Abstract

A distribuição de droga nas células é uma variável fundamental importância, mas muitas vezes esquecido, na eficácia da droga. Muitos agentes anti-cancro fracamente básico extensivamente acumulam nos lisossomas ácidas de células normais através de aprisionamento de iões. Lisossomal aprisionamento reduz a actividade de fármacos anti-cancro, uma vez que alvos de drogas anti-cancro estão frequentemente localizadas no citosol da célula ou do núcleo. Algumas células cancerosas têm acidificação com defeito de lisossomas, o que provoca uma redistribuição de drogas aprisionadas dos lisossomas para o citosol. Nós estabelecemos anteriormente que tais diferenças na localização de drogas entre células normais e cancerosas podem contribuir para a aparente selectividade de drogas fracamente básicos às células cancerosas

in vitro

. Neste trabalho, nós testamos se esta selectividade de fármacos à base de distribuição intracelular pode ser optimizada com base na constante de dissociação de ácido (pKa) da droga, que é um dos determinantes da capacidade de sequestração do lisossoma. Nós sintetizados análogos estruturais sete fracamente básicos do inibidor de HSP90 geldanamicina (GDA), com valores de pKa que variam entre 5 e 12. A selectividade de cada análogo foi expressa, tendo proporções de IC anti-proliferativa

50 valores dos inibidores em fibroblastos normais para o IC

50 valores em células HL-60 leucémicas de humano. avaliações selectividade similares foram realizadas num par de linhas celulares de cancro que diferiam no pH do lisossoma como um resultado da alteração mediada por siARN de protões vacuolar expressão da subunidade de ATPase. selectividade óptima foi observada para análogos com valores de pKa próximo 8. tendências semelhantes foram observadas com outros agentes anticancerígenos comerciais com diferentes valores fracamente básicos de pKa. Estas avaliações avançar nossa compreensão de como fracamente propriedades básicas podem ser otimizados para alcançar seletividade máxima droga anticâncer para as células cancerosas com a acidificação lisossômico com defeito

in vitro

. Adicionais

In vivo

estudos são necessários para examinar a utilidade desta abordagem para aumentar a selectividade

Citation:. Ndolo RA, Luan Y, Duan S, Forrest ML, Krise JP (2012) Propriedades Lysosomotropic de fracamente Básico Anticancer Agents Promover Cancer Cell Seletividade

In Vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49366. doi: 10.1371 /journal.pone.0049366

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 01 de junho de 2012; Aceito: 10 de outubro de 2012; Publicação: 07 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ndolo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo NIH conceder CA106655 SR1 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitas drogas anti-cancro sofrem de fraca selectividade para as células alvo, levando a um elevado grau de toxicidade e efeitos colaterais potencialmente com risco de vida; portanto, a quimioterapia é muitas vezes interrompido prematuramente, reduzindo as chances de uma droga alcançar o seu pleno potencial. As drogas anti-cancro normalmente possuem um certo grau de selectividade em relação a células cancerosas intrínseca devido à bioquímica e /ou diferenças metabólicas entre as células normais e transformadas [1] – [3]. A selectividade intrínseca de um agente anti-cancro pode ser ainda melhorada usando uma variedade de abordagens de libertação de fármacos com base na proposta de “bala mágica” de Ehrlich [4], [5]. Todas estas estratégias de segmentação compartilhar um requisito comum, o que é que o agente citotóxico activo deve acumular-se a uma extensão maior ou em torno de células transformadas em relação às células normais. Apesar de inúmeras estratégias criativas foram examinados, tais como estratégias pró-fármaco e conjugados anticorpo-fármaco, a sua utilidade terapêutica tem sido um pouco limitado [6].

