Sumário

O CDK /RB /E2F pathway é normalmente interrompida no cancro do pulmão, e deste modo, prevê-se que o bloqueio da via de E2F teria um potencial terapêutico. Para testar esta hipótese, examinámos a actividade de HLM006474 (um inibidor de pequena molécula pan-E2F) em linhas celulares de cancro de pulmão, como um agente único ou em combinação com outros compostos. HLM006474 reduz a viabilidade de ambas as linhas SCLC NSCLC e com um biológica IC

50 que varia entre 15 e 75 uM, mas com nenhuma diferença significativa entre os grupos. Combinação de HLM006474 com cisplatina e gemcitabina demonstram pouca sinergia; No entanto, HLM006474 sinergiza com paclitaxel. Surpreendentemente, descobrimos que o tratamento breve de células com HLM006474 levou a um aumento dos níveis de proteína E2F3 (devido à des-repressão destes sítios promotor). Uma vez que a sensibilidade de paclitaxel tem sido demonstrado que se correlacionam com os níveis de E2F3, a hipótese de que a sinergia HLM006474 com paclitaxel pode ser mediada por indução transiente de E2F3. Para testar isto, as células H1299 foram esgotadas de E2F3a e E2F3b com siRNA e tratada com paclitaxel. Os ensaios de proliferação revelaram que ambos os siRNAs reduziu significativamente a sensibilidade de paclitaxel, tal como esperado. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que HLM006474 pode ter eficácia no cancro do pulmão e pode ser útil em combinação com taxanos

Citation:. Kurtyka CA, Chen L, Cress WD (2014) E2F Inibição synergizes com Paclitaxel no câncer de pulmão Linhas de celular. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10.1371 /journal.pone.0096357

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de dezembro de 2013; Aceito: 04 de abril de 2014; Publicado em: 15 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kurtyka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um subsídio do Instituto Nacional do Câncer (CA119997), o Programa de Bankhead Coley Cancer Research do Departamento de Saúde da Flórida (FDH 08BB-05) e Moffitt Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. WDC é um inventor na patente US 8202886 B2 realizada pela University of South Florida. Caso contrário, os autores não têm qualquer conflito de interesses. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A proteína do retinoblastoma (comumente chamado Rb) é amplamente reconhecido como um dos supressores de tumor mais importantes em humanos. Junto com os semelhantes “bolso” proteínas p107 e p130, que é responsável pela regulação da progressão do ciclo celular [1]. A família Rb regula ciclo celular através da ligação e inibição da actividade de transcrição dos primeiros 2 factores (E2F) e a sua actividade supressora de tumor é fortemente relacionada com esta função de [2]. Quando fosforilado (tipicamente por CDK 2, 4 e 6 em G1), Rb torna-se inactivada, libertando assim E2F e permitindo a progressão do ciclo celular [3]. A fim de evitar a entrada do ciclo celular aberrante, tais como inibidores de CDK CDKN2A (vulgarmente conhecida como p16) evitar as CDK fosforilar a partir de células Rb e força a permanecer no G1 [4].

Dependendo contexto, os membros da família E2F pode servem como ativadores de transcrição que impulsionam a progressão do ciclo celular ou repressores de transcrição que restringem a progressão do ciclo celular [5]. Como activadores, E2F são reconhecidos como sendo importantes na proliferação através da sua activação da transcrição de genes em fase S. E2F ativar a transcrição através de associação com histona acetiltransferase (HAT) atividade [6], [7]. Tal como repressores, E2F inibir a transcrição de genes utilizados na entrada da fase S através da ligação aos seus promotores e reprimindo a transcrição através da sua capacidade para se ligar a Rb e outras proteínas de bolso, que por sua vez recrutam modificadores de cromatina, tais como histona-desacetilases (HDAC) [6] – [8]. De todos os membros da família E2F, E2F3 é a única necessária para a proliferação celular individualmente para ocorrer [9] – [13]. E2F3 é importante para a transcrição de vários genes para a entrada na fase S e tem sido demonstrado que têm funções na transcrição de genes necessários para G2 fases /m (tal como a quinase Aurora A [14], CDC2 [15], e ciclina B1 [15], [16]). Existem duas isoformas E2F3, E2F3a e E2F3b, cada um, resultando em transcrição de dois promotores diferentes. E2F3b níveis permanecem constantes durante todo o ciclo celular, enquanto que os níveis E2F3a variar e alcançar níveis de expressão de pico por volta da transição G1 /S [17] – [19]. estudos knockout mouse revelam que E2F3a e E2F3b são geralmente compensatória para o outro [20], [21], mas a eliminação de ambas as isoformas é letal [9], [20]. Finalmente, E2F3 é mais altamente expresso em vários tipos de cancro (ver [5] para uma revisão), incluindo pulmão [22] ea sua actividade tem sido correlacionada com o aumento da sensibilidade ao tratamento taxano em cancros do ovário [23] e câncer de mama ER-negativo [ ,,,0],24].

