Abstract

Fundo

Este estudo teve como objetivo elucidar significado clínico da quinase de linfoma anaplásico (

ALK

) rearranjo no cancro do pulmão de não pequenas células avançado selecionado (NSCLC) , para comparar a aplicação de diferentes métodos de detecção ALK e, principalmente, avaliar uma possível associação entre a expressão ALK e os resultados clínicos em pacientes tratados com crizotinibe.

métodos

Estado da ALK foi avaliada por fluorescência

in situ

fluorescente (FISH), imuno-histoquímica (IHQ) e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) em 173 doentes com NSCLC avançados seleccionados. Dados clínico-patológicas, estado genótipo e os resultados de sobrevivência foram analisados. Além disso, a associação de expressão ALK com os resultados clínicos foi avaliada em ALK pacientes tratados com Crizotinibe PEIXES-positivos, incluindo dois pacientes com receptor do factor de crescimento epidérmico concorrente (

EGFR

) mutação.

Resultados

A taxa de detecção de positividade da ALK rearranjo por FISH, IHC e qRT-PCR foi de 35,5% (59/166), 35,7% (61/171) e 27,9% (34/122), respectivamente.

ALK

rearranjo foi observada predominantemente em pacientes jovens, nunca ou luz fumantes e adenocarcinomas, especialmente com características de células em anel de sinete e pobre diferenciação. sobrevida livre de progressão mediana (PFS) dos doentes tratados com Crizotinibe foi de 7,6 meses. A sobrevida global (OS) destes pacientes foi maior em comparação com a de coortes Crizotinibe-ingênuos ou de tipo selvagem, mas não houve diferença significativa no sistema operacional em comparação com pacientes com

EGFR

mutação. expressão ALK não associar PFS; mas, quando a expressão ALK foi analisada como uma variável dicotômica, expressão ALK moderada e forte, teve uma diminuição do risco de morte (

P

= 0,026). Os dois pacientes com concomitante

EGFR

e

ALK

alterações mostrou diferença na expressão ALK, resposta a inibidores do EGFR e ALK, ea sobrevida global.

Conclusões

enriquecimento selectivo de acordo com características clínico-patológicas em pacientes com NSCLC pode altamente melhorar a taxa de detecção de positividade do

ALK

rearranjo para terapia alvo-ALK. IHC poderia fornecer mais pistas para a concepção de ensaios clínicos e estratégias terapêuticas para pacientes com NSCLC ALK-positivos, incluindo pacientes com aberração genética dupla de

ALK

e

EGFR

Citation:. Zhang NN, Liu YT, Ma L, Wang L, Hao XZ, Yuan Z, et al. (2014) A Detecção Molecular e relevância clínica da

ALK

Rearranjo em Selected avançada Non-Small Cell Lung Cancer: ALK Expression fornece insights sobre ALK terapia-alvo. PLoS ONE 9 (1): e84501. doi: 10.1371 /journal.pone.0084501

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 27 de agosto de 2013; Aceito: 14 de novembro de 2013; Publicação: 03 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiamento: este estudo foi apoiado em parte por doações do Fundo especial de Investigação para Pública Indústria do Bem-Estar da Saúde (200902002-1), Nacional de Ciência e Tecnologia Projeto major (2008ZX09312, 2012ZX09303012), Pesquisa Nacional de alta Tecnologia e do Programa de Desenvolvimento da China (2011AA02A110), Pequim Municipal de Ciência e Tecnologia da Comissão (Z121107005112005, Z121102009212055), fundos especiais para Autoridade Central de Saúde (B2009B124) e grande programa de pesquisa do Instituto de Câncer e Hospital da Academia chinesa de Ciências Médicas (LC2012A18). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O progresso em técnicas moleculares proporciona uma melhor identificação e compreensão de marcadores moleculares que podem ter valor prognóstico e pode dirigir decisão terapêutica fazer para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Na última década, um subconjunto de doentes com NSCLC com o receptor do factor de crescimento epidérmico (

EGFR

) mutação tem atraído muita atenção por causa das altas taxas de resposta aos inibidores de tirosina-cinase de EGFR (EGFR-TKI) [1]. Em 2007, um gene de fusão da quinase de linfoma anaplásico (

