Abstract

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma neoplasia de pulmão altamente agressivo com extremamente pobre clínica resultados e não há tratamentos direcionados aprovados. Para elucidar os mecanismos responsáveis ​​por dirigir o fenótipo SCLC na esperança de revelar novos alvos terapêuticos, estudamos número de cópias e perfis de metilação de SCLC. Encontramos rompimento da E2F /via de Rb foi uma característica proeminente desregulamentado em 96% das amostras de SCLC investigados e foi fortemente associada com aumento da expressão de EZH2, um membro do oncogene e núcleo da Polycomb repressivo complexa 2 (PRC2). Através do seu papel catalítico no complexo PRC2, EZH2 normalmente funciona para silenciar epigenetically genes durante o desenvolvimento, no entanto, é aberrante silencia genes em cancros humanos. Nós fornecemos evidências para apoiar essa EZH2 é funcionalmente ativo em tumores SCLC, exerce funções pró-tumorigênicas

in vitro

, e está associada com perfis de metilação aberrante de genes alvo PRC2 indicativos de um “de células-tronco como” perfil hypermethylator em tumores SCLC. Além disso, knockdown mediada por lentivírus de EZH2 demonstraram uma redução significativa no crescimento de linhas de células de SCLC, sugerindo EZH2 tem um papel fundamental na condução biologia SCLC. Em conclusão, nossos dados confirmam o papel de EZH2 como um oncogene crítico no CPPC, e dar suporte para a priorização de EZH2 como um potencial alvo terapêutico na doença clínica

Citation:. Coe BP, Thu KL, Aviel- Ronen S, Vucic EA, Gazdar AF, Lam S, et al. (2013) Desregulamentação Genomic do E2F /Rb via leva à ativação do Oncogene EZH2 em Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (8): e71670. doi: 10.1371 /journal.pone.0071670

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Janeiro, 2013; Aceito: 02 de julho de 2013; Publicação: 15 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Coe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Canadian Institutes for Health Research (CIHR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é uma neoplasia de pulmão altamente agressivo com uma evolução clínica extremamente pobre, que tem visto pouca melhora ao longo dos últimos 25 anos [1]. Devido ao seu curso clínico original, SCLC é frequentemente em etapas usando um sistema de estadiamento clínico separado do sistema TNM padrão usado para a maioria dos tipos de cancro, incluindo todos os cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC), como seja limitado (33%) ou grande (67% ) doença fase com base no grau de disseminação do tumor. Os pacientes com doença em estágio limitada tem uma sobrevida média de 18 meses, enquanto que, para pacientes com extensa fase é de apenas 9 meses [2] – [4]. Devido à sua natureza altamente agressivo, a cirurgia é raramente realizada e quimioterapia com ou sem radioterapia concomitante é o tratamento habitual. Apesar SCLC inicialmente apresentando-se como uma doença sensível à quimioterapia, quase todos os pacientes com recaída após o tratamento inicial, e não há terapêuticas visadas foram aprovados para SCLC até à data [5] – [9]. Portanto novos alvos para intervenção terapêutica são urgentemente necessários para esta doença.

A identificação de oncogenes que são seletivamente ativados e que funcionalmente dirigem fenótipos tumorais, tornam alvos terapêuticos ideais para pacientes que abrigam estas aberrações. Em NSCLC, a descoberta de tais eventos levou ao desenvolvimento e aplicação de quimioterapias específicas, traduzindo-se sobrevida livre e global melhorou progressão para NSCLC para pacientes selecionados [10]. perfil genômico recente para este objectivo em SCLC ter descoberto milhares de mutações e deleções, ocorrendo em múltiplas vias supressores de tumor (por exemplo.

TP53

,

RB1 ​​

,

PTEN

,

EPHA7

), e genes envolvidos na modificação da cromatina (por exemplo.