a /Rb /via E2F CDK é interrompido em praticamente todos os casos de câncer de pulmão humano, a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [25]. No cancro do pulmão de pequenas células (SCLC), o que representa cerca de 15% dos cancros do pulmão, o mecanismo mais comum de perturbação via Rb é mutação da proteína Rb-se. De facto, aproximadamente 90% dos cancros do pulmão de células pequenas não possuem uma proteína Rb funcional [26], [27]. Em contraste, no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), contas de mutação Rb para 15-30% destes cancros [26], [28], e a desregulação de CDK /RB /E2F pathway ocorre mais vulgarmente através do silenciamento p16 inibidor de CDK [29] – [32]. Na maioria dos casos de NSCLC onde o

gene RB1

está intacta, inibidores de CDK4 e 6 representariam uma forma potencial de alvejar esta via. Esta hipótese foi examinada em vários ensaios clínicos e os resultados preliminares do câncer de mama são muito promissores [33] – [35]., Sugerindo que /inibidores da via E2F CDK /Rb pode ter um papel importante a desempenhar no tratamento de vários cancros

o benefício de inibidores de CDK podem ser limitadas a tumores em que a proteína Rb permanece WT e funcional, e assim, os reagentes que possa visar esta via a jusante do Rb pode ser útil em cancros em que Rb é normalmente uma mutação (tal como câncer de pulmão). Para testar esta hipótese, examinamos a atividade de HLM006474 contra um painel de linhas celulares de cancro do pulmão. HLM006474 (também discutida aqui como 6474) é uma pequena molécula pan-inibidor de E2F-ligação de ADN [36]. Embora o IC

50 de HLM006474 é relativamente alta (30 uM), que é usado como uma ferramenta de composto [37] – [40].

In vivo

estudos indicam que os efeitos do tratamento de 6474 em diferentes linhas celulares incluíam uma redução na proliferação celular e um aumento da apoptose e invasão reduzida em um sistema de cultura de tecidos modelo tridimensional [36]. HLM006474 pode ser útil na prevenção de cancro, conduzindo a um aumento da apoptose e diminuição da proliferação de células estaminais embrionárias humanas tumorigénicas [39], bem como levando a uma diminuição na formação de tumores nos embriões de ratos propensos a retinoblastoma [40]. Juntos, estes resultados sugerem que a interferência com a actividade de E2F usando moléculas pequenas podem ter aplicação clínica na terapia do cancro. No presente trabalho, nós fornecemos uma caracterização mais completa do 6474 no contexto do câncer de pulmão. HLM006474 reduz a viabilidade de uma ampla variedade de linhas celulares com uma biológica IC

50 que varia entre 15 e 75 uM. Combinação de HLM006474 com agentes quimioterapêuticos comuns cisplatina e gemcitabina demonstra pouca sinergia; No entanto, HLM006474 sinergiza com paclitaxel. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que HLM006474 podem ter eficácia contra cancros em que E2F é desregulados e podem ser úteis em combinação com outras drogas que têm como alvo os componentes do ciclo celular.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e compostos químicos

linhas celulares de cancro de pulmão foram obtidas a partir de ATCC ou originadores e foram fornecidos pelo SPORE Moffitt em Câncer de pulmão instalação de celular do núcleo. Todas as linhas são autenticados por genotipagem e mantido livre de

Mycoplasma

. linhas de células SCLC foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% FBS e 1% de pen /strep. linhas celulares de NSCLC foram cultivadas em RPMI 1640 com FBS a 10% sem antibióticos. HLM006474 foi sintetizado e validado pelo Moffitt Chemistry Core como anteriormente descrito [36]. Gemcitabina (Gemzar, Eli Lilly) foi adquirida através do Moffitt Farmácia e dissolvido em água. A cisplatina e paclitaxel foram adquiridos à Sigma e soluções stock concentradas foram preparadas em sulfóxido de dimetilo.

