Abstract
Fundo
cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é um tumor maligno recalcitrante com propriedades biológicas distintas. terapia alvo do anticorpo foi investigado ativamente como uma nova modalidade de drogas.
Métodos
Foi testada a expressão de IGF-1R e calculados a sobrevivência em 61 pacientes SCLC. Também foram avaliados os efeitos anti-tumorais de anticorpo monoclonal anti-IGF-1R Figitumumab (CP) sobre SCLC, e tentou duas combinações de drogas para melhorar a terapia CP.
Resultados
Nossos dados clínicos sugeriram que a alta expressão de IGF-1R foi correlacionada com a sobrevivência do paciente SCLC baixa. Em seguida, demonstraram o efeito da CP foi provavelmente através de IGF-1R bloqueio e para baixo-regulação sem IGF-1R auto-fosforilação e PI3K activação /AKT. No entanto, observou-se elevada MEK activação /ERK após tratamento CP em células SCLC, e esta ativação /ERK MEK foi reforçada por knockdown ß-arrestin1 enquanto atenuada pelo knockdown ß-arrestina2. Encontramos ambos inibidor MEK /ERK e metformina poderia melhorar o tratamento CP em células SCLC. Nós ainda ilustrado o efeito aditivo de metformina foi provavelmente através de uma maior promoção da IGF-1R para baixo-regulação.
Conclusão
Os nossos resultados destacou o potencial da terapia-1R anti-IGF e da estratégia de terapia adjuvante quer com MEK inibidor /ERK ou metformina para direcionar SCLC, garantindo novos estudos
Citation:. Cao H, Dong W, Shen H, Xu J, Zhu L, Liu Q, et al. (2015) Combinacional Therapy aumenta os efeitos de anti-IGF-1R mAb Figitumumab para direcionar pequenas células do câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (8): e0135844. doi: 10.1371 /journal.pone.0135844
editor: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, United States |
Recebido: 29 Abril, 2015; Aceito: 27 de julho de 2015; Publicação: 19 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Cao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. o trabalho foi financiado pelo Provincial da Ciência e Tecnologia Planejamento do Desenvolvimento de Shandong (2012GG0021836 e 2014WS0342), National Natural Science Foundation da China (81.301.728), Projeto de Key of Natural Science Foundation de Shandong província (ZR2013HZ001), e do Fundo de Shandong Provincial Natural Science (ZR2014HQ073). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é um tumor maligno recalcitrante com alta recorrência e baixa taxa de sobrevivência de cinco anos sob quimioterapia convencional e radioterapia [1]. O tratamento de SCLC é difícil, devido à sua taxa de crescimento rápida e o desenvolvimento de resistência ao fármaco durante o curso da doença. CPPC possui algumas alterações moleculares e celulares distintas que levam a sua patogenia, incluindo mutações /deleções de alguns supressores de tumor, activação de vários oncogenes, actividades anormais de algumas vias de desenvolvimento, e a sobre-regulação de certas tirosina-cinases receptoras (RTK) [2] . Por causa das únicas características biológicas /patológicos da SCLC, em busca de nova terapia-alvo é de alta prioridade. Como uma modalidade de drogas em rápida expansão, drogas de anticorpos contra RTKs foram activamente investigados para o tratamento de SCLC, e receptor do factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R) é um de tais alvos potenciais RTK [3-7].
IGF-1R e os seus ligandos são geralmente expressos em níveis aumentados em CPPC, e são relatados para correlacionar com prognóstico pobre [8,9]. Há uma evidência preliminar de que a via de sinalização do IGF-1R desempenha um papel crucial na mitogénese, anti-apoptose, transformação maligna e eventos metastáticos [10,11]. IGF-1R é agora considerada como um alvo atractivo para o tratamento do cancro e existem alguns ensaios clínicos em curso de teste as drogas de IGF-1R-direcionados. Figitumumab (CP-751, 871, CP), um anticorpo monoclonal anti-IGF-IR humano (mAb), se provou ter efeitos anti-proliferação e anti-tumorigenicidade em células cancerosas e ratinhos xenoenxertados, e tem se mostrado eficazes em combinação com outros agentes citotóxicos para segmentar muitos tipos de cancro [12-14]. CP foi investigada em um ensaio clínico de Fase II em combinação com etoposídeo e cisplatina como tratamento de primeira linha para extensa SCLC fase (NCT00977561). No entanto, este julgamento foi encerrado prematuramente em 2011 devido à inscrição lenta dos pacientes. Para incentivar o resumo do ensaio clínico, o mecanismo molecular de como a CP tem como alvo SCLC é necessário. Além disso, a combinação de CP com outros fármacos para aumentar a sua eficácia também é crucial para convencer os pacientes a se inscrever em ensaios clínicos.
