os laboratórios Kaelin e Rettig forneceram uma visão mecanicista em resultados de deficiência como pVHL em aumento da atividade de NF-kB por elucidar duas vias distintas de regulação de NF-kB pVHL-dependente. Kaelin e colaboradores identificaram o activador de NF-kB CARD9 como uma proteína que interactua com pvhl, e demonstraram que a fosforilação pvhl promovido inibidora de CARD9 pela cinase CK2. A ablação de expressão aumentada pvhl CARD9-impulsionado a actividade de NF-kB, ao mesmo tempo que suprime normalizada actividade de NF-kB expressão CARD9 em configurações RCC pvhl deficientes em [17]. Em paralelo, e Rettig Um determinado que a perda de pvhl, através de um loop autócrino HIF → EGFR, resulta no aumento da actividade de NF-kB em ccRCC [16]. Ambos os mecanismos conectar deficiência pVHL a elevada atividade de NF-kB e fornecer explicações bioquímicos para nossa observação de que intensificada NF-kB correlaciona-se bem com o estado mutacional BVS.

Um resultado inesperado deste estudo foi a descoberta de que uma assinatura de IFN caracteriza ccRCC. A explicação mais simples para essa assinatura é que é a consequência directa da elevada atividade de NF-kB. Nós favorecer esta explicação para as razões que (1) os genes que codificam os nós principais do sistema de IFN, incluindo o IFN-β e IRF-7, conter locais funcionais de NF-kB nos seus promotores [53,54], e a activação de NF-kB simples kB pode dirigir estes promotores [43,54]; (2) uma mistura 1: 1 de correlação foi encontrada entre as amostras que continham ccRCC nuclear de NF-kB e aqueles que exibida STAT1 activado, e (3) o assinatura IFN desaba em células a que falta a RelA subunidade de NF-kB (Figura 7a).