Abstract

Acumulando a evidência sugere que a metformina, uma classe biguanida de medicamentos anti-diabéticos, possui propriedades anti-câncer. No entanto, a maioria dos estudos para avaliar a eficácia terapêutica da metformina foram em câncer primário. Nenhuma informação está disponível se a metformina pode ser efetivamente usado para o câncer recorrente, especificamente cancro colorectal (CRC), que afeta até 50% dos pacientes tratados por quimioterapias convencionais. Embora as razões para recorrência não sejam completamente compreendidas, pensa-se ser devido a re-emergência da haste do cancro resistente a quimioterapia de células estaminais /-like (CSCs /CSLCs). Portanto, o desenvolvimento de estratégias de tratamento não-tóxico segmentação CSCs seria um benefício terapêutico significativo.

No presente inquérito, que examinaram a eficácia da metformina, em combinação com 5-fluorouracil e oxaliplatin (FuOx), o esteio da terapêutica do câncer de cólon, na sobrevivência de células cancerígenas do cólon quimio-resistentes que são altamente enriquecidos em CSCs /CSLCs. Os nossos dados mostram que a metformina actua sinergicamente com FuOx para (a) induzir a morte celular em tratamento de quimioterapia (CR) e HT-29 HCT-116 células de cancro do cólon resistentes, (b) inibir a formação de colonospheres e (c) aumentar a colonospheres desintegração.

In vitro

estudos de cultura de células têm ainda demonstrado que o tratamento combinatória inibe a migração de células cancerígenas do cólon CR. Estas alterações foram associados com o aumento da miARN 145 e redução da miARN 21. via de sinalização Wnt /β-catenina foi também sub-regulada indicando o seu papel central na regulação do crescimento de células cancerígenas do cólon CR. Os dados do modelo de xenoenxerto de murganhos SCID de CR HCT-116 e células HT-29 CR mostram que a combinação de metformina e FuOX é altamente eficaz na inibição do crescimento de tumores do cólon tal como evidenciado pela inibição ~ 50% do crescimento a seguir a 5 semanas de tratamento combinado , quando comparado com os controlos tratados com veículo. Nossos dados atuais sugerem que a metformina em conjunto com a quimioterapia convencional poderia ser um regime de tratamento eficaz para o cancro colorectal (CRC) recorrentes

Citation:. Nangia-Makker P, Yu Y, Vasudevan A, Farhana L, Rajendra SG, Levi E, et al. (2014) Metformina: um agente terapêutico potencial para o cancro do cólon periódico. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10.1371 /journal.pone.0084369

editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Outubro, 2013; Aceito: 22 de novembro de 2013; Publicação: 20 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nangia-Makker et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do NIH (AG014343) e do Departamento de Assuntos de Veteranos (I101BX001927). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

entendimento recente da composição heterogénea das células cancerosas em um tumor revelou a presença de CCC /CSLCs [1], [2], que exibem características de auto-renovação, a capacidade para iniciar tumores a partir de um número pequeno de células que são resistentes quimio-altamente [3] – [7]. Carcinoma de recorrência é em parte devido ao fato de que a quimioterapia convencional tem como alvo apenas as células que se dividem rapidamente que formam massa do tumor, mas poupa os CSCs /CSLCs [8]. A proporção de CSCs está relacionado com o aumento após a quimioterapia convencional [9]. Assim, a presença de resistentes à quimioterapia CSCs /CSLCs no tumor primário pode em parte ser responsável por uma falha de erradicação completa do tumor, resultando na sua recorrência nos locais primários e secundários. O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que têm como alvo especificamente CSCs /CSLCs é, por conseguinte, garantido.

Metformina, (cloridrato de 1,1-dimetilbiguanida) um fármaco aprovado pela FDA biguanida anti-diabético, é derivado de lilás Francês (

Galega officinalis

), uma planta usada na medicina popular por vários séculos. Para além da sua função como um supressor de gluconeogénese, a metformina foi recentemente demonstrado que possuem fortes propriedades anti-cancerosas. Em pacientes diabéticos tipo 2 metformina tem demonstrado suprimir a carcinogénese em cancros da mama, pâncreas e pulmão, e a diminuir a mortalidade relacionada com o cancro (revisto em [10], [11]. Em um certo número de estudos pré-clínicos, a metformina reduziu a proliferação, a apoptose induzida, causou a paragem do ciclo celular, e reduziu a incidência e o crescimento de tumores experimentais in

in vivo

[12] – [18] Alguns relatórios indicam também que a metformina melhorou a resposta de xenoenxertos de tumor da mama humano à quimioterapia convencional por erradicação CSCs em. o tumor [19], [20].