CREBBP

,

MLL

), bem como as amplificações de genes de driver cancro SCLC putativas, tais como

SOX2

[5], [8]. Essas descobertas são significativas e podem levar ao desenvolvimento e aplicação de novas terapias direcionadas para os subgrupos muito específicos de doentes com CPPC, porém a elucidação de um alvo mais ubíqua ativado em SCLC seria ainda mais benéfico.

nível do DNA inativação do TSG

RB1 ​​

é quase universal em SCLC. RB1 normalmente inibe a proliferação através da inibição dos factores de transcrição E2F. membros da família E2F são geralmente sobre-expressa em vários tumores, incluindo SCLC [11] – [15]. Trabalho por nós e outros identificou ganhos de nível de DNA de

E2F

membros da família em linhas de células SCLC, tumores e modelos murinos [5], [16]. EZH2, um elemento de núcleo do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2), é um alvo a jusante do /complexo E2F Rb1. EZH2 é fundamental para a manutenção epigenética de células embrionárias “stem-ness” e o estabelecimento de especificidade linhagem durante o desenvolvimento normal.

EZH2

foi recentemente estabelecido como um oncogene condutor, onde se encontra envolvido na hipermetilação aberrante de genes supressores de tumor (TSG) em vários tipos de cancro. A sobre-expressão de EZH2 foi recentemente descrito em CPPC, onde tem sido proposto como um novo alvo terapêutico SCLC [11].

mecanismos subjacentes EZH2 hiperactividade foram identificadas em outros tipos de cancro e incluem mutação de

EZH2

si, que faz com que sobre-activação das suas capacidades de modificadores de histonas e fenótipos hypermethylator ADN que estão associados com um mau resultado, a resistência à quimioterapia e fenótipos de tumor altamente agressivos. Para explorar os mecanismos de condução de ativação EZH2 e para confirmar o papel oncogênico dos EZH2 em SCLC, estudamos perfis número de cópias de 14 tumores CPPC e 14 linhas de células SCLC e avaliou a viabilidade celular após EZH2 knockdown. Descobrimos que a interrupção nível do DNA de componentes da via Rb E2F /, por qualquer perda de

RB1 ​​

ou amplificação do

E2F

, ocorreu em 100% das amostras de SCLC investigado, o que foi fortemente associado com o aumento da expressão de EZH2. Confirmamos um papel oncogênico funcional para EZH2 no CPPC, e um perfil hypermethylator associado e DNA de tumores SCLC. Propomos que o rompimento genômico de E2F /Rb leva à ativação do EZH2 metiltransferase histona que funciona como um oncogene em SCLC, apoiando ainda mais a sua promessa como um alvo terapêutico para doentes com CPPC.

Métodos

Contratos de amostras e matriz Hibridização Genômica comparativa

A grande maioria dos doentes com CPPC não são candidatos cirúrgicos, assim, apenas amostras de biópsia de arquivamento estão disponíveis. Um painel de 14 e embebidos em parafina amostras de tumores SCLC foram obtidos a partir do arquivo da Rede Universitária de Saúde (UHN) Departamento de Patologia, com um protocolo de estudo aprovado pelo Conselho de Ética UHN, que não necessitam de consentimentos informados específicos para materiais fixados em formalina de antes de 2000 e os pacientes que foram mortos (Tabela S1). núcleos de tecido foram selecionados a partir de regiões de blocos de tumor que demonstraram uma pureza suficiente para um núcleo de 2 mm. Após a avaliação histológica, as amostras foram extraídas por desparafinização padrão xileno base e proteinase padrão K protocolo de extracção de DNA com base com a adição de hidrólise de base (10 minutos a 70 C de incubação com um volume de ½ a 1 M de NaOH, seguido por neutralização com um volume de ½ a 1 M de HCl) para remover qualquer contaminação ARN. ArrayCGH foi executada em uma plataforma susceptível de material de FFPE, e copiar o número de chamadas geradas como previamente descrito [16], [17].