siRNA knockdown

As células plaqueadas a -50% de confluência em placas de 6 poços foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Vida Technologies) de acordo com as instruções do fornecedor com 200 pmol de qualquer siGENOME não-segmentação siRNA # 2 (Dharmacon) ou siRNA segmentação E2F3a ou E2F3b como descrito em um artigo de Hurst

et al

[41]. As células foram colhidas quatro horas após a transfecção para ensaio de viabilidade celular (tal como descrito abaixo). As restantes células foram re-plaqueadas e colhidas para análise de Western blot de 24 horas após a transfecção.

ensaios de viabilidade

A actividade antiproliferativa dos compostos e suas combinações foi avaliada usando um high-throughput CellTiter-Azul ensaio de viabilidade celular (Promega), como previamente descrito [42]. Para os ensaios, 1000 células em 24 ul foram plaqueadas em placas de 384 poços e incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO

2. No dia seguinte, as drogas foram diluídas em meio e 6 uL destas diluições aos poços apropriados usando uma estação de pipetagem automatizado. Quatro cavidades replicadas foram usadas para cada concentração de fármaco. As células foram incubadas com o fármaco durante 120 horas, momento em que, adicionou-se 5 ul de reagente CellTiter-Blue (Promega Corp., Madison, WI). A viabilidade celular foi avaliada pela capacidade dos restantes células tratadas para bioreduce resazurina a resorufina (579 nm, Ex /Em 584 nm). A fluorescência foi lida com um leitor de microplacas Synergy HT (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC

50s foram determinadas usando um modelo sigmoidal de regressão equilíbrio utilizando XLfit versão 4.3.2 (ID Business Solutions Ltd.) e é definida como a concentração de fármaco necessária para uma redução de 50% no crescimento /viabilidade. Para 3- (-2-ilo 4,5-dimetiltiazol) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) ensaios de viabilidade celular, adicionou-se CellTiter 96 Aqueous One Solution da Promega de acordo com as instruções do fornecedor para células durante 2 horas a seguir ao tratamento com a droga na dose notada durante 72 horas. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

índices de combinação

O IC

50 valores obtidos a partir de ensaios de viabilidade celular fármaco único foi utilizada para desenhar experiências de combinação. Para 6474 combinações com cisplatina, gemcitabina e paclitaxel essas proporções foram de 1:01, 500:1 e 4000:1, respectivamente. Para as experiências de combinação de fármacos, os ensaios de viabilidade celular foram realizados e os resultados analisados ​​quanto sinérgico, aditivo, ou efeitos antagonistas usando o método de índice de combinação (IC) desenvolvido por Chou e Talalay [43]. Combinação índices IC 1, IC = 1, e CI 1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente

Anticorpos e blotting

borrões Western Western foram realizados como previamente descrito [36. ], [44], [45]. Em resumo, os lisados ​​celulares totais foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF. A detecção das proteínas foi realizada usando anticorpos secundários-peroxidase de rábano conjugada e quimioluminescência aumentada (ECL) de Amersham ou compraram Thermo Scientific. Vários anticorpos utilizados foram E2F1 (C-20, SC-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, SC-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), e monoclonal β-actina (clone AC -15, gato não: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS foi utilizado para quantificar as leituras de intensidade banda de Western blot diretamente de filmes expostos usando a imagem do filme digitalizado invertido rectangular Marquee Tool /histograma e. Este mesmo quadrado foi utilizada para todas as leituras de banda, a fim de assegurar que a mesma área foi analisada para cada banda. As leituras foram, em seguida, ajustado para ter em conta a actina e de fundo e arbitrariamente normalizadas para a linha celular H23 (atribuído um valor de 1).