A distribuição intracelular de uma droga é uma consideração fundamental importância para a eficácia da droga. As células de mamíferos são amplamente compartimentada, e ambas as drogas e seus alvos podem ter padrões específicos e discretos localização intracelular. Por conseguinte, para o efeito terapêutico pretendido para ocorrer, o sítio da localização intracelular da droga deve ser o mesmo, a um certo grau, como a do fármaco alvo. Nós e outros mostraram anteriormente que as propriedades físico-químicas dos fármacos podem influenciar previsivelmente a sua localização intracelular padrão [7] – [10]. Além disso, mostramos que uma única droga pode ter substancialmente diferentes padrões de localização e tráfego intracelular em diferentes tipos de células [11], [12].

O direcionamento intencional de drogas anticâncer para compartimentos intracelulares em células de câncer representa uma área emergente de exploração [13], [14]. Por exemplo, as mitocôndrias têm um potencial de membrana negativos associados à sua membrana interna, o que foi mostrado para dirigir a acumulação de fármacos com carga catiónica deslocalizada [15]. A este respeito, os derivados de inibidores de Hsp90 têm sido desenvolvidos para explorar esta descoberta e, por conseguinte alvejar seletivamente uma forma mitocondrial de Hsp90 [16].

Em alternativa, muitas drogas fracamente básicas com cargas catiónicas localizados têm demonstrado ser extensivamente sequestradas nos lisossomas ácidas de células através de um mecanismo de iões de aprisionamento, e as propriedades da célula e de drogas que influenciam este foram revistos [17]. Resumidamente, o pH dos lisossomas, em relação ao pH do citosol, é um dos parâmetros fisiológicos importantes que determina o grau de acumulação lisossómica previu [12], [17]. Quanto maior for o gradiente de pH lisossoma-a-citosol, maior será o grau de sequestração é lisossómica. Para muitas aminas, aprisionamento lisossomal tem sido mostrado para ser bastante grande, e é pensado para aproximar a acumulação celular total [18]. Desde alvos de drogas raramente são localizados nos lisossomos, a extensa captura de bases fracas neste compartimento pode reduzir significativamente as interações alvo, reduzindo assim a actividade da droga.

Curiosamente, nós e outros têm mostrado que vários tipos de células cancerígenas têm um lisossômico acidificação defeito [19] – [22]. Em alguns casos, o pH lisossómico de células cancerosas tem sido relatada como sendo 2 unidades de pH superior ao pH do lisossoma de células normais [22]. Esta elevação do pH lisossomal é previsto para ter um profundo impacto sobre a distribuição intracelular de aminas fracamente básicos que são substratos para ião aprisionamento nos lisossomas (agentes lysosomotropic). Especificamente, a concentração de tais drogas irão diminuir nos lisossomas de tais células e concomitantemente aumentar no citosol, bem como em outros compartimentos extralisossômica. Propomos que esta diferença no comportamento de distribuição de drogas irá facilitar um aumento na atividade da droga em células cancerosas em relação às células normais.

Nós estabelecemos anteriormente a base para este medicamento à base de distribuição intracelular (BID) visando plataforma usando tanto

in vitro

e

in vivo

abordagens [12], [23], [24]. Usando células crescidas em cultura, que medida quantitativamente as proporções de concentração lisossoma-a-citosol de fármacos em células com baixo ou elevado de pH do lisossoma. Fracamente medicamentos básicos anticancerígenos foram mostrados para redistribuir a partir dos lisossomos para o citosol quando o pH lisossomal foi elevada. Esta redistribuição intracelular de drogas resultou em citotoxicidade mais pronunciada em relação às células com um pH lisossómico elevada. É importante ressaltar que tais mudanças na distribuição intracelular e toxicidade não foram observadas para fármacos anti-cancerígenos, sem propriedades lysosomotropic. Mais recentemente, foi estabelecida a base para a segmentação de plataforma BID em camundongos, avaliando o grau de toxicidade induzida por drogas em ratos com pH lisossomal baixo ou experimentalmente elevada [24].

Neste relatório, especificamente questionou se o potencial lysosomotropic de um medicamento contra o câncer correlacionada com o grau de seletividade BID. Esta é uma consideração muito importante que poderia guiar o desenho racional de novos agentes anticancerígenos com propriedades que otimizam lysosomotropism e seletividade, portanto, BID, ou a modificação de drogas existentes para transmitir essas propriedades.