Quantificação de E2F e EZH2 níveis de expressão

RT-PCR foi efectuada utilizando ensaios de expressão de gene de TaqMan com protocolos padrão num ABI 7500 termociclador rápida (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os ensaios foram utilizados TaqMan E2F1 (Hs00153451_m1), E2F2 (Hs00231667_m1), E2F3 (Hs00605457_m1), Rb (Hs00153108_m1), EZH2 (Hs00172783_m1), e 18S de ARN (HS99999901_s1). valores de expressão absolutos foram calculadas para E2F1, E2F2, E2F3 e RB1 por escalar os valores Ct delta (Gene-18s) para um valor entre 0 e 1000. Os níveis de proteína de EZH2 e E2F em linhas celulares foram avaliados através de métodos de transferência Western padrão (Cell sinalização anticorpos primários: # 3147 (EZH2) e # 2118 (GAPDH); anticorpos primários Santa Cruz: sc-251 (E2F1), SC-632 (E2F2) e SC-878 (E2F3)) [18]. intensidades de banda foram quantificados usando software ImageJ. A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada utilizando técnicas convencionais, com um anticorpo anti-EZH2 primário (soro policlonal de coelho, 18-7395, Life Technologies, Grand Island, NY). As imagens foram marcados com base na intensidade da coloração observada em uma escala de 0 (baixo) a 3 (alto).

DNA análise de metilação

Foram obtidos perfis de metilação do DNA por 12 tumores CPPC, e pequena epiteliais das vias aéreas (SAE) amostras brônquicas 21 de controle usando ensaio de Illumina Infinium metilação Humano (HM27). SAE foram obtidos por escova brônquica durante broncoscopia de rotina a partir de pequenas vias aéreas (definidas como 2 mm de diâmetro) dos indivíduos sem a presença ou história prévia de cancro do pulmão ou doença pulmonar obstrutiva crónica [19]. As amostras de ADN foram convertidos bissulfito utilizando o kit EZ Zymo Metilação de DNA bissulfito de conversão (Zymo Research Corporation, Orange, CA) e os perfis de HM27 geradas como previamente descrito [20]. Infinium HM27 metilação sentrix arquivos de matriz (.sdf) and.idat arquivos de imagem foram carregados em Illumina GenomeStudio. Os dados brutos foram exportados e ler em R: A linguagem e ambiente para Statistical Computing, e corrigida para viés canal de cor vermelho, verde e efeito lote entre vários experimentos de metilação, utilizando o lumi pacote Bioconductor, que aplica uma correção de cor e algoritmo de normalização SSN [21 ]. Sondas com uma Illumina detecção por arranjo de p 0,05, presente em 58% dos casos em cada grupo foram retidos. metilação por cento para cada sonda é apresentado como um valores beta (max (yi, metil, 0) /(max (yi, unmethy, 0) + max (yi, metil, 0)) 100). Uma lista de alvos EZH2 ligados em células-tronco embrionárias de rato foi obtido a partir de uma publicação da Ku

et al

[22]. Alvos foram alinhados com genes humanos ortólogos usando o banco de dados do rato Genome [23]. Para identificar genes alvo EZH2 que foram diferencialmente metilados entre SCLC e grupos normais, uma testes não paramétricos de permutação usando 10.000 permutações foi realizada como descrito por Chari

et ai. [24]. Um valor M foi calculada pelo log

2 rácio de intensidade da sonda metilado intensidade ao longo da sonda não metilado, e utilizado como entrada para o teste de permutação [25]. contagens de permutação de metilação foram corrigidos para múltiplos ensaios utilizando o método de Hochberg Benjamini e (B-H). Os valores médios beta para tumores SCLC foram subtraídos valores médios beta do normal das vias aéreas controles para obter um valor delta β. sondas hypermethylated e hypomethylated em tumores SCLC foram definidos como aqueles com valores delta beta Ou = 0,2 = – 0,2, respectivamente. Sondas que preencheram os seguintes critérios:

i

) permutação B-H corrigido p 0,05,

ii

) um valor delta beta Ou = 0,2 = -0,2 E

iii

) um desvio padrão (SD) ≤2 dentro de cada grupo, foram considerados diferencialmente metilado (DM) entre tumores SCLC e vias normais.

Correlação entre EZH2 e Expressão E2F níveis

Para determinar a associação entre o

EZH2

e

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, e

RB1 ​​

os níveis de expressão de mRNA em amostras de SCLC, nós interrogado dados de expressão publicamente disponíveis a partir Peifer et al. [5] e obra da Linha celular Sanger do Instituto Broad (broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). GraphPad Prism 6 foi usado para calcular os coeficientes de correlação de Spearman entre a

EZH2

e /genes da via Rb E2F.