Muitos investigadores relataram o papel central da via de sinalização /β-catenina Wnt na regulação da auto-renovação de células-tronco epiteliais [21], [22], e a sua desregulação tem sido implicada em muitas doenças malignas incluindo cancro colo-rectal (CRC) [23], [24]. em CRC, como resultado da inactivação do gene de APC, a fosforilação coordenada e destruição de β-catenina é interrompido. como resultado, β-catenina acumula-se no citoplasma, com complexos de proteínas de ligação de ADN da família TCF /LEF e transloca-se para o núcleo [25], [26]. Uma vez lá, que activa a transcrição dos seus genes-alvo tais como ciclina D1, c-myc, MMP-7, MT1-MMP, etc AXIN1 [27]. Muitos destes genes alvo estão implicadas na proliferação de células estaminais intestinal e carcinogénese [28]. Recentemente, mostrou que a via Wnt /β-catenina desempenha um papel crucial no crescimento e manutenção de colonospheres, que estão altamente enriquecidas em células /CSL CSC [29]. Aumento dos níveis de β-catenina em colonospheres foram associadas com a indução de activação da transcrição de TCF /LEF, que foi reduzida quando β-catenina foi silenciada utilizando siRNA [29].

Uma nova classe de curtas RNAs não-codificantes , assim chamado RNAs tem emergido como um regulador da tradução do mRNA. Um miARN pode actuar como um supressor de tumor ou um oncogene dependendo seus alvos em diferentes tecidos e tipos de células [30]. Análises abrangentes de miARN padrões de expressão em cancros humanos revelaram que tipos de cancro diferentes têm padrões de expressão de miARN distintas [31] .que têm relatado que miR21, que tem sido mostrado para ser regulada para cima no CRC [32], em tratamento de quimioterapia induz stemness células resistentes ao (CR) de câncer de cólon [33]. miR21 foi mostrado para regular as propriedades de crescimento, a migração, a invasão e a apoptose de células cancerosas relacionadas [34]. Down-regulação da miR21 pela CDF, um análogo da curcumina [35], resultou na normalização do eixo PTEN /Akt no CR HCT-116 e células CR HT-29 e crescimento reduzido [36]. A sobre-expressão de miR21in HCT-116 células resultou numa actividade aumentada β-catenina [33].

O presente estudo foi realizado para examinar se a metformina poderia ser usado em conjunto com a quimioterapia convencional para inibir o crescimento de quimio células cancerígenas do cólon resistentes ao e a regulação deste processo. Aqui, nós demonstramos que a metformina age sinergicamente com FuOx, uma combinação de 5-FU e oxaliplatina, o esteio na quimioterapia do cancro do cólon para inibir o crescimento de células do cólon CR

in vitro

e

in vivo

bem como a sua migração via-down regulação miR21and inibir a via de sinalização /β-catenina Wnt.

Materiais e Métodos

linhas de células e reagentes

células cancerígenas do cólon humano HT-29 e HCT-116 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (4,5 g /l de D-glucose) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen, Grand Island, NY) e 1% de antibiótico /antimicótico numa incubadora humidificada a 37 ° C numa atmosfera de 95% de ar e 5% diaoxide carbono. células 5-Fluorouracilo + Oxaliplatina (FuOx) resistentes (células CR) foram geradas como descrito anteriormente [37] – [39] no nosso laboratório. As células de CR foram mantidas em meio de cultura normal contendo 2 × FuOx (50 uM 5-FU + 1,25 uM Ox). As células endoteliais foram uma oferta do Dr. Dipak Banerjee, Universidade do Porto Rico e mantidas em meio essencial mínimo de Earle suplementado com 10% de soro bovino fetal (Hyclone), como previamente descrito [40]. O meio foi mudado duas vezes por semana, e as células foram passadas utilizando tripsina a 0,05% /EDTA (Invitrogen). O uso de linhas celulares foi aprovado pelo Comité de Humano Investigation, Wayne State University, Detroit, MI. O cloridrato de metformina foi adquirido da Sigma Chemical Co. Uma solução 2 M foi preparada em água destilada estéril e armazenado a -20 ° C. FU e boi foram obtidos a partir de Sigma Chemical Co.

A determinação do crescimento celular

O crescimento de células de cancro do cólon foi avaliada através da redução mitocondrial dependente de 3- (4,5-dimetiltiazol-2il ) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma) em formazano, tal como descrito anteriormente [41]. Resumidamente, as células (5 × 10

3) foram semeadas em quadruplicados em placas de cultura de 24 poços. Após 24 h, meio fresco contendo várias concentrações de metformina e /ou FuOx foi adicionado. Após 72 horas, a proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Resumidamente, o meio foi removido e as células foram incubadas a 37 ° C com MTT (0,5 mg /mL) durante 4 h. O meio foi aspirado e as células foram solubilizadas em HCl 0,04 N em isopropanol. A densidade óptica (OD) foi medida a 570 e 630 nm.