Resultados

seleção e síntese de análogos de geldanamicina com uma gama de valores fracamente básicos pKa

Nós temos mostrado previamente que os medicamentos anticancerígenos fracamente básicos com propriedades lysosomotropic exibem maior selectividade para as células cancerosas do que suas contrapartes não-lysosomotropic [12]. No presente trabalho, testamos a previsão de que o potencial lysosomotropic de drogas fracamente básicos se correlaciona com o grau de seletividade diferencial em relação às células cancerosas.

Ao abordar esta questão, consideramos os fatores associados a drogas que são conhecidos por contribuir para lysosomotropism. Todos os substratos para o ião lysosomotropism à base de aprisionamento são fracamente básico, mas nem todas as moléculas são fracamente básicos lysosomotropic. Em seu comentário sobre o assunto, de Duve propôs que duas propriedades independentes associados ao fármaco influenciar o potencial lysosomotropic de uma determinada droga. O primeiro parâmetro é denominado alfa e representa a relação entre a permeabilidade da membrana do lisossoma para o medicamento na sua ionizado contra formas ionizadas. Temos anteriormente estimada experimentalmente alfa para um número de compostos através da medição do coeficiente de partição octanol /tampão como função do pH e correlacionados com estes valores sequestro lisossomal [7]. O segundo parâmetro importante relacionado com a droga é o pKa do ácido conjugado da base. Temos anteriormente estabelecido experimentalmente como pKa de drogas influenciam o sequestro lisossômico em células em cultura [8].

Neste trabalho, optou-se avaliar a influência do pKa na selectividade utilizando inibidores da kD proteína de choque térmico 0 (Hsp90 ) que sistematicamente variado em sua base fraca pKa. Nós escolhemos para modificar a posição 17 da GDA inibidor de Hsp90 para criar derivados com variadas pKa desde os relatórios anteriores tinham mostrado que modificações a esta posição não alterou a actividade [25].

Para ajudar a guiar a nossa selecção de derivados com pKa variando, considerou-se uma relação teórica anteriormente descrita entre pKa base fraca e alfa em relação a lisossoma-a-concentração extracelular [17], a qual é dada pela seguinte expressão.

o ácido conjugado da base fraca constante de dissociação é denotado como K

a, e [H

+] denota as concentrações de prótons (subscrito e representa extracelular e subscrito L representa lisossômico). O termo alfa (α) indica a proporção da permeabilidade da membrana do lisossoma para a base ionizado dividido pelo que as espécies de não ionizada [26]. Usando esta equação, calculou-se a relação teórica lisossoma-a-concentração extracelular de uma série de medicamentos com valores de pKa que variam de 4 a 14. Para os cálculos, utilizou-lisossomal e valores de pH extracelular de 4,4 e 7,4, respectivamente, que são típicos valores para as células normais [27], e um valor alfa de 0,01, o que tínhamos anteriormente medidos para 17 DMAG, um derivado fracamente básico da GDA [12]. Para demonstrar a influência potencial dos alfa no sequestro lisossômico, incluímos parcelas em que este parâmetro é variada. Traçando os rácios de concentração prevista lisossoma-a-extracelular contra pKa deu uma curva em forma de sino, pelo que o grau máximo de sequestração do lisossoma e o pKa a que isto ocorreu foi sensível à magnitude do parâmetro alfa (ver Figura 1). Com base nestas simulações, postulamos que os agentes anticancerígenos que variam de pKa de cerca de 5 a 12 seria adequadamente caracterizar a influência de sequestro lisossomal na selectividade do tumor.

A equação utilizada para estas simulações podem ser encontrados no texto. O pH dos lisossomos e espaço extracelular foram fixados em 4,4 e 7,4, respectivamente. O parâmetro alfa variou conforme indicado.