Knockdown de

EZH2 e E2F

em linhas SCLC e

E2F

expressão em células HBEC

linhas celulares

293T, HTB-175 e H524 SCLC foram obtidas da ATCC e cultivadas de acordo com as instruções da ATCC. células bronquiais humanas imortalizadas epiteliais (HBEC) foram cultivados em meio KSFM suplementado com extrato de pituitária bovina e EGF. plasmídeos resistentes Lentivirus PLKO-puromicina que codificam shRNAs segmentação

E2F1

,

E2F2

,

E2F3

, e

EZH2

foram comprados da Open Biosystems (RHS3979-201768515 , RHS3979-201745380, RHS3979-201745384, e RHS4533-NM_004456). Os lentivírus foram geradas como previamente descrito [26]. Multiplicidade de infecção (MOI) foi determinada para ambos o PLKO (controlo de vector vazio) e E1 (EZH2 segmentação shRNA) vírus usando iniciadores TaqMan personalizado (para a frente 5 ‘- GCGGTGTTCGCCGAGAT – 3’ e inverso, 5 ‘- GAGGCCTTCCATCTGTTGCT – 3’). A transfecção foi realizada como descrito no Lockwood et al [26]. Resumidamente, para cada linha e vírus 150.000 células foram infectadas (utilizando uma MOI de 15 para vírus EZH2) em meio suplementado com 2 ug /ml de polibreno. O meio de crescimento foi suplementado com 1 ug /ml de puromicina para seleccionar para células infectadas. Para avaliar a viabilidade de

EZH2

knockdown em relação ao ensaios MTT células controlos foram realizados como previamente descrito [26].

E2F1

(EX-Z8212-M46),

E2F2

(EX-F0378-M46),

E2F3

(EX-T0731-M46), e controle luciferase (EX Os clones de expressão -hLUC-M46) foram adquiridos a partir de ORF GeneCopoeia. experiências de expressão transiente foram efectuadas utilizando Lipofectamina LTX seguindo as instruções do fabricante. Eficiência de E2F knockdown e superexpressão, e seus efeitos sobre os níveis de expressão EZH2 foram determinados por Western blot.

Resultados e Discussão

Genomic Profiling de SCLC tumores, e comparação com linhas de células SCLC

os detalhes dos perfis no número de cópias de ADN destes tumores juntamente com 14 linhas de células SCLC não relacionados são apresentados na Figura S1, e estão disponíveis no Omnibus Gene Expression dados. Surpreendentemente, observamos a recorrência de cópias de ADN alterações numéricas em tumores SCLC, incluindo as regiões que abrangem principais candidatos via do nosso estudo linha de célula anterior, tais como

TCF4

(18q21),

STMN1

(18q21) e

E2F2

(1p36) [16].

O E2F /Rb Pathway é especificamente desregulada em SCLC

com base em observações anteriores feitas por nós e outros, temos a hipótese de que o ciclo celular activação em CPPC pode ocorrer tanto a jusante como os factores de transcrição que regulam a progressão do ciclo celular. A via retinoblastoma tem sido estabelecido como um alvo chave da desregulamentação em SCLC.

RB1 ​​

é frequentemente perdido ou mutada (60-90%) em SCLC e demonstra a expressão reduzida na maioria dos casos, [5], [8], [11] – [13], [27]. Uma função primária do Rb é a sua inibição normal dos factores de transcrição E2F. Quando Rb1 é inactivada por fosforilação, proteínas E2F são livres para funcionar como factores de transcrição activadores um conjunto de factores de progressão do ciclo celular. A família E2F de genes é dividido em ativação (E2F1, E2F2, E2F3) e os membros inibitórios (E2F4, E2F5) que interagem fisicamente com Rb1 [15], [27] – [31].

A evidência recente tem demonstraram os genes E2F também podem ser alvos primários da desregulamentação. Outros estudos detectaram níveis elevados de expressão de E2F1 e E2F3 em diversos tipos de tumores, incluindo SCLC [11] – [15]. Além disso, Peifer et al observou amplificação de DNA alto nível de

E2F2

no mouse modelos de SCLC [5]. Tomados em conjunto com as nossas próprias observações de

E2F2

copiar ganho número e sobre a expressão especificamente em linhas de células SCLC e validação de

E2F2

copiar alterações numéricas em tumores SCLC, decidimos analisar melhor esta via em no contexto do número de cópias e a desregulação da transcrição.