A metformina, uma droga anti-diabética amplamente utilizado derivado de lilás francês, tem ação restrição calórica em metabolismo celular. Recentemente metformina está emergindo como um agente anti-cancro do candidato. evidência de acumulação sugeriu que a metformina tem efeitos anti-câncer em leucêmica, cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão e outros tumores sólidos, embora seus mecanismos precisos continuam por resolver [15-20].
As células malignas geralmente têm maior taxa de absorção de glicose e aumento da glicólise para cumprir sua exigência metabólica de síntese de proteína rápida e proliferação celular. Infelizmente, a hiperglicemia é relatado para ser um dos acontecimentos adversos mais altamente ocorreram em ensaios clínicos de terapia anti-IGF-1R o mAb, que podem beneficiar do crescimento de células tumorais e reduzir a eficácia do fármaco [21]. Uma vez que a metformina tem tanto efeitos anti-cancro e hipo-glicémico, torna-se um candidato promissor em combinação com anti-IGF-1R Acsm para segmentar SCLC.
Em adição ao uso potencial de metformina, um outro grupo que demonstrou inibição das /ERK vias de sinalização MEK promovido os efeitos da CP em carcinoma esofágico [22]. inibidores de MEK /ERK foram usados sozinhos ou combinados com outras drogas para o tratamento de vários cancros, tais como sensibilizantes radioterapia e /ou melhorar a quimioterapia. Combinando Selumetinib (AZD6244), um /inibidor de MEK1 2, com agentes quimioterapêuticos convencionais melhoraram a sua eficácia para atingir diferentes xenoenxertos de tumores [23]. Em um modelo de NSCLC, a utilização de Selumetinib resultou numa diminuição da expressão de VEGF /activação, e MEK de acoplamento e os inibidores de VEGFR ainda inibido a angiogénese tumoral, crescimento, metástase e [24]. Além disso, a combinação de OSI-906 (um IGF-1R /inibidor de insulina) com MEK 1/2 inibidores (U0126 e selumetinib) mostrou efeitos anti-proliferativos sinérgicos para direccionar células do cancro colo-rectal [25]. Dado o seu sucesso em vários tipos de câncer, vale a pena investigar se os inibidores MEK /ERK poderia melhorar a terapia à base de CP em SCLC.
Aqui, nós investigamos os mecanismos moleculares dos efeitos antitumorais de CP no CPPC e demonstrou que combinando CP com /U0126 inibidor MEK ERK ou metformina poderia aumentar os efeitos terapêuticos da CP para direcionar SCLC.
Materiais e Métodos
pacientes e espécimes
O presente estudo foi realizado de forma retrospectiva em pacientes consecutivos com SCLC primário que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica entre janeiro de 2007 e dezembro de 2010, em Shandong Hospital Provincial. Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Shandong Hospital Provincial, e consentimento informado por escrito foi dado pelos participantes. Os critérios de elegibilidade incluíram diagnóstico histológico de SCLC, a ressecção cirúrgica da lesão primária e nenhuma quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Os pacientes que morreram dentro de um mês após a cirurgia, ou com margem cirúrgica positiva foram excluídos. Finalmente, foram obtidas 61 amostras de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina de arquivamento.
O estadiamento foi determinada com base na classificação 7ª edição tumor-nódulo-metástase (TNM) para câncer de pulmão [26]. foi recolhida a informação a seguir, incluindo idade, sexo, tabagismo, localização do tumor, o tamanho do tumor, patológicas e estágio TNM. Todos os pacientes foram tratados de acordo com a National Comprehensive Cancer Network (NCCN) orientações. Os pacientes foram acompanhados a cada 3 meses a 1 ano após a cirurgia, a cada 6 meses para 3 anos, e anualmente nos anos seguintes.