Real-time polymerase chain reaction

O ARN foi colhido a partir de células utilizando o kit RNeasy da Qiagen mini-. Reverso da reacção em cadeia da polimerase de transcrição (por PCR) foi então realizada utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad). Este ADNc foi então utilizado em PCR em tempo real usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) ou Perfecta SYBR Green SuperMix (Quanta Biosciences, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, tubulina, MCM2, Mcm10, CCNE2 e GAPDH primers foram encomendados à Integrated DNA Technologies. As sequências dos iniciadores são como se segue: E2F1 F (5′-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 ‘), E2F1 R (5′-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3′), E2F3a /b F (5’-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 ‘), E2F3a /b R (5 ‘-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3′), E2F4 F (5’-CTGAAGAGTGTGAGTGGTC -3 ‘), E2F4 R (5′-GCAGAGGTGGAGGTGTAG -3′), tubulina F (5’-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3 ‘), tubulina R (5’ TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 ‘), MCM2 F (5′-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3′), MCM2 R (5’-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 ‘), Mcm10 F (5′-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3′), Mcm10 R (5’-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 ‘), CCNE2 F (5′-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3′), CCNE2 R (5’-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 ‘), GAPDH F (5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′), e GAPDH R (5’-3-TTGATTTTGGAGGGATCTCG ‘).

a análise estatística

para a análise de PCR em tempo real para o experimento ponto de tempo, a diferença entre a expressão de cada gene experimental (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2 e Mcm10) e expressão do gene de controlo (tubulina) foi calculada para cada linha de células em cada ponto de tempo. A diferença entre cada um dos não-0 pontos tempo hora eo tempo leituras pontuais 0 hora para cada gene em cada linha celular foi calculada usando t-testes com correção de Welch. Os paclitaxel IC

50 anos foram log-transformados para melhorar a normalidade. A correlação de mRNA E2F3 e expressão de proteína com log paclitaxel IC

50 anos foi calculada pelo coeficiente de correlação de Pearson. Wilcoxon testes de soma classificação foram usadas para explorar a diferença da viabilidade das células no tratamento siRNA controle ou com E2F3a ou tratamento E2F3b siRNA.

Resultados

HLM006474 tem ampla atividade antiproliferativa

para examinar o potencial de 6474 para o tratamento de cancro do pulmão, determinou-se a IC 6474

50 sub em dezassete linhas celulares de cancro de pulmão (Tabela 1). Esta análise incluiu oito não-pequenas linhas de câncer de pulmão de células (NSCLC) e nove linhas de cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). Neste ensaio de viabilidade, as células foram plaqueadas a baixa densidade no dia zero e foram cultivadas na presença de várias concentrações de 6474 durante cinco dias. Após cinco dias, a viabilidade relativa das células foi determinada por coloração com CT-Blue (Promega). Os resultados revelam que os IC 6474

50 sub varia de -15 a -75? M através das linhas de células de dezassete. O IC biológica média

50 de todas as linhas de células foi de 31,4 (6,1) ^ M, o que é essencialmente idêntico ao IC bioquímica

50 de 29,8 (± 7,6 uM, previamente relatada [36]. Não houve estatisticamente diferença significativa entre SCLC e NSCLC.

tratamentos curtos com chumbo HLM006474 ao aumento da expressão de vários genes conhecidos E2F-regulados

Como um componente da nossa análise de HLM006474, examinamos a expressão de membros da família E2F após o tratamento por transferência de Western. linhas celulares de NSCLC H292 e H1299 foram tratadas com 60? M HLM006474 para 0, 3, 6, 9, 12, e 24 horas e analisadas por transferência de Western (Figura 1 a). Surpreendentemente, as proteínas níveis de ambas as isoformas b e E2F3a aumento nos pontos de tempo iniciais (tipicamente cerca de 6-9 horas). os níveis de proteína E2F1 aumentou mais modestamente após o tratamento, atingindo um máximo entre 6 e 12 horas e retornando aos níveis da linha de base após 24 horas. em real análise de PCR em tempo com a tubulina como um controlo, níveis de ARNm E2F3 aumentou significativamente após 3 horas de tratamento e, em seguida, diminuiu em cada um subsequente ponto de tempo (Figura 1B), enquanto os níveis de expressão de ARNm de E2F1 foram significativamente aumentados após tempos de tratamento curtos em H292 sozinho (Figura 1C ) e os níveis de E2F4 permaneceu constante ou diminuída em cada ponto de tempo (Figura 1D). Foi também observou que alguns genes comumente regulados por E2F; Mcm10 (Figura 1E), MCM2 (Figura 1F), e CCNE2 (Figura 1G); foram mais altamente expresso em pontos de tempo iniciais de um modo comparável às alterações observadas na expressão de mRNA de E2F3. Os resultados mostrados na Figura 1 sugerem que o tratamento com um inibidor de ligação pode resultar na activação de E2F-regulados alvos, incluindo os membros da família auto-regulado E2F-ADN de E2F. A família E2F é conhecido para reprimir activamente a transcrição [46] – [49], e portanto, propõe-se que o tratamento com HLM006474 pode deslocar complexos E2F-repressores e, assim, activar a transcrição de E2F-regular os genes que são predominantemente reprimidos por complexos de E2F. Para explorar esta possibilidade, usamos siRNA especificamente contra E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 e Rb para esgotar duas linhas de células NSCLC de vários complexos de E2F. Microarray foi realizado para examinar o efeito destes ARNic sobre a expressão de uma assinatura de E2F anteriormente definido com base em E2F3 superexpressão [50]. Os resultados, que serão publicados em outro lugar, demonstram que a depleção dos resultados E2F individuais em muitos genes assinatura E2F sendo ativado, como seria de esperar de um modelo de-repressão.