E2F /Rb focado análise do número de cópias em linhas de células SCLC (n = 14) e tumores (n = 14) revelou ganho de pelo menos um activador do

E2F

s ou perda de

RB1 ​​

em 14/14 amostras de tumores e 13/14 linhas celulares (96% de todas as amostras; 95% CI de 80% a 100%) (Figura 1A). Isto é concordante com os perfis genômicos publicados recentemente pela Peifer et al [5], que temos a apresentar o mesmo padrão de alteração em 56/63 amostras de tumor (aplicando limiares número de cópias de 1,7 para perda de genômica e 2.3 para ganho genómico para os dados segmentados identificado eventos em 84% das amostras, IC de 95% 72% a 92%). Embora a confiança ligada não inclui 100% no estudo Peifer et al, é interessante notar que nos 29 casos com dados de sequência, 100% dos casos tinha ou

eliminação RB1 ou um evento truncando mutação [5 ]. Isto, em combinação com as estimativas anteriores de

RB1 ​​

taxas de mutação em CPPC (60% a 90%) [32], [33] sugere que E2F /RB1 interrupção é quase universal em casos SCLC.

numéricas (a) cópia alterações /membros da via Rb específicas E2F em linhas SCLC celulares (em cima) e tumores (em baixo). sombreamento verde representa a perda, enquanto o vermelho representa ganho e preto representa nenhuma mudança. (B) Expressão de membros da via de E2F /Rb por RT-PCR. Os dados são apresentados como a caixa-parcelas dos níveis de expressão absolutos derivados a partir dos dados de PCR normalizadas escala. A linha central em cada caixa representa o nível médio, enquanto a caixa representa o intervalo interquartil, com bigodes que se estende até o último ponto de dados não-outlier (definida como 1,5 × o intervalo interquartílico). Outliers são representados como cruzes. Observou-se (C) a sobre-expressão significativa de EZH2 em CPPC em comparação com amostras de NSCLC, coincidindo com a activação excessiva do E2F /via de Rb. (D) O IHC foi realizada utilizando técnicas convencionais, com um anticorpo anti-EZH2 principal e as imagens foram tomadas a 200 × ampliação. São mostrados exemplos típicos de expressão da proteína EZH2 em epitélio brônquico, carcinóides e tumores SCLC.

em tempo real A análise de PCR dos níveis de transcrição demonstrou um padrão de activação de E2F marcante, como, pelo menos, dois membros de activação de E2F eram sobre-expressa por 10 × seus níveis normais em todas as linhas de células SCLC, enquanto que ARNm Rb1 foi altamente reduzida na maioria das linhas de células SCLC (Figura 1B e Tabela S2). Estes níveis de desregulação são significativamente maiores do que as observadas para um painel de linhas celulares de NSCLC com base em um tailed Mann-Whitney U, suportando a especificidade SCLC destes acontecimentos (SCLC NSCLC vs:

E2F1

P = 0,0034,

E2F2

p = 2.310 × 10

-5,

E2F3

p = 1.744 × 10

-5,

Rb1

p = 0,0078; Figura S2). A desregulamentação dos E2F e Rb1 transcrições é de cortesia aos recentes resultados de Byers et al que detectaram SCLC desregulamentação nível de proteína específica de Rb e E2F1 em um estudo de perfil proteômica da SCLC, NSCLC e linhas de células de pulmão normais [11].

Colectivamente, verifica-se que a via Rb é desregulados, não só através da perda de Rb cópias /função, mas também por meio de ganhos genómicas dos factores de transcrição E2F em CPPC. Tomados em conjunto, isto sugere que a E2F /via de Rb é ativado em todas as amostras de SCLC neste estudo, por qualquer perda de

RB1 ​​

ou copiar ganho de um

E2F

gene membro. Com base em nossa análise de dados externos, isto é verdade em coortes de tumor SCLC clínicos adicionais [5].