O primeiro ponto final foi a sobrevida global (OS), definido como o tempo de operação para o data da morte, a data perdidos para follow-up ou a data do último acompanhamento. O segundo ponto final foi a sobrevida específica da doença (DSS), e falha foi definida como morte por câncer de pulmão ou complicações relacionadas com o tratamento. ponto final adicional incluído sobrevida livre de doença (DFS), definido como o intervalo de tempo entre a data da ressecção definitiva e detecção de primeira recorrência da doença, metástases, ou a data do último follow-up.
imuno-histoquímica (IHC) Análise de amostras tumorais
a imuno-histoquímica (IHQ) para o IGF-1R e Ki-67 foi realizada. Detalhes de análise IHC foram descritos anteriormente [27]. expressão de IGF-1R foi marcado por determinação da intensidade e da percentagem de células positivas. A intensidade foi classificada como negativa (0), fraca (1), moderado (2), ou forte (3). A extensão de células positivas foi marcado em seis categorias: sem coloração (0), 1-5 (1), 5-25 (2), 25-50 (3), 50-75 (4), e 75-100% (+5) de células positivas. Uma pontuação de imunorreactividade (IRS) foi calculada multiplicando a intensidade de coloração e a extensão, resultando em uma escala de 0 a 15. O IRS foi dividida em dois grupos: coloração negativa ou baixo (0-5) e IRS coloração positiva ou alta ( IRS 6-15). Ki-67 coloração foi classificada como a percentagem de células de coloração nuclear positivos eo nível de corte subdivididos de acordo com as percentagens de coloração nuclear como 50% positivo.
Reagentes
IGF-1Rß, fosfo- de IGF-1R (Tyr1135 /1136), fósforo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) e mAbs fosfo-Akt (Ser473) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Anti-ß-arrestin1 e mAbs anti-ß-arrestina2 eram de Abcam. Anti-GAPDH foi o mAb a partir de Santa Cruz. IGF-1 humano e metformina foram adquiridos da Sigma. Figitumumab foi fornecido pela Pfizer.
Cultura celular
células
H446, H526 e SKBR3 foram adquiridos da ATCC. H446 e H526 foram mantidas em meio RPMI-H1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). SKBR3 foi mantida em DMEM suplementado com FBS a 10%.
A transfecção
Os ARNsi contra a ß-arrestina-1 e beta-arrestina-2 foram obtidos a partir de GenePharma (Xangai, China). transfecção transiente de ARNsi (30 nM) foi realizada utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.
Western Blotting Ensaio
As amostras de proteínas foram dissolvidas em tampão de amostra de dodecilsulfato de lítio (Invitrogen) e quantidades iguais de amostras foram separadas por SDS /PAGE. Detalhes de análise de transferência de Western foram descritos anteriormente [22].
análise de densitometria
intensidade da banda foi quantificada por ImageJ e os resultados foram normalizados para os controlos de carga correspondentes.
Ensaio de viabilidade celular
a proliferação celular foi medida com MTT (Sigma Chemical). As células foram incubadas em placas de 96 poços, e após o tempo de tratamento apropriado, a viabilidade celular foi testada de acordo com o protocolo do fabricante. Triplicados foram realizadas para cada tratamento.
Análise estatística
As diferenças nas características dos doentes por grupo e co-expressão dos marcadores foram calculados pelo teste exacto de Fisher. As curvas de sobrevida foram calculadas de acordo com o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Para identificar fatores prognósticos para OS e DFS, foram realizadas análises de regressão de Cox univariada. teste t de Student ou ANOVA foi realizada para corrigir para comparações múltiplas, conforme apropriado. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso e foram feitas usando o software SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
nível de expressão de IGF-1R correlaciona negativamente com a sobrevivência de doentes com CPPC
Em primeiro lugar, investigou se o nível de expressão de IGF-1R poderia prever a sobrevivência de doentes com CPPC. Um total de 61 pacientes foram incluídos em nosso estudo, incluindo 39 homens e 22 mulheres, com idade média de 57,21 anos (intervalo 30-75 anos). O período médio de acompanhamento foi de 40 meses, variando de 5 a 81 meses. As principais características clínicas dos pacientes foram listados na Tabela 1 e a coloração imuno-histoquímica foi representativa mostrou na figura 1a. Na análise de correlação entre a expressão do IGF-1R e parâmetros clínicos, expressão IGF-1R foi significativamente associada com o tamanho do tumor, o estado N, palco, e Ki-67 (Tabela 1).