A

. As linhas celulares de NSCLC H292 e H1299 foram tratadas com 60? M HLM006474 para 0, 3, 6, 9, 12, e 24 horas, depois colhidas e analisadas através de Western blot. aumentos modestos na E2F1 e mais dramáticos aumentos na E2F3a e níveis de proteína B foram observados no ponto de tempo no início de ambas as linhas celulares.

B-D

. ARNm foi colhido a partir de células que foram tratados tal como descrito no 1A, convertido em ADNc utilizando RT-PCR e analisadas para os níveis de expressão E3F3 (

B

), E2F1 (

C

), e E2F4 (

D

) usando PCR em tempo real e tubulina como controlo. tratamentos curtos com 6474 níveis alterados de expressão de ARNm de E2F3 e E2F1, E2F4, mas não.

E-G.

Expressão de ARNm de genes bem conhecidos comumente regulados por E2F foram analisadas de uma forma semelhante à descrição anterior em 1B-D. Os níveis de expressão de Mcm10 (

E

), MCM2 (

F

) e CCNE2 (

G) mRNA foram analisados ​​com a tubulina como controlo e foram todos anotados para ser mais altamente expressa seguinte tratamentos curtos com 6474. Notas: ns representa não significativo, * representa p 0,05, ** representa p . 0,01

HLM006474 synergizes com paclitaxel

Tendo estabelecido que 6474 tem efeitos anti-proliferativa em linhagens de células de câncer de pulmão , mas pode influenciar genes E2F-regulados de maneira complexa, procurou-se determinar se 6474 seria sinergia com medicamentos quimioterápicos comumente utilizados no tratamento de câncer de pulmão. células H1299 foram tratados apenas com 6474 e em combinação com cisplatina, gemcitabina e paclitaxel. Combinações foram escolhidos com base no IC

50 das células para os compostos individuais e índices de combinação foram calculados [43]. A Figura 2 revela que não há antagonismo entre 6474 e cisplatina (2A painel, CI média 1,40) e gemcitabina (painel 2B, CI média 1,39). Em contraste, 6474 synergizes fracamente com paclitaxel (2C painel, CI média 0,98). Para explorar ainda mais a natureza da sinergia entre 6474 e paclitaxel, H1299 células foram tratadas com doses baixas de cada fármaco isoladamente ou em combinação e utilizados na análise de transferência de Western. O aparecimento de PARP clivada em células tratadas com a combinação de drogas confirma que a combinação de 6474 e o paclitaxel induz mais a apoptose que qualquer fármaco sozinho (Figura 2D). Para explorar se essa sinergia seria observado em linhas celulares adicionais, nós também examinou a linha de células NSCLC H292. Tal como no caso de células H1299, 6474 em sinergia com paclitaxel (painel 2G, CI média de 0,96), mas não mostrou sinergia com cisplatina (2E painel, CI médio 1,51) ou gemcitabina (painel 2F, CI médio 1,46).

a-C.

H1299 células foram submetidas a ensaios de viabilidade na presença de 6,474 (HLM) combinado com cisplatina (

Um

, CisPt), a gemcitabina (

B

, Gem) e paclitaxel (

C

, Pac), como indicado (ver métodos). Os resultados revelam uma sinergia com paclitaxel (CI média de 0,98) e antagonismo com cisplatina e gemcitabina (CI média 1,40 e 1,39, respectivamente).

