Abstract

O mesotelioma maligno (MM) é um tipo agressivo de tumor causando alta mortalidade. Uma razão para este paradigma pode ser a existência de uma subpopulação de células tumorais de iniciação (TICs) que conferem resistência a drogas com MM e recorrência. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar uma subpopulação TIC em células MM, utilizando culturas esferóides, mesospheres, como um modelo de MM TICs. Mesospheres, tipificados pelos marcadores stemness CD24, ABCG2 e Oct4, iniciado tumores em ratinhos imunodeficientes de forma mais eficiente do que as células aderentes. CD24 células knock-down perdido a capacidade de formação de esfera e contou com menor tumorigenicidade. No momento do transplante de série, mesospheres foram gradualmente de forma mais eficiente tumrigenic com o aumento do nível de marcadores de células-tronco. Também mostram que mesospheres apresentam propriedades mitocondriais e metabólicas semelhantes às de células estaminais normais e cancerosas. Finalmente, mostramos que as células iniciadoras de mesotelioma são altamente suscetíveis a direccionado para as mitocôndrias succinato de vitamina E. Este estudo documenta que mesospheres podem ser utilizados como um modelo plausível de células de iniciação de mesotelioma e que pode ser utilizada na pesquisa de agentes eficazes contra MM

citação:. Pasdar EA, Smits H, Stapelberg H, Bajzikova H, Stantic H, J Goodwin, et ai. (2015) Caracterização de Células-Iniciando mesotelioma e sua suscetibilidade a agentes anticancerosos. PLoS ONE 10 (5): e0119549. doi: 10.1371 /journal.pone.0119549

Editor do Academic: Lin Zhang, da Universidade da Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 08 de setembro de 2014; Aceito: 14 de janeiro de 2015; Publicado em: 01 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Pasdar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Os dados em bruto originais são armazenados no sistema de Griffith University. https://research-storage.griffith.edu.au/owncloud/index.php/apps/files/?dir=%2Fdocuments%2FPasdar%20et%20al%20PLoS%20One.

Funding: O trabalho foi apoiado em parte por doações do Conselho Australiano de Pesquisas, Câncer Queensland Conselho, e do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (o projeto BIOCEV, CZ.1.05 /1.1.00 /02.0109) ao JN. EAP foi suportado pela bolsa Douglas Francis Green PhD fornecido pelo Queensland Asbestos-Related Disease Society. LFD foi apoiado pela Griffith University Research Fellowship. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o mesotelioma maligno (MM), o tumor primário da pleura, é altamente agressivo, com muito pouco ou nenhum opções terapêuticas. Normalmente sendo diagnosticados de 20 a 40 anos após a exposição ao amianto, o principal agente cancerígeno de MM, esta doença neoplásica é muito agressivo e a taxa de mortalidade é extremamente alta com uma sobrevida alguns meses após o diagnóstico [1, 2], a recidiva do tumor ocorrendo logo após o início do tratamento [3]. Apesar da actual proibição do uso do amianto nos países industrializados e, devido à falta de legislação restritiva sobre o tratamento ea utilização de amianto nos países em desenvolvimento [4], MM incidência continua a aumentar como resultado do longo período de latência.

tem sido sugerido que a heterogeneidade do tumor, como uma consequência de factores de instabilidade e de nicho genéticas dentro do tumor, é uma das principais causas de resistência ao tratamento em doentes com cancro [5, 6]. estudos genômicos de tumores MM também destacam a heterogeneidade inter e intra-tumor deste tipo de malignidade [7, 8]. Os mecanismos subjacentes à heterogeneidade do tumor ainda estão sob intenso debate e diferentes modelos têm sido sugeridos para definir este fenómeno [9]. O modelo proposto de células-tronco do câncer (CSC) podem plausivelmente descrever a heterogeneidade e hierárquica organização de células dentro de tumores [10]. CSCs (também referidas como células de iniciação do tumor, os tiques), uma pequena sub-população de células dentro de carcinomas, têm a capacidade de auto-renovação e gerar células diferenciadas com alta capacidade proliferativa que (re) formam a massa de tumor [11 ], assim como dotar tumores resistentes ao tratamento [12, 13]. A presença de TICs podem também, em parte, explicar a alta resistência da MM à terapia, embora este aspecto da MM fisiopatologia é apenas parcialmente compreendida [14, 15].