(a) a coloração imuno-histoquímica de IGF-1R e Ki-67 (X400) em amostras de SCLC paciente de acordo com o nível de expressão de IGF-1R. (B) /sobrevivência específica da doença da sobrevivência global nos SCLC de acordo com a expressão baixa e de alta IGF-1R. (C) a sobrevivência livre de doença de acordo com SCLC de baixa e de alta expressão IGF-1R
Nós avaliamos o valor prognóstico da expressão IGF-1R relacionada a três pontos finais:. Sobrevida global (OS ), a sobrevida específica da doença (DSS) e sobrevida livre de doença (DFS). Descobrimos que todas as mortes foram relacionadas com o SCLC, de modo DSS teve o mesmo resultado que OS. As curvas de Kaplan-Meier dos dois grupos de pacientes para OS /DSS foram mostrados na Fig 1b. OS /DSS foi significativamente mais baixa em pacientes com tumores do IGF-1R-baixo do que aqueles com IGF-1R-altos tumores (p = 0,031). Resultados semelhantes foram também obtidos por análise DFS (p = 0,048) (Fig 1C). Os nossos resultados demonstram a potencial utilização de IGF-1R como um marcador de prognóstico pobre para SCLC. Além disso, foram utilizados modelos de riscos proporcionais de regressão de Cox para determinar os preditores independentes para OS /DSS e DFS (Tabela 2). Sex, palco, e de expressão IGF-1R foram significativos para OS /DSS (p = 0,006, 0,039, 0,037) na análise Cox univariada, enquanto apenas a expressão de IGF-1R foi encontrado para ser um preditor independente na análise multivariada de Cox (p = 0,037). Para DFS, sexo, fase, e de expressão IGF-1R foi estatisticamente significativa na análise de Cox univariada (p = 0,002, 0,023, 0,048), enquanto não há parâmetros foi significativa na análise multivariada de Cox. No geral, nossos dados clínicos sugeriram que o nível de expressão de IGF-1R negativamente correlacionada com a sobrevida dos pacientes, o que implica que a terapia de IGF-1R-alvo, tais como CP, tem valores terapêuticos potenciais.
efeitos antitumorais de CP em linhas de células SCLC
uma vez que o IGF-1R é susceptível de desempenhar um papel importante na SCLC, a inibição de IGF-1R por CP, que compete com IGF se ligarem ao receptor, pode ser útil para o tratamento de SCLC. Nós escolhemos H446 e h526, linhas de células SCLC típicos, para investigar os efeitos da CP. Como mostrado na Fig 2a, o IGF-1 de estimulação resultou em IGF-1R de auto-fosforilação e activação de jusante de PI3K /AKT e /ERK vias de sinalização de MEK em H446 e H526 células, enquanto SKBR3, uma linha celular de cancro de mama conhecidos por expressar baixa quantidade de IGF-1R, não foi resposta bem.
(a) As células foram fome de 12h e estimuladas com 6.5nM IGF-1 para 10 min. p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK, p-AKT, t-AKT e GAPDH foram detectados por WB. (B) As células foram tratadas com 0.065nM, 0.65nM, e 6.5nM de PB durante 48 horas com a presença ou ausência de soro. A viabilidade celular foi testada através de MTT. O número de células viáveis a seguir ao tratamento CP foi apresentada como percentagem de células não tratadas. Fizemos cada experimento por três vezes, e os dados foram representados como média ± SEM. Análise estatística: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
, em seguida, investigou a sensibilidade das linhas de células SCLC para tratamento CP.. Como se mostra na fig 2b, depois tratou-se com 0.65nM CP, H446 e H526 a viabilidade celular em comparação com células de controlo não tratadas foram 84,2% vs 48,6% e 75,1% vs 63,9% na forma e forma livre de soro de soro adicionado (SFM ), respectivamente, enquanto que a viabilidade das células SKBR3 não muda muito após tratamento CP. Isto implica que os efeitos da CP são dependentes de IGF-1R. O grupo SFM foi suposto proteger a competição de IGF-1 em meio continha soro normal. CP foi originalmente concebido para competir com o IGF1 para IGF-1R para evitar a activação do receptor, e o efeito anti-proliferativo em meio de soro adicionado apoiaram esta teoria. No entanto, o efeito anti-proliferativo em condições SFM sugeriu que a CP ou poderia suprimir ainda mais alguns basal actividade de IGF-1R que era indetectável por Western blot, ou pode ter outros efeitos anti-proliferação /apoptose independente de IGF-1R de auto-fosforilação /ativação.