A superexpressão do E2F /Rb alvo EZH2

O padrão marcante de E2F /desregulamentação Rb em linhas de células SCLC e tumores levou-nos a examinar genes a jusante dos factores de transcrição E2F. Um dos alvos da via E2F /Rb, que foi recentemente descrito como um oncogene em vários tipos de câncer é

EZH2

. EZH2 é um gene grupo Polycomb (PCG) com um papel no desenvolvimento embrionário e na diferenciação através da regulação epigenética da transcrição de genes críticos para a manutenção de propriedades estaminais-como de células embrionárias e estabelecer a linhagem especificidade [34] – [36]. Ele controla diretamente a metilação do DNA de vários genes-alvo, incluindo

Wnt1, corroborando estudos anteriores em que foram observados vários hits genéticos para encerrar a via WNT em linhas de células SCLC [16], [36]. EZH2 sobreexpressão tem sido observado em muitos subtipos de cancro, incluindo: próstata, da mama, da bexiga, cancro do pulmão de células escamosas e carcinomas hepatocelulares [37] – [44]. No caso de cancro do pulmão de células escamosas, EZH2 expressão foi observada em células displásicas escamosas e tumores, mas não em células epiteliais brônquicas normais, sugerindo

EZH2

activação também pode ser um evento precoce em NSCLC [39]. expressão Além disso, estudos de vários tipos de câncer têm ligado de EZH2 à agressividade, invasão e resistência à cisplatina implicando um papel para EZH2 no comportamento do tumor agressivo [43], [45] – [47]

Em nosso estudo,. análise de EZH2 em NSCLC e linhas de células SCLC expressão revelaram uma notável da hiperactivação em comparação com células SCLC NSCLC (Mann-Whitney U, p = 4,52 x 10

-6; Figura 1C). Os nossos resultados sugerem que EZH2 é, em média, 42 vezes sobre-expresso em linhas SCLC em comparação com 13 vezes sobre-expresso em linhas celulares de NSCLC. Para confirmar se a sobre-expressão de EZH2 também está presente em tumores, analisou-se os dados obtidos de um estudo de matriz de expressão de ADNc independente [13], que perfilada um conjunto separado de 11 linhas de células e um painel de 15 tumores SCLC primário, para além de 12 adenocarcinomas (NSCLC subtipo). Embora os níveis exatos de mudança vezes não eram directamente equivalentes (potencialmente devido a diferenças entre RT-PCR e cDNA microarray faixa dinâmica), a tendência nos níveis de expressão é muito semelhante ao nosso estudo, com significativamente mais elevada expressão de EZH2 em linhas de células SCLC e tumores em comparação com amostras de NSCLC (Figura S2). Isto é consistente com os resultados de Byers et ai, que recentemente observaram um aumento na expressão da proteína EZH2 em linhas de células SCLC [11].

Para confirmar que os níveis de ARNm traduz a um aumento dos níveis de proteína em tumores clínicos, foi realizada em um IHC arranjo de tecido de tumores SCLC, carcinóide e tecidos pulmonares normais e observou aumento da coloração de EZH2 nas amostras de tumor de SCLC (n = 13), comparado com carcinóides, e epitélio brônquico (Figura 1D, Tabela S3). Bracken et al [38] sugeriu que tanto

E2F

amplificação e DNA direta

RB1 ​​

perturbação pode levar a desregulação da expressão de EZH2. O EZH2 significativa sobre-expressão que descrevemos no SCLC não é provável, devido ao baixo nível ganhos no número de cópias que observamos nas linhas de células SCLC e tumores, como os estudos anteriores têm sugerido que, em média, ganho de número de cópias de 2 vezes está associada a um a mudança média de 1,5 vezes nos níveis de ARNm associados [38], [48], o que sugere que a sobre-expressão de EZH2 em CPPC, é principalmente controlada por E2F /interrupção Rb, em vez de alterações no número de cópias directos.

Para avaliar ainda mais a nossa hipótese de que E2F /Rb ruptura leva à activação de EZH2, foram avaliadas as associações entre EZH2 e os níveis de expressão de ARNm de E2F /RB1 em dois conjuntos de dados públicas SCLC. Em um conjunto de dados de microarrays de 56 linhas SCLC, encontramos correlações positivas entre EZH2 e E2F1 (r

2 = 0,3957, p = 0,0013) e E2F2 (r

2 = 0,3124, p = 0,0095), e não há correlações significativas entre EZH2 e E2F3 (r

2 = 0,1689, p = 0,1067) ou RB1 (r

2 = 0,0712, p = 0,6989) (Tabela S4). Em 15 tumores SCLC com dados RNA-sequenciação, observou-se fortes correlações positivas entre EZH2 e E2F1 (r