Por isso, sintetizado um número de análogos fracamente básicos de GDA na tentativa de desenvolver de pequeno conjunto de derivados que tinham valores de pKa abrangendo esta faixa. Os derivados de GDA foram sintetizados como descrito em Materiais e Métodos e caracteriza-se por

1H-RMN (ver texto S1). Os valores de pKa para análogos de 1, 2, 3, 5 e 6 (veja a Figura 2 para estruturas químicas) foram medidos a 37 ° C usando

1H NMR. Para determinar o pKa utilizando este método, os desvios químicos de protões alfa em relação a amina ionizável foram representados graficamente em função do pH, obtendo-se curvas sigmoidais (Figura S1) a partir do qual foi derivado pKa. Para os compostos 4 e 7, de pKa não podia ser medida por

1H RMN devido à solubilidade limitada quer em D

2O e /ou picos de protões mal resolvidas. Portanto, nós relatamos um valor pKa medido anteriormente para o composto 4, que foi obtido usando uma abordagem alternativa [12], e nós relatamos um valor calculado para o composto 7 (ver Materiais e Métodos). O composto 5 tinha dois valores de pKa de 9,9 e 4,2. Apenas o valor de pKa mais elevado é relatado na Figura 2, porque o segundo é demasiado baixo para contribuir teoricamente para ião aprisionamento nos lisossomas. Colectivamente, os valores de pKa para cada um dos derivados variou 5,8-12,4 (Figura 2).

Os sete derivados com diferentes modificações de base fraca na posição 17 de GDA são mostrados. Os valores de pKa para os derivados 1, 2, 3, 5 e 6 foi medido experimentalmente usando RMN de protões (n = 1). O pKa para o composto 4 foi medido experimentalmente em um manuscrito antes (ver resultados). O pKa para o composto 7 foi estimado utilizando o software (ver Materiais e Métodos). A afinidade de ligação para cada um dos inibidores com rHsp90 é mostrado (n = 2), e baseou-se num ensaio de polarização de fluorescência previamente estabelecido (ver Materiais e Métodos).

Para testar adequadamente a influência de base fraca pKa na selectividade, todos os derivados de GDA devem manter alguma capacidade de se ligar Hsp90 e agir como inibidores. Para avaliar isto, avaliou-se a afinidade de ligação de cada um dos derivados de Hsp90 recombinante e comparada com a afinidade de ligação de que a GDA não modificado. As afinidades de ligação foram calculados utilizando um teste de polarização de fluorescência que mede a capacidade dos compostos de teste para deslocar competitivamente GDA conjugado com FITC de Hsp90. Os valores de polarização (mp) foram convertidos em percentagem de controlo (sem fármaco) e representada graficamente contra a concentração dos compostos de teste, dando origem a curvas sigmoidais a partir do qual o IC

50 valor foi determinado por meio de ajuste de curva (Figura S2). O K

i valores foram calculados a partir de IC

50 valores tal como previamente descrito [28] utilizando uma calculadora online (disponível livremente em https://sw16.im.med.umich.edu/software/calc_ki/). O IC calculado

50 para a GDA não derivatizado foi de 230 nm, o que é semelhante aos valores relatados anteriormente obtidos utilizando este ensaio [29]. Uma comparação dos valores de Ki para a GDA e seus derivados sugere que todos eles retêm alguma capacidade para se ligarem a Hsp90 e são, portanto, adequado para as avaliações descritas aqui (Figura 2).

A avaliação da selectividade à base de distribuição intracelular

Para expressar quantitativamente seletividade, nós avaliados comparativamente antiproliferativa

50 valores IC em células normais e cancerosas que tinham baixa e elevada pH lisossomal, respectivamente. Para estas avaliações, que utilizou a linha de células HL60 humanas leucêmicas, o que temos mostrado previamente para ter uma lisossômico pH elevado [22]. Para as células não transformadas, fibroblastos de prepúcio utilizamos humanos normais que anteriormente tinha sido determinado para ter um pH lisossómico de 4,4 [22]. As curvas de citotoxicidade e IC