CP induzida IGF-1R endocitose /down-regulação com maior ativação ERK mas não para IGF-1R e PI3K /AKT
Como alguns mAbs poderia induzir a endocitose receptor segmentação e down- regulamentação, nós investigamos se CP tem efeitos semelhantes. Tal como demonstrado na Figura 3a, CP pode regular negativamente a IGF-1R de um modo dependente do tempo, que é semelhante à induzida por IGF-1 do receptor de endocitose /degradação. Curiosamente, em comparação com o IGF-1, CP diminuiu continuamente expressão de IGF-1R, enquanto o IGF-1R começaram a expressar para trás depois de 48 horas de IGF-1 de estimulação (figura 3A), sugerindo um efeito potente e sustentável de PB em IGF-1R a sub-regulação .
(a) as células H446 e H526 foram privadas de soro durante 12h e tratados com 0.65nM CP ou 6.5nM IGF-1. IGF-1R e GAPDH foram detectados através de WB. Intensidade de IGF-1R foram quantificadas por densitometria, normalizadas para GAPDH, e apresentados como uma percentagem da intensidade em 0h. (B) As células foram deixados em jejum durante 12 h e tratou-se com 6.5nM IGF-1 ou 0.65nM CP para uma série de pontos de tempo. Os lisados celulares foram analisados através de WB para p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK e GAPDH. (C) As células foram deixados em jejum durante 12 h e tratou-se com 6.5nM IGF-1 ou IGF-1 6.5nM mais 0.65nM CP para uma série de pontos de tempo. Os lisados celulares foram analisados através de WB para p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK e GAPDH. (D) As células foram tratadas com U0126 (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8, 10 uM) durante 60 min, e em seguida incubadas com ou sem CP 0.65nM durante 48 h. A viabilidade celular foi testada através de MTT. Os lisados celulares foram preparados com diferentes concentrações de U0126 com ou sem CP, P-ERK e t-ERK foram analisados por WB. (E) Derrube de ß-arr1 e ß-arr2 por siRNA em células H446. (F) as células H446 foram derrubadas para qualquer ß-arr1 ou ß-arr2. As células foram então fome durante 12 horas, tratou-se com 0.65nM CP ou 6.5nM IGF-1 durante 24 h. As células transfectadas com siRNA mexidos como controle. IGF-1R e GAPDH foram detectados através de WB. (G) as células H446 foram derrubadas para qualquer ß-arr1 ou ß-arr2. As células foram então carente de 12h, tratada com 0.65nM CP ou 6.5nM IGF-1 para 10 min. As células transfectadas com siRNA mexidos como controle. p-IGF-1R, p-ERK e GAPDH foram detectados através de WB. Fizemos cada experimento por três vezes, e os dados foram representados como média ± SEM. Análise estatística:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Crescimento endocitose do receptor induzida pelo factor é crítico para a transdução de sinal RTK e inibição de endocitose poderia atenuar a sinalização a jusante vias [28]. Porque CP parece ter um efeito semelhante ao do IGF-1 no IGF-1R a endocitose e a degradação, nós investigamos se o tratamento CP poderia alterar as vias de sinalização a jusante. Como se mostra na fig 3b, após jejum de células, o IGF-1 pode activar o IGF-1R via de sinalização de uma maneira dependente do tempo, com e pAKT pERK pico após 10 minutos de estimulação. No entanto, a CP não conseguiu induzir a auto-fosforilação de IGF-1R ou activar a via PI3K /AKT (Figura 3b). A activação de ERK foi ligeiramente mais elevada, especialmente após 60 min de tratamento CP, mas era ainda muito mais fraca do que activado por IGF-1 (Figura 3b). Além disso, foi investigado o efeito da proteína sobre o IGF-1 dependente de sinalização a jusante. Como mostrado na Fig 3c, a adição de CP poderia atenuar a fosforilação de IGF-1R, Akt e ERK singularização estimulada por IGF-1. Os nossos dados sugerem que a PC poderia regular negativamente de IGF-1R em H446 e H526 células, o que é, provavelmente, através de endocitose induzida pelo mAb receptor de /degradação, e o receptor de endocitose não pode activar as vias de sinalização a jusante de forma significativa em comparação com o IGF-1. Esta quase receptor “silenciosa” fenômeno sub-regulação podem explicar parcialmente os efeitos anti-tumorais de CP.