D

. Western blotting revela que em células H1299 tratadas durante 72 horas com 20? M 6474 sozinho, 5 nM de paclitaxel isoladamente, ou a combinação dos dois, 6474 e paclitaxel sinergia na indução da clivagem de PARP.

E Restaurant –

G

. As células H292 foram testados em ensaios de viabilidade semelhantes para determinar a eficácia de 6474 (HLM) combinado com cisplatina (

E

, CisPt), a gemcitabina (

F

, Gem) e paclitaxel (

G

, Pac). Como visto em células H1299, 6474 synergizes com paclitaxel (CI média 0,96), mas é antagônica com cisplatina (CI média 1,51) e gemcitabina (CI média 1,46).

níveis E2F3 sensibilidade impacto ao paclitaxel

as observações de que um inibidor de E2F pode sinergizar com o paclitaxel e o aumento nos níveis anteriormente discutido E2F3 seguintes tratamentos ponto de tempo iniciais com HLM006474 sugeriu que a actividade de E2F3 pode desempenhar um papel na sensibilidade paclitaxel. PCR em Tempo Real foi utilizado para analisar a expressão endógena de E2F3 (com GAPDH que serve como controlo interno), e em seguida, estes valores foram correlacionados com a lógica de paclitaxel

50 de cada linha celular (Figura 3A). Os lisados ​​de dez linhas celulares de NSCLC foram corridos em transferências de Western (Figura 3B) e analisados ​​densitometricamente usando β-actina como controlo. Estes níveis de E2F foram então plotados contra a lógica paclitaxel correspondente

50 valores (Figura 3C). Em ambos a-PCR em tempo real e análises de Western blot, uma forte correlação inversa entre E2F3 e paclitaxel IC

50 foi observado. Para testar esta hipótese mais formalmente, utilizou-se ARNsi para destruir as células H1299 de E2F3a e E2F3b e, em seguida determinada a sua sensibilidade ao paclitaxel tal como medido em ensaios de MTS. Western blotting revela um knockdown quase completa dos E2F-alvo, em que as células H1299 (Figura 4A). Controle siRNAs não afetou a expressão E2F. Como esperado, Fig 4B revela que as células com diminuição dos níveis E2F3 eram menos sensíveis ao paclitaxel.

A

. cDNA a partir de dez linhas celulares de NSCLC foram utilizados em PCR em tempo real para detectar os níveis de expressão endógenos E2F3 (em comparação com GAPDH como um controlo). Os níveis de expressão foram então comparadas com a lógica paclitaxel

50 de cada linha e gráficos como mostrado.

B

. Lisados ​​de dez linhagens de células NSCLC foram preparados e correu em um Western blot para detectar níveis E2F3 endógenos.

C

. Densitometricamente valores dos níveis de expressão de proteína analisado (em comparação com beta-actina como um controlo) foram então representados graficamente contra a lógica paclitaxel

50 para cada linha, como mostrado.

A

. células H1299 foram transientemente transfectadas com 200 pmol de controlo, E2F3a, ou E2F3b siRNA e colhido após 24 horas. Western blot destes lisados ​​demonstrar a extensão da E2F knockdown.

B

. Os ensaios de MTS foram usadas para determinar a sensibilidade de cada linha de células a 50 nM de paclitaxel. As células com níveis diminuídos E2F3 eram mais viável na presença de paclitaxel do que as células de controlo. Notas: * representa p 0,05, ** representa p 0,01

Conclusões

O CDK /Rb /via E2F representa um bom alvo para o tratamento de vários tumores sólidos.. Embora o desenvolvimento tem sido lento devido à toxicidade de compostos iniciais, os inibidores de CDK estão começando a ganhar força em ensaios clínicos [33], [51], [52]. Propomos que a segmentação do CDK /Rb /via E2F ainda mais a jusante, a nível E2F, também pode ser de valor. Assim, nós examinamos o potencial de um inibidor pan-E2F, HLM006474, no tratamento de câncer de pulmão.