Nesta comunicação, nós informar sobre a existência de tiques em mesotelioma por caracterizar esferas derivadas a partir de diferentes linhas de células de mesotelioma como um modelo estabelecido anteriormente para a cultura de células-tronco e tiques [16-18]. Também presente caracterização de MM TICs e sua susceptibilidade aos agentes anti-câncer.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas celulares MM humanos estabelecidos IST-Mes-2 (histotipo epitelióide), meso-2 (histotipo sarcomatoide), MM-BI (histotipo bifásica) [19], e a linha de murino célula ae17 (histotipo epitelióide) [20] foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e o agente antimicótico /cocktail de antibióticos (Invitrogen). As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Para a formação de esfera, as células aderentes foram cultivadas a uma densidade de 10

4 a 2×10

4 células /ml de meio isento de soro (SFM) contendo meio DMEM-F12 (Invitrogen) suplementado com o suplemento rato NeuroCult Proliferação (Stemcell Technologies), 20 ng /ml de EGF humano recombinante e 20 ng /mL de FGF2 (R D Systems) a 37 ° C e 5% de CO

2. Sob estas condições, as células crescem em cachos esféricas não aderentes (mesospheres). Os ensaios de proliferação foram realizados utilizando o método padrão de violeta de cristal.

diluição limitada ensaio

e as células aderentes foram dissociadas e mesospheres número diferente de célula de 100 a 0,25 células por poço colocado em 96 poços de células As placas de cultura contendo 200 ul de SFM. As células foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 7 dias e a sua capacidade para formar, pelo menos, uma esfera foi avaliada com base num método de publicada [21, 22].

implantação de células tumorais

IST-Mes-2 e células aderentes mesospheres foram recolhidas, lavadas com PBS e suspendeu-se em 125 ul de DMEM isento de soro /mistura (BD Bioscience) de Matrigel (1: 1, v /v) seguido por injecção subcutânea injeção na direita ou área de mid-abdominal esquerda do Balb-c /nu ou NOD /SCID utilizando uma agulha de calibre 23. formação de tumor e progressão foi monitorizada e quantificada utilizando o dispositivo Vevo770 USI equipado com o RMV708 scan-cabeça (VisualSonics) operando na frequência de 80 MHz e com a resolução de 30 m. Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Austrália e da Nova Zelândia Conselho para o Cuidado e Uso de Animais em pesquisa e ensino e foram aprovados pela Comissão de Griffith University animal Ética (número de autorização MSC /13/10 /AEC). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

imuno-histoquímica, microscopia confocal e TEM

Os ratos foram sacrificados e os seus tumores foram imediatamente removidas, fixadas em 4% formaldeído e embebida em parafina tamponada com fosfato. Os tumores foram seccionados a 7 um de espessura em um Leica RM2265 micrótomo (Leica Microsystems), montadas em lâminas Supersoft Mais de vidro (Lomb Scientific), secou-se durante a noite a 37 ° C, em xileno e re-hidratadas de acordo com o procedimento histopatológico de rotina, parafinised-de e coradas com H e. Para a microscopia confocal, as lâminas processadas foram incubadas durante a noite com anti-IgG de mesotelina (Abcam) seguido por IgG secundário conjugado com HRP e fotografada usando a Olympus FV1000 fluorescência microscópio confocal. MET de células esfera foi realizada utilizando um protocolo estabelecido.

análise Western blot

As células foram colhidas e lisadas com o tampão de lise (sinalização celular). As amostras foram resolvidas em géis de SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF, que foram bloqueadas com BSA a 5%, e incubadas com IgG primários e secundários conjugados com HRP, seguido de visualização usando o XRS ChemiDoc

+ System (BioRad). Os anticorpos primários foram como se segue: anti-CD24 IgG, anti-EpCAM IgG (Abcam), anti-CD47 IgG (Santa Cruz), anti-OCT3 /4 IgG (Stem Cell Technologies), ABCG2 anti-IgG, anti-fosfo-p44 /42 MAPK (pErk1 /2) (Thr202 /Thr204) de IgG, anti-p44 /p42 (ERK1 /2) de IgG anti-P38 MAPK IgG, MAPK anti-fosfo-P38 (pP38) (Thr180 /Thr182) IgG, anti -EGFR de IgG, anti-fosfo-EGFR (pEGFR) (Tyr1068) IgG (todos Cell Signaling). Anti-IgG de actina (Sigma) foi utilizado como um controlo de carga.

reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR)