ALK

) com a proteína associada a microtúbulos equinodermos como 4 (

EML4

) em NSCLC foi identificado pela primeira vez por Soda

et al

. [2], e logo se tornou um alvo molecular inovador para o tratamento do câncer de pulmão. experiências bem sucedidas de terapia-alvo EGFR têm fornecido um modelo de referência para o progresso da pesquisa rápida de

ALK

rearranjo. Crizotinibe (ALK /MET inibidor /ROS1) foi o primeiro agente clinicamente disponíveis, que mostrou actividade anti-tumoral em doentes com NSCLC notável avançada ALK-positiva. Recentemente, a seleção de pacientes com rearranjo ALK para o tratamento crizotinib se tornou um padrão nos EUA, União Europeia, China, Japão e outros países. Mais importante ainda, outros inibidores da ALK foram sucessivamente participaram em ensaios clínicos [3] e promissor para marcar uma nova página de desenvolvimento de medicamentos orientada para o genótipo para câncer de pulmão.

A frequência de

ALK

rearranjo faixas de 3% a 7% em doentes com NSCLC não seleccionados, que pode chegar a 13% ~ 18%, se a população de doentes é seleccionado de acordo com características clinicopatológicas específicos, especialmente em jovens, nunca, ou fumantes leves com adenocarcinoma [4], [5 ], [6], [7], [8], [9]. Além disso,

ALK

rearranjo foi mutuamente exclusivo com

EGFR Comprar e

KRAS

mutações. No entanto, as características acima mencionadas não são compartilhados por todos os

ALK

rearranjo operadoras.

ALK

fusão também foi encontrada em pacientes mais velhos, os fumantes [4], os pacientes com

EGFR

mutação [10], [11], [12] e não-adenocarcinoma histológicos subtipos, tais como carcinoma adeno-escamoso e carcinoma de grandes células [3], [13]. Portanto, as características clínico-patológicas são insuficientes para triagem de pacientes e teste molecular é necessário para determinar o status ALK [14].

quantitativo em tempo real reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR), imunohistoquímica (IHC) e fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) são os actuais métodos de escolha para testes de ALK. No entanto, cada método tem as vantagens e as desvantagens específicas. Não há consenso aceita sobre qual método é preferível. QRT-PCR pode detectar

ALK

rearranjo ao nível mRNA e definir tanto

ALK

parceira de fusão e fusão variante, mas precisa de alta qualidade do RNA e não pode detectar desconhecido

ALK

rearranjos. Além disso, há uma série de

EML4-ALK

variantes e não

EML4-AL

fusões K em NSCLC [15]. Portanto, qRT-PCR não é amplamente utilizado na detecção de

ALK

rearranjo. FISH é o método padrão atual para detectar

ALK

rearranjo, uma vez que pode detectar inversão e translocação, independentemente da

EML4-ALK

variantes gene de fusão e outros parceiros de fusão. É importante ressaltar que todos os ensaios clínicos que demonstraram a eficácia do crizotinib para

ALK

-positivo pacientes com NSCLC foram baseadas no teste FISH quebrar-apart Vysis /Abbot ALK. No entanto, o peixe é dispendioso, demorado e difícil de interpretar. Então FISH pode não ser prático para a triagem de todos os pacientes NSCLC. IHC é mais rápido, mais econômico e mais amplamente disponível. Além disso, IHC com novos anticorpos e protocolos modificados alargou a sua gama útil para testes de ALK. Várias recomendações publicadas [16], [17] sugeriu que a análise ALK FISH pode ser realizada apenas em casos IHC-positivos. No entanto, os protocolos IHC padrão e critérios de pontuação são escassos, ea correlação entre a expressão ALK e os resultados clínicos ainda não foram confirmados para verificar a precisão do IHC.

espécimes Portanto, este estudo recolhidos no início da triagem de pacientes para crizotinibe ensaios clínicos (PERFIL 1005 ou perfil 1014) e status ALK avaliada utilizando FISH, IHC e qRT-PCR. características clínico-patológicas e resultados clínicos de acordo com os regimes específicos de genótipo e terapêuticos foram analisados ​​com o objetivo de elucidar o significado clínico da

ALK

rearranjo em pacientes com NSCLC avançado selecionados. Além disso, comparamos a aplicação de diferentes métodos de detecção ALK e, especialmente, verificar uma possível associação entre a expressão ALK e os resultados clínicos em pacientes tratados com Crizotinibe FISH-positiva ALK.