Propomos o modelo na Figura 5 para explicar os nossos resultados. Em primeiro lugar, observa-se que o tratamento com 6474 conduz a um aumento transitório das proteínas não só E2F3 e os níveis de expressão de ARNm, mas também um aumento em muitos outros transcritos de E2F-regulados. Estas observações são contra-intuitivo razoável baseada na observação de que há muito conhecida E2F são repressores activos de transcrição [46] – [49]; no entanto, eles levantam preocupações de que a inibição complexo pan-E2F podem ter consequências indesejadas. Assim, os futuros compostos E2F-alvo deve bloquear selectivamente a transcrição ativando complexos E2F e transcrição de reposição reprimindo complexos E2F. Em segundo lugar, acreditamos que os níveis aumentados de E2F3 (e provavelmente outros genes E2F-regulados) aumentam a sensibilidade das células ao paclitaxel. Baseamos esta conclusão sobre a correlação observada entre os níveis E2F3 normais e sensibilidade paclitaxel, bem como os resultados das experiências E2F3 siRNA. Este documenta a primeira ligação entre os níveis de paclitaxel e E2F3 em NSCLC, embora uma relação entre níveis elevados de actividade E2F3 e aumento da sensibilidade ao paclitaxel foi anteriormente observado em ovário [23] e ER-negativo cancro da mama [24]. O mecanismo pelo qual gera E2F3 sensibilidade ao paclitaxel é desconhecido. Uma possibilidade é que estejam directamente relacionadas com o papel da E2F3 no ciclo celular. Por exemplo, em células com elevados níveis de E2F3, seria de esperar que as células que proliferam mais, dando, assim, as células uma maior oportunidade de entrar na fase M (em que o paclitaxel seria mais eficaz). No entanto, só esta explicação sugere que essas células devem ser mais sensíveis a gemcitabina, bem como devido à entrada na fase S com mais frequência. Pode ser mais provável que a maior sensibilidade ao paclitaxel é devido aos genes reguladoras da apoptose tornando-se altamente expressa em função do aumento da E2F3. Além disso, tem sido previamente observado que a sobre-expressão de E2F3 leva a um enriquecimento de genes que são [23] relacionada-microtúbulos, de modo que este poderia talvez explicar as correlações entre os níveis vemos E2F3 e sensibilidade paclitaxel. Do mesmo modo, tal como mencionado anteriormente, E2F3 foi observado a ter um papel na fase G2 /M do ponto de verificação através da sua regulação da expressão de Aurora cinase A [14], CDC2 [15], e ciclina B1 [15], [16], que também pode apontar para os níveis mais elevados de E2F3 conduzindo a um aumento nas células que entram nessa fase do ciclo celular e, talvez, em seguida, aumentando a sensibilidade paclitaxel.

nas células não tratadas, E2F /parceiro de dimerização (DP) /complexos de Rb predominam, e, assim, os níveis de E2F3 são relativamente baixo (bem como muitos outros genes E2F-regulada). O tratamento com HLM006474 perturba os complexos de E2F /DP /Rb repressivas de ligação de ADN, resultando em aumento da transcrição de E2F3 (bem como muitos outros genes E2F-reguladas). Neste modelo, os níveis elevados de E2F3 sensibilizar as células para o tratamento de taxano, como demonstrado previamente, através de um mecanismo desconhecido.

Demonstrámos que HLM006474 é eficaz em linhas celulares de cancro de pulmão. Além disso, mostrámos que 6474 synergizes bem com paclitaxel, potencialmente devido a efeitos sobre os níveis de 6474 E2F3. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a potente activador específico de E2F inibição pode ser útil no tratamento de NSCLC no futuro (especialmente em combinação com outros agentes), e que os níveis de E2F3 pode ser um bom preditor da sensibilidade paclitaxel em NSCLC.

Reconhecimentos

os muitos presentes generosos de reagentes são reconhecidos nos Materiais e Métodos.

Dr. Fumi Kinose de SPORE do Moffitt em Câncer de Pulmão instalação de celular básicos fornecidos validado linhas celulares, incluindo aqueles gentilmente doados pelo laboratório de John D. Minna na Universidade do Texas Southwestern, em Dallas. Dr. Dung-Tsa Chen e Jimmy Fulp de Moffitt Bioestatística Núcleo realizada análise estatística. Drs. Christopher L. Cubitt e Shumin Zhang de Moffitt Experimental Therapeutics Núcleo realizados ensaios de viabilidade e análise de dados.