A inibição da ativação ERK aumenta ainda mais o efeito terapêutico da CP para alvejar as células SCLC
Em seguida, tentaram combinar CP com outros fármacos para aumentar a sua eficácia contra o SCLC. Percebemos que havia alguma basal MEK activação /ERK em H446 e H526 células após inanição celular e o nível de vantagem foi mesmo ligeiramente aumentada após o tratamento CP (Fig 3b). Dado que a activação de ERK induzida por CP pode subjacente ao mecanismo de sobrevivência de células SCLC e resistência à droga durante a terapia de CP, foram investigados os efeitos da combinação de CP com U0126, um inibidor da MEK /ERK específica para inibir a activação de ERK a jusante, na linha celular H446 . Como mostrado na Fig 3d, manteve a viabilidade celular diminui com o aumento da concentração de U0126, sugerindo um papel vital de sinalização MEK /ERK em CPPC. Além disso, houve um efeito aditivo de U0126 mais CP tratamento, em comparação com qualquer U0126 única ou a CP somente, o que implica um benefício potencial de inibir ERK durante a terapia CP. E o resultado de Western blot mostrou que o efeito inibidor de MEK U0126 na sinalização /ERK. Esses achados estão de acordo com Zinn.
et al
., Que declarou que a baixa de pré-tratamento nível de p-ERK pode ser indicativo de sensibilidade à terapia de IGF-1R pequena molécula inibidora em SCLC [29].
Knockdown de ß-arrestina2 especificamente inibe MEK /ERK ativação em células SCLC tratados com CP
Nós mostramos que CP poderia induzir IGF-1R degradação e ativação ERK. Em seguida, tentar investigar o mecanismo desta ativação ERK IGF-1R auto-independente de fosforilação. Como um dos principais efeitos da CP foram induzir a IGF-1R endocitose /degradação, decidimos focar ß-Arrestinas (SS-arr), uma família chave de proteínas envolvidas no IGF-1R ubiquitination e endocitose [30]. Existem duas isoformas de ß-arrestina, SS-arr1 e 2, e que têm sido sugeridos para ser funcionalmente redundantes [31,32]. Usamos siRNA para knockdown ß-arrestina específico (ß-arr1 KD ou ß-arr2 KD) em células H446 (Fig 3e), com siRNA mexidos como controle. Nós primeira investigado seus efeitos sobre a degradação IGF-1R. KD da ß-arr1, mas não ß-arr2, resgatou a degradação do receptor induzida IGF-1; no entanto, KD da nem ß-arr1 nem ß-arr2 poderia inibir induzida pela CP degradação IGF-1R (Fig 3-F). Estudamos ainda mais os efeitos de substâncias ß-Arrestinas KD na ativação ERK. Surpreendentemente, quando derrubado ß-arr1 em H446 células, o nível de vantagem foi aumentado dramaticamente em ambos os grupos tratados com CP (Fig 3G) IGF-1 e, o que sugere um papel inibidor de ß-arr1 durante a ativação ERK. Em contraste, em células KD SS-arr2 a activação de ERK foi mais baixa em ambas as células tratadas de IGF-1 e PB em comparação com células de controlo. Nossos dados sugerem que a ß-arr2 foi fundamental para a ativação ERK, ea combinação de CP com KD ß-arr2 diminuiu drasticamente o perk abaixo do nível de detecção de Western blot, indicando valores terapêuticos potenciais para combinar CP com inibidor de ß-arr2 para tratar CPPC . Os nossos resultados também estão em conformidade com a literatura publicada, onde o SS-arrestinas foram revistos para scaffold a quinase de tirosina e podem levar à activação de ERK em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) [33].