Análise de interação entre metformina e FuOx

índices de combinação (CI) método adaptado para o

in vitro

droga o teste foi utilizado para determinar a natureza da interacção entre a metformina e FuOx. Este método utiliza a equação de efeito múltiplo droga originalmente derivada do método cinética da enzima, em que a saída está representada como a CI e /ou análise de isobolograma analysis.CI foi realizada utilizando o software CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO). Com base em valores de CI, medida de sinergismo /anatogonism é determinada. Em geral, os valores de IC inferiores a 1 sugerem sinergia, ao passo que valores de CI acima de 1 indicam antagonismo entre as drogas. valores de CI na gama de 0,9-1,10 seria principalmente indicam efeitos aditivos: aqueles entre 0,9-0,85 sugerem ligeira sinergia e valores na gama de 0,7-0,3 são indicativos da sinergia moderada. Quaisquer valores de menos de 0,3 sugeriria fortes interacções sinérgicas entre os medicamentos.

A formação e diferenciação de colonospheres

A capacidade das células para formar esferas em suspensão foi avaliada tal como descrito por Liu et al [42 ] com ligeiras modificações [29], [43]. Resumidamente, foram colonospheres gerado por incubação de um número limitado de células parentais e CR HCT-116 e HT-29 a uma concentração de 100 células por 200 uL no soro -livre haste meio celular (SCM) contendo DMEM /F12 (01:01) suplementado com B27 (Life Technologies, Gaithersberg, MD), factor de 20 ng /mL de crescimento epidérmico (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /mL de factor de crescimento de fibroblastos (Sigma) e antibiótico /antimicótico em placas de 24 poços, na presença de a metformina por si só ou em combinação com FuOx. Os colonospheres formado após 8 dias foram avaliados quanto à sua dimensão e número por microscopia de luz. Em uma série de experimentos, os colonospheres formados em meio normal foram tratados com metformina e /ou FuOx para analisar seu efeito sobre a diferenciação esfera e do apego.

análise de diluição limitante extrema

análise de diluição limitante

Extreme (ELDA) foi realizada como descrito por Hu e Smyth [44]. Resumidamente, a suspensão de células individuais obtidas a partir de células aderentes pré-tratados com metformina e /ou FuOx durante 72 h foram colocadas em placas a uma concentração de 100, 10 e 1 célula por 100 μLSCM (24 poços para cada diluição), em placas de 96 poços e incubadas durante 8 dias . Ao fim de 8 dias, o número de cavidades que mostra a formação de colonospheres foi contado. A frequência de células formadoras esfera foi determinada utilizando ELDA WebTool em https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.

A migração celular ensaio

Este ensaio foi realizado usando um Boyden câmara (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD) como descrito anteriormente [41], [45]. Na câmara inferior 100 ug /ml de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) por si só ou misturado com metformina e /ou foi adicionado FUOX. células HT-29 ou CR HT-29 (5 × 10

4) As células foram carregados na câmara superior. As duas câmaras foram separados por um filtro de policarbonato de 8 μ tamanho de poro e incubou-se em um C incubadora de cultura de tecidos de 37 ° durante 16 h, após o que o filtro foi removido, as células na parte superior do filtro foram removida e as células migradas foram fixadas, coradas utilizando o protocolo de Hema 3 set stain (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). As células migraram foram fotografados usando Olympus 45 microscópio apoiando uma câmera Idea Spot e as células migraram por campo foram contados. Cada ensaio foi realizado três vezes e 6 poços foram utilizados para cada tratamento.

o próximo conjunto de experiências, a migração de células de cancro do cólon contra células endoteliais foi medida. Nesta investigação, células enodothelial ou HT-29 /CR células HT-29 (2,4 x 10

4) foram pré-marcadas com corante viável DiO ou DII, respectivamente (Invitrogen), lavou-se duas vezes com meio completo e semeado em cada câmara da inserção de cultura de célula (Ibidi GmbH). Após 24 h, a inserção de cultura celular foi removido e observou-se a migração das co-culturas em relação uns aos outros para a cicatrização de feridas. Em algumas culturas, metformina e /ou FuOx foi adicionado no momento da remoção do inserto. As células foram fotografadas a 0, 24 e 48 horas após a remoção da peça inserta.

análise Western blot

análise de Western blot foi realizada de acordo com o protocolo convencional [46]. Resumidamente, as células foram solubilizadas em tampão de lise (50 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X100, 0,5% de NP40, 25 ug /mL de cada um de aprotinina, leupeptina e pepstatina, 1 × fosfatase cocktail inibidor (Sigma). Após clarificação a 10.000 g durante 30 min, o sobrenadante foi utilizado para análise de proteínas. a concentração de proteína determinada pelo kit de ensaio de proteína Bio-Rad ((Bio-Rad, Hercules, CA) e aliquotas contendo 25