Materiais e Métodos

Estudo da População e Recolha de dados

Os espécimes foram coletados de 173 pacientes com NSCLC não-escamosas avançado que foram destinadas a sofrer rastreio ALK para ensaios clínicos crizotinibe (perfil 1005 ou perfil 1014) a partir de janeiro de 2011 a outubro de 2012. Todos os pacientes receberam tratamento ou consulta a partir de Cancer Institute e Hospital da Academia chinesa de Ciências Médicas e Peking Union Medical College e consentimento informado assinado para análise molecular futuro. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards da Academia Chinesa de Ciências Instituto Médico e Hospital do Câncer.

Os registros médicos de todos os pacientes foram revistos para coletar informações demográficas, clínicas e patológicas. Histologia foi avaliada com base nos critérios da Organização Mundial de Saúde Classificação de tumores de pulmão [18] e a classificação multidisciplinar IASLC /ATS /ERS de adenocarcinoma de pulmão [19]. Gravamos

EGFR

estado de mutação dos pacientes, que havia sido determinada usando um método de sequenciação bidireccional de

EGFR

exons 18 a 21. Nós também examinados regimentos tratamento e resultados clínicos. sobrevida livre de progressão (PFS) foi calculado a partir do início do crizotinib à doença documentada progressiva (PD) ou morte por qualquer causa. Para melhor elucidar as influências de-genótipos específicos e terapêuticos regimes sobre a sobrevida global dos pacientes (OS), foram analisados ​​dois tipos de OS. OS1 e OS2 foram, respectivamente, definido como o tempo desde o diagnóstico inicial de NSCLC e de consentimento informado assinado até a morte por qualquer causa. OS1 foi abrangente, mas mais influenciados pelos tratamentos anteriores. OS2 foi mais específico para esclarecer os efeitos da crizotinib no tratamento de

ALK

-positivo avançada NSCLC.

Test ALK

As amostras foram testadas por IHC, FISH e qRT-PCR. FISH foi realizado com o FDA aprovou o kit sonda ALK (Vysis LSI ALK dual-cor, quebra-apart sonda rearranjo; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) e analisados ​​de acordo com as instruções do kit. ALK IHC foi realizada de acordo com os protocolos fornecidos pelo anticorpo (D5F3, Cell Signaling Technology) fabricante. De modo semelhante aos estudos anteriores [20], [21], os resultados foram pontuados como IHC 0 quando nenhuma coloração específica era evidente dentro de um tumor; 1+, intensidade de coloração fraca em células de tumor mais de 10%, sem qualquer coloração de fundo; 2+, intensidade de coloração moderada; 3+, intensidade de coloração forte. Os casos com tecidos suficientes foram extraídos a partir de ARN total de amostras fixadas com formalina e embebidos em parafina (FFPE) utilizando RNeasy FFPE kit (Qiagen, Alemanha). Para a detecção de EML4-ALK, o ARNm foi primeiro transcritos de modo inverso em ADNc e de qRT-PCR foi realizada com um kit de EML4-ALK comercial (Amoydx, China), incluindo nove variantes conhecidas (A20, E13; A20, E6a /6b; A20 , E20; A20, E15; A20, E14; A20, E18; A20, E2; A20, E17;.. A20) sobre a real-Time PCR System ABI 7500 (Applied Biosystems, EUA)

Análise estatística

teste do qui-quadrado de Pearson, teste exato de Fisher ou teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para análise estatística das variáveis, conforme o caso. A abordagem de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar PFS e OS, ea diferença entre os grupos foi comparadas pelo teste de log-rank. A taxa de risco (HR) foi estimada pela regressão de riscos proporcionais com um intervalo de confiança de Wald 95% (IC 95%). A análise dos dados foi feita com SAS versão 9.2, a significância estatística foi definida como dois lados