inibe Metformina SCLC através de IGF-1R via de sinalização
em seguida, perguntou se poderíamos usar CP juntamente com outro potencial de drogas anti-câncer, a metformina, para melhorar a sua eficácia. O primeiro tentou acessar para confirmar os efeitos anti-tumorais de metformina no SCLC por tratamento de células H446 e H526 com metformina isoladamente ou em conjunto com IGF-1 (Fig 4a). Porque a estimulação do IGF-1 atenuou os efeitos anti-proliferativos de metformina, especulamos que a metformina e PB pode ter efeitos anti-tumorais de aditivos. Também se avaliou a consequência de metformina em IGF-1R via de sinalização, e como mostrado na figura 4b, a fosforilação de IGF-1R de IGF-1-estimulado e a jusante de PI3K /AKT e MEK activação /ERK foram diminuiu após tratamento de células com metformina. Além disso, semelhante aos resultados anteriores, KD de SS-arr1 promovido a activação de ERK enquanto KD de SS-arr2 atenuada activação de ERK, e estes efeitos ocorreram com ambas as condições de metformina em linha celular H446 (Fig 4C) IGF-1 única e de IGF-1 mais . Além disso, a metformina poderia também regular negativamente a IGF-1R de um modo dependente do tempo em células H446 (Figura 4d). No geral, embora os mecanismos precisos de efeitos anti-câncer da metformina foram indescritível, nossos dados sugerem que atua parcialmente através da inibição IGF-1R via de sinalização.
(a) H446 e H526 células foram tratadas com metformina 48h (3 mM ) sozinho, IGF-1 (6.5nM) sozinho, ou IGF-1 e metformina. A viabilidade celular foi testada através de MTT. O número de células viáveis seguintes tratamentos é apresentada como percentagem de células não tratadas. (B) Depois de inanição 12h, as células H446 e H526 foram tratados com ou sem metformina 3 mM durante 1 h. As células foram então tratadas com 6.5nM IGF-1 para uma série de pontos de tempo. Os lisados celulares foram analisados através de WB para p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK e GAPDH. células (c) ß-arr1 e ß-arr2 KD H446 foram fome de 12h e tratada com ou sem metformina 3 mM durante 1 hora. As células foram então estimuladas com 6.5nM IGF-1 durante 10 min. Os lisados celulares foram analisados quanto a P-IGF-1R, p-ERK e GAPDH através de WB. (D) As células foram incubação com metformina 3 mM para uma série de pontos de tempo, e o nível de um total de IGF-1R foi detectada através de WB. Fizemos cada experimento por três vezes, e os dados foram representados como média ± SEM. Análise estatística: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Efeitos aditivos de CP com metformina para direcionar SCLC
Porque os efeitos da metformina. e CP foram bastante semelhantes em termos de receptor para baixo-regulação e IGF-1R sinalização inibição da via, que, em seguida, perguntou se existem quaisquer efeitos anti-tumorais aditivos quando a combinação de metformina com a CP. Testamos H446 a viabilidade das células (MTT), após o tratamento com PB sozinha ou PB mais metformina, e a experiência foi realizada com e sem soro. Semelhante aos resultados anteriores, CP tinha mais dramáticos efeitos anti-proliferativos em condições de privação, em comparação com condições com soro (Fig 5A). Curiosamente, os efeitos da metformina promovido CP contra células SCLC em ambas as condições contendo soro (82,6% vs 64,5%) e SFM (49,4% vs 40,7%).