50 valores obtidos a partir deles são mostrados na Figura S3. Ao dividir o IC

50 determinada em células normais pelo CI

50 em células cancerosas, foi obtida a selectividade global (Figura 3). A GDA inibidor não-lysosomotropic tinha uma selectividade geral na proximidade de dois, o que indica que a GDA foi aproximadamente duas vezes mais activo na linha de células leucémicas como foi nas células normais. Curiosamente, os inibidores fracamente básicos com valores de pKa perto de 8 tinha várias vezes maior actividade nas células leucémicas com pH lisossomal elevada em comparação com células normais. Análogos de GDA que tinham valores de pKa muito acima ou abaixo de 8 não tiveram aumento aparente na seletividade para as células cancerosas em comparação com GDA não derivado. No seu conjunto, a influência de pKa na selectividade tende a produzir uma distribuição em forma de sino que foi semelhante para a trama teórico correlacionando com pKa lysosomotropism (Figura 1).

selectividade geral representa o IC

50 para um derivado em fibroblastos humanos normais, dividido pelo valor obtido nas células leucémicas humanas HL60. As barras representam D.P. ± média. (N = 3); *,

p

. 0,05 em comparação com GDA

A selectividade é multifatorial e qualquer droga contra o câncer de sucesso deve apresentar maior atividade para as células cancerosas em relação a células normais através de mecanismos que não estão relacionados a mudanças no comportamento de distribuição intracelular que são avaliados neste manuscrito [2], [3]. Para diretamente a examinar a selectividade que pode ser especificamente atribuído a mudanças no comportamento de distribuição intracelular entre as células normais e transformadas, considerou-se imperativo para comparar a atividade antiproliferativa de uma determinada droga em duas linhas celulares que são idênticas, mas têm baixa (normal) e elevado (cancro-like) lisossômico pH. Esta abordagem seria mais desejável porque qualquer variabilidade inter-celular em factores que podem influenciar a actividade do fármaco (por exemplo, expressão de transportadores de efluxo de drogas) seria atenuado.

Embora muitas linhas celulares de cancro foram mostrados para ter acidificação defeituoso dos lisossomos, descobrimos que um número de-los a manter lisossomos normalmente acidificadas. Por exemplo, a linha celular de adenocarcinoma da mama MDA-MB-231 mantém um pH lisossómico de 4,2, semelhante ao pH do lisossoma da maioria das células normais [27]. Usando essa linha de células, nós exploramos uma abordagem siRNA para elevar transitoriamente pH lisossomal. Lisossomal pH é regulado pelo ATPase vacuolar de protões (VH

+ – ATPase) [30], e Lu e colaboradores anteriormente mostrado que a redução da expressão de uma subunidade de esta enzima, utilizando siARN, as células produziram com alterada V-ATPase protões bombeamento actividade, com nenhum efeito sobre a proliferação de células [31]. Nós utilizamos uma técnica semelhante para criar células MDA-MB-231 com pH lisossomal elevada. Especificamente, nós como alvo a subunidade V1E1 da V-ATPase para knockdown usando lentiviral vector shRNA. A transferência mediada por lentivírus foi escolhida porque esta abordagem permite a eficiente, de alto rendimento e knockdown estável de proteínas alvo [30]. MDA-MB-231 células que foram tratadas com partículas de lentivírus que contêm não-alvo (scrambled) sequência shRNA retida baixo pH lisossómico e serviu como um controlo importante para quaisquer efeitos não específicos da infecção por lentivírus sobre a viabilidade celular. Knockdown de expressão V1E1 nas células que recebem as partículas virais alvo foi confirmada utilizando análise de Western blot (Figura 4A). Importante, knockdown da subunidade V1E1 conduziu a nenhum efeito discernível sobre o crescimento das células ao longo do tempo do IC

50 avaliações (Figura 4B). Avaliação experimental de pH lisossomal depois de derrubar o V-H

+ – ATPase subunidade mostrou que lisossômico pH foi significativamente elevado de pH 4,4 a pH 5,8 (Figura 4A)