ARNm total foi extraído utilizando o kit RNeasy (Qiagen) e o ADNc sintetizado por meio do RevertAid primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) e iCycler iQ real-Time PCR Detection System. qPCR foi realizada utilizando o Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Geralmente, 200 ng de ARN total de modelo e 0,2 uM de iniciadores de PCR específicos para o gene foram utilizados por reacção, e o instrumento de Eco Real-Time PCR System (Ilumina) para amplificação. GAPDH foi utilizada para normalização, os níveis relativos de genes alvo foram quantificadas usando o método ΔΔCt. iniciadores individuais são os seguintes. CD24: para a frente, AGC GGT TCT CCA AGC ACC CA, inverta-TAG GAG CAG TGC CAG CAG CA; OCT4: forward-CCC CAG GTT GGA GTG GGG CT, GGC CCC ATC GGA GTT GC GGA reversa; ABCG2: forward-ACG AAC GGA ATT ACA GGG ACT, CAG ACA CAC CAC GGA T CTC reversa; SOX4: encaminha GAT TCC GCC CAC AGA GAG TC, AGC TCA GGA AAG CGA CA GGT reversa; KLF4: CTG GGT CTT GAG GAA GTG CT, ATG AGC TCT TGG TGG TAA GGC reversa; c-Myc: forward-GGA CTT GTT GCG GAA ACG AC, AGC CAA GGT TGT GAG GT CTC reversa; ABCB5: forward-ACT GAG AAA GGA AGC AGT TGG A, AGG AAG GCA GGC TCC AT TAA reversa; GAPDH: forward-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC, inverta-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG

A transfecção com RNA pequeno hairpin (shRNA)

shRNA específica CD24-

Humano constrói na. pRS espinha dorsal sob o controlo do promotor U6 e o ​​vector vazio relevantes foram obtidos a partir de OriGene Technologies (Rockville). O reagente de transfecção FuGENE HD (Promega) foi utilizado para transfectar de forma estável IST-Mes-2 células com o shRNA CD24 e de vector vazio (células simuladamente transf ectadas) de acordo com as instruções do fabricante. Os clones derivados de células individuais estáveis ​​foram seleccionados por meio da adição de 4 ug /ml de puromicina para o meio de cultura e monitorizados para a transfecção utilizando qPCR ou transferência de Western.

A avaliação da produção de superóxido, potencial de membrana mitocondrial, a massa mitocondrial , ciclo celular, apoptose celular e tamanho

níveis de ânion superóxido intracelular foram avaliados utilizando a sonda fluorescente MitoSOX. 10

5 células foram cultivadas em placas de 24 poços e a 70% de confluência, foram tratados com 20? M MitoSOX durante 30 min, lavou-se re-suspensas em PBS, e analisadas por citometria de fluxo (FACS Fortessa, Becton Dickinson). os níveis de superóxido foram expressos como média intensidade de fluorescência (MFI). massa mitocondrial foi avaliada por tratamento das células com 50 uM MitoTracker verde FM durante 30 min e análise por citometria de fluxo. Para a avaliação do ciclo celular, 10

6 células viáveis ​​foram lavadas e fixadas em 70% de EtOH durante a noite e coradas com 100 ug /mL de iodeto de propídio (PI), e analisados ​​por FACS Calibur um fluxo de citometria (Becton-Dickinson). Sinais emitidos a partir de um único núcleo e as células agregados foram excluídos usando um módulo de duplo gating. A apoptose foi avaliada pelo método de anexina V /PI padrão. tamanho da célula foi estimada utilizando o contador de células automatizado Scepter handheld (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante.

CS, SDH e da atividade SQR

actividade

CS foi avaliada pela redução da DTNB [5,5 ‘ -dithiobis- (ácido 2-nitrobenzóico)] pela enzima e a sua reacção juntamente com oxaloacetato e acetil-CoA. Resumidamente, 10 ug de lisado de proteína foi adicionada a uma mistura de DTNB 10 mM e 30 mM de acetil-coenzima A. A alteração na absorvância de DTNB foi medida no leitor Tecan Infinito 200 PRO durante 90 s a 412 nm após a adição de 10 mM oxaloacetato num volume de reacção de 200 uL. actividade SDH foi avaliada como previamente descrito (Dong et al., 2011). Para a actividade SQR, 40? G de lisado de proteína foram adicionados a 1 ml de tampão de ensaio SQR (10 KH2PO4 mM, pH 7,8, EDTA 2 mM, 1 mg /ml de BSA), diclorofenolindofenol 80 uM, ATP 0,2 mM, 4