2 = 0,5179, p = 0,0253) e E2F2 (r

2 = 0,6357, p = 0,0064), e nenhum correlações significativas entre EZH2 e E2F3 (r

2 = -0,1571, p = 0,7166) e RB1 (r

2 = -0,1929, p = 0,2450) (Tabela S4). O fato de que RB1 não foi significativamente correlacionada com a expressão E2F nestes conjuntos de dados provavelmente reflete a baixa expressão global do RB1 através destas amostras, bem como o papel da fosforilação em função RB1, o que não é contabilizado nestes dados. Estes resultados fornecem evidências adicionais de que a ativação de E2F1 e E2F2 está associada à ativação de EZH2.

Efeito da manipulação E2F em EZH2 Expressão

A seguir, realizou experimentos knockdown E2F para avaliar directamente as consequências de E2F modulação dos níveis de expressão de EZH2 em CPPC. knockdowns de E2F1, E2F2 shRNA mediada, e E2F3 mostraram reduções nos níveis de proteína EZH2, encaixando com a nossa hipótese de que E2F modular a expressão de EZH2 em SCLC (Figura S3A). Além disso, foram realizados ensaios sobre-expressão em células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas (HBEC) [49], que são um modelo não-maligna usadas para estudar a patogénese molecular de cancro do pulmão de células não pequenas, uma vez que até à data, não existe qualquer não-maligna modelo neuroendócrino atualmente disponível para avaliar o potencial transformador de genes em um tipo de célula precursora específica SCLC. Observou-se aumento da expressão de EZH2 após indução de E2F2 (Figura S3B). Os efeitos da sobre-expressão de E2F knockdown e sobre os níveis de EZH2 tomadas em conjunto com as correlações positivas que observadas entre E2F e os níveis de expressão de ARNm de EZH2 sugerem que a activação de E2F conduz a um aumento correspondente dos níveis de EZH2. Estas observações suportam a hipótese de que o aumento da expressão de membros E2F leva à ativação EZH2 em SCLC.

Metas

PRC2 são hypermethylated em SCLC

O PCG tem sido de grande interesse em muitos tipos de tumor nos últimos anos , devido ao seu papel na expressão silenciamento transcricional de genes supressores de tumores através de remodelação da cromatina e dirigir a metilação de DNA. PCG proteínas formam complexos de multi-proteínas, que reprimem a transcrição através de modificação pós-tradução das histonas, tri-metilação especificamente de a lisina 27 no histona 3 (H3K27Me3). Uma proporção elevada (50-80%) de genes que são anormalmente epigenetically silenciado por hipermetilação do promotor DNA na maioria dos cânceres humanos são aqueles marcados pela Polycomb repressiva Complexo 2 (PRC2) durante a embriogênese, onde as marcas histonas repressivas funcionar de “desligar” célula destino determinação genes, conferindo capacidades de auto-renovação indiferenciadas de células-tronco embrionárias [50] – [53]. Dado que EZH2 é o membro catalítica crítica do complexo PRC2, ea capacidade do complexo para recrutar as enzimas

de novo

DNA de metilação (DNMT3a /b), estávamos interessados ​​em avaliar se metilação do promotor CpG em SCLC tumores ocorreu preferencialmente em genes marcadas por PRC2 em células estaminais embrionárias. Portanto, analisamos o estado de metilação de genes alvo EZH2-PRC2 em nossas amostras de tumores primários [22]. Os dados estão disponíveis no Gene Expression Omnibus.

Nós encontramos uma proporção enorme de genes alvo de EZH2 e o complexo PRC2 a ser hipermetilado em tumores SCLC em comparação com o epitélio das vias aéreas normais de indivíduos saudáveis ​​(Figura 2). Após a aplicação de critérios de filtragem rigorosas, identificamos 2756 sondas hipermetilado (valor de p 0,05, delta β = 0,2), e 1,372 hypomethylated sondas (valor de p 0,05, delta β = -0,2) em CPPC em relação ao epitélio das vias aéreas saudável células. Dos 3497 sondas associados com genes conhecidos por serem alvos EZH2 de células-tronco embrionárias [22], encontramos 18% (640 sondas) destes genes a ser hypermethylated, em comparação com apenas 3% (93 sondas) hypomethylated em SCLC. Surpreendentemente, genes alvo EZH2-PRC2 representaram 23% de todas as sondas hypermethylated nestes tumores em geral. Em comparação com alvos não PRC2, o enriquecimento de genes alvo PRC2 no nosso conjunto de sonda hypermethylated foi estatisticamente significativa (teste exato de Fisher, p = 2,2 × 10