A.. A análise Western blot da expressão da subunidade V1E1 é mostrada junto com o controle de actina carregamento. Experimentalmente determinados valores de pH do lisossoma em não tratada, mexidos células é mostrada (os valores representam a média ± DP, n = 3) B. V-ATPase subunidade knockdown não altera a taxa de crescimento de células MDA-MB 231 e shRNA- V1E1 shRNA-tratada . Os círculos a cheio representam células tratadas com o vector shRNA mexidos e os círculos abertos representam as células tratadas com o V-ATPase V1E1 shRNA. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 3 x 10

5 células /cavidade em uma placa de 6 poços e foram tratadas com tripsina, contadas e plaqueadas de novo a cada 24 horas durante 3 dias (os pontos de dados representam a média ± DP, n = 3).

a seguir, foi avaliado o IC

50 dos inibidores de Hsp90 em ambos os tipos de células (Figura S4) e calculada seletividade como IC

50 em MDA-MB-231 com baixo pH lisossomal dividida pela CI

50 em células MDA-MB-231 com pH lisossomal elevada. Consistente com as nossas expectativas, a actividade de GDA não lysosomotropic não foi influenciada pelo estado da célula lisossomal pH e, portanto, não tinham selectividade BID aparente (isto é, valor de selectividade BID perto de um, ver Figura 5). As tendências em termos de selectividade BID como uma função da Hsp90 inibidor pKa seguido um perfil em forma de sino semelhante assim como os resultados globais selectividade mostrados na Figura 3. Além disso, as comparações da magnitude do BID com selectividade global sugerem que BID selectividade é um importante contribuinte factor a a selectividade global destes agentes.

selectividade BID é definido como o IC

50 em MD-MB-231 tratadas com shRNA mexidos, que têm baixo pH lisossómico, dividida pelo valor obtido a partir de a mesma linha de células tratadas com shRNA contra a subunidade V1E1 da ATPase vacuolar de protões, que têm elevado pH do lisossoma. As barras representam D.P. ± média. (N = 3); *,

p

. 0,05 em comparação com GDA

Os resultados anteriores são consistentes com a noção de que os inibidores da Hsp90 com propriedades lysosomotropic óptimas (isto é, valores de pKa perto 8) possuirá o maior grau de selectividade em relação às células transformadas BID. Para melhor avaliar isso, foi avaliada a seletividade do BID de classes adicionais de agentes anticancerígenos que fazem ou não possuam propriedades lysosomotropic.

A mitoxantrona e daunorubicina são agentes anticancerígenos fracamente básicos que têm alvos nucleares e valores de pKa perto de 8 [32 ], que deve promover lysosomotropism e seletividade do BID. Alternativamente, o anti-metabolito 5-fluorouracilo é fracamente ácido, com um pKa de 8 [33], e assim não é considerado um substrato para aprisionamento de iões ácidas nos lisossomas. 5-Fluorouracil deve, por conseguinte, não têm uma distribuição intracelular nem a actividade que é influenciado pelo estado de uma célula o pH lisossómico. Do mesmo modo, os agentes anti-cancerígenos que são zwitteriónico, com ambos os grupos fracamente ácidas e fracamente básicos, tais como clorambucil [34], não são lysosomotropic e não deve apresentar selectividade BID. Consistente com o nosso raciocínio, os agentes anti-cancro sem lysosomotropic 5-fluorouracilo e clorambucil tinham valores de selectividade BID perto de um, semelhante à GDA (Figura 6). Alternativamente, os agentes lysosomotropic mitoxantrona e daunorrubicina ambos mostraram graus significativos, mas diferentes de selectividade BID (Figura 6). As curvas de citotoxicidade para destas avaliações são apresentados na Figura S5.

mitoxantrona e daunorubicina são fracamente básico com valores de pKa perto de 8 e possuem selectividade significativa BID. agentes anti-cancro sem lysosomotropic 5-fluorouracilo e clorambucil têm valores de selectividade BID próximos 1, o que demonstra que a sua actividade não é influenciado pelo pH do lisossoma. As barras representam D.P. ± média. (N = 3).