P

-VALOR. 0,05

Resultados

Detecção ALK Resultados

cento e trinta e dois ressecados e quarenta e um espécimes biopsiados foram analisados ​​tanto pelo IHC e FISH; no entanto, não houve resultados IHC interpretáveis ​​foram obtidos para dois pacientes e não houve resultados PEIXES interpretáveis ​​para sete pacientes. QRT-PCR foi realizada com sucesso em 122 espécimes. ALK alteração foi encontrada em 35,5% (59/166), 35,7% (61/171) e 27,9% (34/122) amostras por FISH, IHC e qRT-PCR, respectivamente. Os detalhes dos resultados de detecção de acordo com os três métodos estão resumidos na Tabela 1.

Características dos pacientes e os resultados clínicos acordo com subtipos moleculares

Dos 166 pacientes com NSCLC avançado que estavam sido submetido com êxito triagem ALK por FISH, 59 abrigou

ALK

rearranjo incluindo dois (3,4%, 2/59) pacientes com concomitante

EGFR

mutação, 20 mostrou

EGFR

mutação, 87 eram do tipo selvagem com

ALK

-negative e

EGFR

-negative ou

EGFR

-Desconhecido (tipo selvagem coorte, WT). Os pacientes com maior probabilidade de abrigar

ALK

rearranjo eram jovens, nunca ou luz fumantes com adenocarcinoma pouco diferenciado, especialmente com características celulares anel de sinete, comparando com o

EGFR

mutação ou tipo selvagem coorte (Tabela 2 ). Os dois pacientes com concomitante

ALK

rearranjo e

EGFR

mutação foram analisados ​​separadamente devido à baixa incidência.

Nos 59 pacientes com FISH-positiva

ALK

rearranjo, 45 receberam crizotinib no ensaio de fase II clínica (PERFIL 1005), 8 foram incluídos no ensaio de fase III clínica (PERFIL 1014) e 6 não participaram de um ensaio clínico. Por causa do efeito de cruzamento de pemetrexed e crizotinib em fase III de ensaios clínicos, oito pacientes foram excluídos por análise de sobrevivência. Os outros 158 pacientes foram agrupados em quatro tipos:

ALK

positiva com tratados com crizotinib (n = 45),

ALK

positiva com crizotinib-naive (n = 6),

EGFR

mutação com TKI-tratado (n = 20) e de tipo selvagem (n = 87). As características basais, tratamentos clínicos e os resultados são apresentados na Tabela 3.

ALK

-positivo grupo mostrou uma distribuição etária dramaticamente mais jovem do que qualquer outro grupo, recebeu mais linhas de terapia do que

EGFR

grupo mutação (. mediano, 2,9

vs

1,8;

P

= 0,025) e tinham mais pacientes receberam quimioterapia pemetrexed que o grupo de tipo selvagem (

P

= 0,020).

ALK

-positivas pacientes com e sem tratamento crizotinib tiveram diferença estatisticamente significativa em ambos os OS1 (mediana, 39,7

vs.

8,8 meses,

P

= 0,003) e OS2 ( . mediano, 22,0

vs

1,8 meses,

P Art 0,001). Não houve diferença significativa entre o

ALK

-positivo com o grupo tratado com crizotinib e

mutação EGFR com o grupo tratado com TKI tanto em OS1 e OS2 (

P

= 0,249 e

P

= 0,896, respectivamente). Além disso,

ALK

-positivo com os pacientes tratados com crizotinib tinha mais OS2 do que os pacientes do tipo selvagem (mediana de 22,0

vs.

14,2 meses,

P

= 0,014), mas não houve diferença significativa no OS1 entre essas duas coortes (39,7

vs.

38,7 traças,

P

= 0,294) (Figura 1).

a, B, C, sobrevivência global calculada a partir do diagnóstico (OS1); D, E, F, sobrevida global calculada a partir do consentimento informado assinado no momento de triagem (OS2). WT: pacientes com ALK negativo e EGFR-negativos ou EGFR-desconhecido;