-16). Estes dados sugerem que, análogo ao trabalhar a partir de vários outros grupos em uma variedade de cancros [50] – [55], CPPC exibir um perfil de hipermetilação do promotor altamente concordante com o padrão de genes silenciados em células estaminais embrionárias pelo complexo PRC2. Propomos que no CPPC, EZH2 superexpressão causada por resultados nível do DNA E2F /Rb via interrupção no recrutamento de enzimas de metilação

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DNA e o estabelecimento de um “células-tronco como” perfil hypermethylator.

valores beta de metilação para 1683 genes alvo de PRC2 H3KMe3 em células-tronco embrionárias são traçados para cada grupo. Estes genes mapeados 1683 3497 sondas Ilumina HM27, dos quais 18% (640 sondas) são hipermetilado e 3% (93) são sondas hypomethylated em tumores SCLC relação às vias aéreas normais. Genes direcionados para H3KMe3 no rato embrionárias células-tronco por EZH2 e o complexo PRC2 são preferencialmente hipermetilado tumores SCLC que fornecem evidências de que EZH2 é funcionalmente activa no CPPC.

EZH2 é necessária para o crescimento rápido em linhas de células SCLC

a seguir, avaliou o potencial oncogénico de EZH2 em SCLC, usando lentivírus mediada knockdowns em duas linhas de células SCLC (H524, HTB175). Ambas as linhas de knockdown demonstraram uma redução notável do crescimento comparado com os controlos vector vazio (t-teste de Student, p 0,05) (Figura 3). Corroborando nossos achados, um estudo recente envolvendo perfilamento proteomic de linhas de células SCLC demonstrado superexpressão de EZH2 em SCLC e demonstrou crescimento reduzido em H69 células sobre knockdown siRNA transitória [11]. As funções pró-proliferativa e anti-diferenciação de EZH2 são consistentes com a apresentação clínica e patológica altamente agressivo e indiferenciada de SCLC. A natureza pró-proliferativa forte de EZH2, também podia explicar parcialmente a tolerância de células SCLC para tais níveis elevados de ARNm de E2F, como algumas proteínas E2F são capazes de funções anti-proliferativas e pro-apoptóticas quando sobre-expressa [15], [28] -. [30], [38]

(a, e) Para confirmar knockdown de EZH2, o RNA foi extraído das linhas transfectadas e qPCR foi realizado. Expressão em linhas de knockdown (E1) é mostrado em relação aos controlos PLKO. (B, F) Confirmação dos níveis de proteína de EZH2 nas linhas de knockdown foi realizada utilizando métodos padrão de mancha Western. Ambos qPCR e Western blot verificaram níveis EZH2 foram reduzidas em mais de 50% em células H524 HTB-175 e sobre knockdown shRNA mediada. (C, D, G, H) para avaliar a viabilidade de

EZH2

knockdown relativamente a células controles foram realizados ensaios MTT. Knockdown de EZH2 causou uma diminuição significativa e reprodutível da viabilidade celular em ambas as linhas de células SCLC (Student t-test, p 0,05).

Conclusões

A partir deste trabalho, propomos que a via E2F /Rb não é interrompido apenas por meio perda ou mutação do Rb, mas também através de DNA ganhos no número de cópias dos fatores de transcrição E2F. Propõe-se que este mecanismo conduz a sobre-expressão específica de vários genes-alvo, incluindo EZH2, que resulta na activação do complexo e promoção de metilação aberrante em CPPC PRC2. Nossas descobertas corroboram estudos anteriores e têm fortes implicações para o tratamento de SCLC.

múltiplas vias mitogénicas, tais como MAPK desregulação também são capazes de dirigir a função de E2F na ausência de visitas a montante específicas em SCLC, tal como o frequente