Discussão

Neste estudo nós temos, pela primeira vez, sistematicamente investigados como o pKa de fracamente básicos influências agentes anticancerígenos o grau de seletividade BID direção células cancerosas com pH lisossomal elevada. Propomos que a droga BID visando plataforma apresenta uma mudança de paradigma na abordagem da concepção de novos agentes anticancerígenos com melhorada e otimizada seletividade para células tumorais. Tradicional SAR abordagens para melhorar o foco seletividade principalmente na concepção de drogas com maior potência contra células cancerosas, com pouca atenção para a actividade da droga em células normais. A maioria das abordagens baseadas na entrega de drogas que tentam aumentar a selectividade dependem de tumor específico acumulação do fármaco /entrega, o que provou ser bastante desafiador e difícil de alcançar. A abordagem drug targeting BID descrito aqui permite que a droga a distribuir-se igualmente a ambas as células normais e transformadas; no entanto, o índice terapêutico de drogas é alargado por propositadamente projetar a droga ter desfavoráveis ​​propriedades de distribuição intracelular em células normais, reduzindo assim a actividade do medicamento nestas células.

O nosso estudo anterior tinha estabelecido que as moléculas lysosomotropic teve seletividade BID mensuráveis, mas não ficou claro se o grau de lysosomotropism correlacionada com o grau de selectividade BID. Nossa principal hipótese para este estudo foi que agentes anticancerígenos com propriedades lysosomotropic ideais teriam seletividade BID ideal. Nós inicialmente utilizada princípios de iões de armadilhagem para estabelecer teoricamente as relações entre propriedades fraca base de drogas, especificamente permeabilidade (alpha) e pKa, e sequestro lisossômico (veja a Figura 1). Estes cálculos foram revelando e sugeriu que as moléculas fracamente básicos com baixo alfa e pKa perto ou acima da neutralidade teria propriedades lysosomotropic ideais

As nossas previsões teóricas ilustram que o parâmetro alpha permeabilidade representa um importante preditor de sequestro lisossômico.; No entanto, isso não é um parâmetro físico que pode ser racionalmente e sistematicamente alterado para testar a relação entre a selectividade e lysosomotropism BID. Temos anteriormente estimada experimentalmente alfa através da medição do coeficiente de partição octanol /água como uma função do pH e descobriu que quer moléculas tendem a ter parâmetros alfa perto de zero ou perto de uma [7]. Embora alfa pode variar de zero a um, os nossos previsões teóricas revelou que as variações relativamente pequenas nos valores de alfa perto de zero teve um profundo impacto sobre a relação entre a base fraca pKa e a magnitude de sequestro lisossomal (Figura 1). É actualmente claro que as características estruturais podem ser responsáveis ​​por estas perturbações menores no parâmetro alfa (ou seja, 0,01 versus 0,001).

Ao contrário do parâmetro alfa, pKa representa uma propriedade física que pode ser racionalmente modificado para testar a relação entre lysosomotropism e selectividade. Para investigar sistematicamente a influência de uma base fraca selectividade no pKa BID, sintetizamos uma pequena biblioteca de análogos de GDA gerados através da modificação GDA na posição 17. Estes análogos GDA foram particularmente bem adequada para uma tal aplicação, porque numerosos análogos sintéticos formados por modificações nesta posição têm mostrado manter a sua capacidade de se ligar com e inibir a Hsp90 [25]. Além disso, o GDA tem um alvo citosólica, e, por conseguinte, a actividade de análogos de GDA deve ser sensível a alterações na sequestração do lisossoma. Sintetizámos análogos fracamente básicos de GDA com valores de pKa que variam 5,8-12,4, e observou-se que todos eles pareciam reter alguma capacidade para se ligarem rHsp90 como GDA não modificada (Figura 2). É importante notar que as diferenças na afinidade de ligação a Hsp90 intrínseca entre os vários derivados podem de facto influenciar a magnitude de um IC

50 valor observado experimentalmente em uma única linha de células; no entanto, estas diferenças não devem influenciar teoricamente nossas comparações seletividade apresentados nas Figuras 3 e 5. Isto é porque nós relatamos a proporção de IC

50 valores para uma única droga em células com baixa ou elevada pH lisossomal, factoring, assim, quaisquer diferenças na actividade intrínseca que possa estar presente.