(a) H446 células foram pré-tratadas com metformina 3mM durante 1 h, e, em seguida, foi adicionado CP 0.65nM com presença ou ausência de soro. MTT foi realizado para testar a viabilidade celular após 48 horas de incubação. O número de células viáveis a seguir ao tratamento é apresentado como a percentagem de células não tratadas. (B) Depois de inanição 12h, as células foram tratadas com ou sem 3mM de metformina durante 1 h, e depois tratou-se com 0.65nM CP durante 10 min. Os lisados celulares foram analisados quanto a P-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK e GAPDH via WB. (C) 3 mM Metformina foi adicionado às células durante 1 h, em seguida, foi adicionado CP 0.65nM para uma série de pontos de tempo. O nível de IGF-1R e GAPDH foram detectados através de WB. (D) As células SS-arr1 KD H446 foram tratados com metformina 3 mM durante 1 h, e, em seguida, incubadas com 0.65nM CP durante 24 h. Os níveis de IGF-1R e GAPDH foram detectados através de WB. Fizemos cada experimento por três vezes, e os dados foram representados como média ± SEM. Análise estatística:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
Em seguida, investigaram o mecanismo deste efeito anti-câncer aditivo. Porque CP sozinho estimularam pERK e temos mostrado alguns efeitos de drogas aditivas com inibidor MEK /ERK, a metformina pode agir de forma semelhante para ajudar a desligar ativação ERK. No entanto, embora CP sozinho ainda aumento do nível Perk, combinando CP com metformina não poderia inibi-la (Fig 5b). Por conseguinte, os nossos resultados implicaram que o efeito aditivo de drogas de metformina é diferente daquele do inibidor de MEK /ERK. Em seguida, investigaram se a metformina teve alguns efeitos aditivos no receptor infra-regulação. Como mostrado na Fig 5c, a degradação do IGF-1R dependente do tempo foi observado em ambas CP CP sozinho e os grupos mais metformina, e a metformina poderia aumentar ainda mais do receptor induzida pela CP sub-regulação. Além disso, semelhante aos resultados anteriores, SS-arr1 KD poderia parcialmente resgatar o IGF-1 e metformina induzida IGF-1R a sub-regulação, mas não para CP e metformina (Figura 5D), enquanto SS-arr2 KD pode resgatar nem (dados não mostrando). No geral, nossos resultados sugerem um efeito terapêutico aditivo do CP com metformina para direcionar SCLC. Este efeito terapêutico de combinações pode ser através da indução de uma maior IGF-1R para baixo-regulação, e os nossos dados indicam que este processo foi regulamentado independente de substâncias ß-Arrestinas.
Discussão
drogas anticorpos são recentemente sido amplamente utilizados em terapias do cancro. Embora CP mostrou alguns resultados encorajadores em fase II de ensaios clínicos para tratar vários tipos de câncer, o resultado da fase III de ensaios clínicos foi decepcionante. Uma das principais desvantagens de PB foi a falta de eficácia. Outro ensaio clínico recente para testar CP foi encerrado prematuramente devido ao lento inscrição de pacientes. Portanto, atualmente não há a necessidade de avaliar se CP tem valores terapêuticos suficiente para retomar o ensaio clínico, e se sim, como podemos incentivar a inscrição dos pacientes. No presente estudo, investigamos o mecanismo da CP e avaliou o potencial da terapia de combinação para direcionar SCLC.
Foram examinados através de diferentes tecidos do paciente SCLC e consistente com os resultados preciosos, encontramos pacientes com maior expressão IGF-1R tumores tinham uma taxa de sobrevivência mais pobre (Fig 1b), sugerindo um potencial valor terapêutico da CP para direcionar SCLC. Semelhante aos tecidos SCLC paciente, H446 e H526 células têm relativamente alta expressão de IGF-1R (figura 2a), e tratamento CP poderia inibir a proliferação de H446 e células H526 em ambas as condições de soro adicionado e isentos de soro (Figura 2b). O efeito anti-proliferativo em condições isentas de soro foi surpreendente porque o IGF-1R foi geralmente não fosforilada e inactiva sem soro e o principal efeito da CP foi pensado para competir com IGF-1 para se ligar /inibir o IGF-1R. O nosso resultado implicava que ao lado como um IGF-1 concorrente, CP também poderia inibir SCLC através de um mecanismo que é independente de IGF-1R de auto-fosforilação. Encontrámos CP poderia induzir IGF-1R endocitose /sub-regulação, que foi mais potente do que a induzida por IGF-1, e o induzido por CP endocitose de IGF-1R mantido inactivo e não fosforilada (Figura 3b). Portanto, uma possível explicação poderia ser a endocitose não fosforilada IGF-1R pode desencadear outras vias de sinalização que promovem os efeitos anti-proliferativa /apoptose. No entanto, esta hipótese deve ser validado em estudos futuros.
CP Embora não podia activar PI3K /AKT que está a jusante da via de sinalização de IGF-1R, foi demonstrado que a CP poderia promover a activação de ERK, que foi mediada através SS -arrestin2 enquanto inibida por SS-arrestin1.