Uso de shRNA para criar variantes de linhas celulares de MDA-MB-231 que diferiam do pH lisossomal representa uma ferramenta valiosa para testar directamente BID selectividade. Em nossas avaliações publicadas anteriormente, utilizamos comparativos IC

50 avaliações em duas linhas de células diferentes, com pH lisossomal baixa ou elevada [12]. Além disso, utilizou-se um modulador farmacológico do pH lisossomal (i.e., cloreto de amónio) para atingir lisossomal elevação do pH. Ambas estas abordagens possuem limitações devido as diferenças de citotoxicidade podia ser atribuído às diferenças nas linhas de células ou para a adição do modificador de pH e não especificamente para as diferenças no pH do lisossoma.

O análogo de GDA com um medido pKa de 8,1 foi encontrado para ter o máximo grau de seletividade BID. análogos GDA com valores de pKa bem acima ou abaixo de 8 mostraram seletividade mínima, o que é consistente com a noção de que lysosomotropic potenciais correlatos com seletividade BID. Para avaliar a selectividade global dos análogos de GDA, comparou-se a relação de CI

50 valores em fibroblastos normais versus em células HL-60 leucémicas, que foram mostrados como tendo elevado pH lisossomal [22]. Curiosamente, a tendência na selectividade global dos análogos de GDA foi semelhante em aparência e magnitude com os resultados de seletividade do BID. Esta constatação sugere que a seletividade BID pode representar um importante factor de seletividade global.

Para melhor avaliar a influência de lysosomotropism na selectividade do BID, que sondou a correlação usando agentes anticancerígenos actualmente disponíveis que tinham estruturas diferentes, alvos intracelulares e mecanismos de acção das dos inibidores de Hsp90 previamente avaliadas (Figura 5). Consistente com nossa hipótese, a agentes anti-cancro sem lysosomotropic 5-fluorouracilo e clorambucil não apresentam selectividade apreciável BID. Em contraste, agentes anticancerígenos fracamente básicos com valores de pKa perto de 8 foram encontrados para possuir selectividade BID. Especificamente, a mitoxantrona drogas fracamente básico e daunorrubicina, os quais têm valores de pKa de 8,1 e 8,4, respectivamente, foram ambos encontrados a possuir graus significativos de selectividade BID. É interessante notar que a daunorrubicina tinha uma selectividade significativamente mais elevada do que BID fez mitoxantrona. Isto poderia ser atribuído ao facto de que o pKa da daunorubicina é um pouco maior do que o pKa da mitoxantrona e que relativamente pequenas alterações na pKa pode traduzir-se em aumentos significativos na selectividade relativamente BID. É também plausível que pode haver pequenas variações na alfa parâmetro de permeabilidade para estes dois compostos que podem resultar em alterações dramáticas no lysosomotropism como foi determinado teoricamente (Figura 1). Para além destes fármacos, numerosos outros agentes anti-cancro clinicamente aprovados podem ser classificados como moléculas básicas fracamente. Para nosso conhecimento, não há atualmente nenhuma evidência clínica para apoiar a noção de que suas propriedades fracamente básicos contribui para a sua seletividade observada.

É importante ressaltar que a plataforma de segmentação de drogas BID descrito aqui não vai ser universalmente aplicável a todos os tipos de câncer. Um pré-requisito óbvio para a aplicação com sucesso é que as células cancerígenas têm um defeito lisossomal acidificação. Nós e outros autores mostraram que muitos tipos de células de cancro diferentes têm pH lisossomal defeituoso [19] – [22]; No entanto, como já ilustrado neste manuscrito, algumas células cancerosas, tais como a linha celular de MBA-MB-231, têm valores de pH do lisossoma que são semelhantes àqueles em células normais.