Abstract

Fundo

variantes genéticas em genes do metabolismo receptor nicotínico e álcool têm sido associados com propensão para fumar tabaco e beber álcool, respectivamente, e também implicado na susceptibilidade genética para câncer de cabeça e pescoço. Além de fumo e álcool, tabaco de mascar é um importante fator de risco de câncer oral, na Índia. Não se sabe se estas variantes genéticas influenciam a propensão ou suscetibilidade ao câncer bucal no contexto desta etiologia distinta.

Métodos

Nós examinados 639 casos orais e câncer de faringe e 791 controles de dois caso- estudos de controle realizado na Índia. Nós investigamos seis variantes conhecidas para influenciar a dependência da nicotina ou o metabolismo do álcool, incluindo rs16969968 (

CHRNA5)

, rs578776 (

CHRNA3)

, rs1229984 (

ADH1B

), rs698 (

ADH1C

), rs1573496 (

ADH7

) e rs4767364 (

ALDH2

).

resultados

O

CHRN

variantes foram associados com o número de mascar eventos por dia, inclusive naqueles que mascava tabaco, mas nunca fumaram (P = 0,003, P = 0,01 para rs16969968 e rs578776 respectivamente). Presença do alelo variante contribuiu para diferença de aproximadamente 13% na mastigação frequência em comparação com não-portadores. Enquanto não foi observada associação entre rs16969968 eo risco de câncer oral (OR = 1,01, 95% CI = 0.83- 1.22), rs578776 foi modestamente associado a um 16% menor risco de câncer oral (OR = 0,84, 95% CI = 0.72- 0,98 ). Houve pouca evidência de associação entre polimorfismos em genes que codificam o metabolismo do álcool e câncer bucal nessa população.

Conclusão

A associação entre rs16969968 e número de eventos de mascar implica que o efeito sobre a propensão de fumar conferida por este gene variante se estende ao uso de tabaco sem fumaça

Citation:. Anantharaman D, Chabrier a, Gaborieau V, Franceschi S, Herrero R, Rajkumar T, et al. (2014) variantes genéticas em dependência da nicotina e álcool Metabolismo Genes, Oral Cancer Risk e a propensão a fumar e beber álcool: Um estudo de replicação na Índia. PLoS ONE 9 (2): e88240. doi: 10.1371 /journal.pone.0088240

editor: Qing-Yi Wei, Cancer Institute, Duke, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de outubro de 2013; Aceito: 08 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Anantharaman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. The International estudo de câncer oral foi financiado pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o câncer. O estudo Mumbai foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (BT /PR 2277/09/333/2000). O Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial subvenção financiada analisa o laboratório para este estudo (R03 DE020116). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação deste manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os cânceres da cavidade oral e faringe contribuir para cerca de 400.000 novos casos por ano no mundo, mais de metade dos quais ocorrem na Índia. Cada ano mais de 200.000 morrem da doença, e mais de um terço destas mortes ocorrem na Índia [1]. O uso do tabaco eo consumo de álcool são os principais factores de risco estabelecidos para câncer oral, com o uso de tabaco sem fumaça sendo particularmente importante na população indígena [2]. A exposição ao vírus do papiloma humano está se tornando cada vez mais importante para os cânceres de orofaringe [3], [4].

Estudos de associação

Genome-larga (GWAS) identificaram com sucesso a doença susceptibilidade loci para várias doenças complexas [5]. O câncer de pulmão GWAS e estudos da dependência da nicotina ter identificado o 15q25 lócus abrigar o receptor de acetilcolina nicotínico (

CHRN)

gene cluster [6] – [8]. Estes genes codificam para receptores expressos em neuronal e outras células epiteliais que se ligam-se a derivados de nicotina e adesivos de nicotina [9], [10]. Dois

CHRN

subunidade do receptor variantes, rs16969968 e rs578776 têm sido consistentemente associada com o risco de câncer de pulmão e tabagismo em várias populações [11] – [15]. portadores homozigóticos dos alelos raros rs1669968 têm sido relatados para fumar cigarros mais cerca de 1,2 por dia [13]. Além disso, esta variante também tem sido associada a um risco aumentado de câncer de Alta Aero-Aparelho digestivo (VADS). VADS câncer GWAS e candidatos estudos de associação genética identificaram variantes genéticas no 4T (rs1229984, rs698, rs1573496) e loci 12q (rs4767364) contendo genes envolvidos no metabolismo do álcool [16], [17]. O equilíbrio entre as actividades de desidrogenase de álcool e aldeído desidrogenase tem sido sugerido para regular as concentrações de acetaldeído no sangue que determinam os sintomas desagradáveis ​​associados com o consumo de álcool, afectando, assim, a capacidade de consumir álcool e, potencialmente, o risco de cancro [18], [19]. Os genes de álcool e aldeído desidrogenase (

ADH e ALDH,

respectivamente) têm sido associados com cabeça e risco de câncer de garganta [16], [17], [20]. Embora o álcool é um fator de risco importante e estabelecido para o câncer bucal na Índia [21] – [24], há uma escassez de dados sobre a associação de

ADH

e

ALDH2

variantes neste população.

neste estudo objetivou-se (i) determinar se a associação entre o

CHRN

variantes e propensão ao fumo estende-se a formas não-fumadores do uso do tabaco (ii) examinar se

CHRN

genética variantes influenciam a susceptibilidade ao risco de câncer oral na Índia, (iii) esclarecer a associação entre as possíveis variantes causais no 4q23 (

ADH) Comprar e 12q (

ALDH2)

lócus eo risco de câncer oral na Índia.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o consentimento informado foi obtido de todos os participantes. O estudo multicêntrico IARC foi aprovada de forma centralizada pela Comissão de Ética Cancer Institute em Chennai, na Índia e no estudo global foi aprovada pelo IARC Ética Comitê de Revisão da Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC), Lyon, França. O estudo Mumbai foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital da Tata Memorial Hospital Cancer Research Institute em Mumbai, Índia |

Estudo descrição

A análise utilizada presentes processos e controles de dois estudos realizados anteriormente na Índia:. Estudo multicêntrico câncer bucal Internacional (estudo IARC), ea estudo de Mumbai. O estudo da IARC foi coordenado pela Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC) em nove países durante 1996 a 1999. O estudo recrutou casos e controles de três centros em toda a Índia, incluindo Bangalore, Chennai e Trivandrum. Os casos foram histologicamente ou patologicamente confirmada cânceres primários da cavidade oral e orofaringe. controles de base hospitalar, um para cada frequência caso pareados por idade (período de 5 anos), sexo e Centro foram recrutados. A taxa global de participação no estudo foi de 93%, detalhes foram descritos noutro local [25] – [27]. O estudo Mumbai foi realizado pelo Instituto de Pesquisa do Câncer, Centro Avançado de Atendimento, Pesquisa e Ensino em Câncer na Tata Memorial Center, em 2001 e 2004. Os casos foram confirmados histologicamente diagnóstico de cânceres de cavidade oral e controlos apropriados, a frequência pareados por idade ( 5 intervalos ano), hábitos de gênero e tabaco foram recrutados a partir do banco de sangue do hospital Tata Memorial e clínicas dentárias nas proximidades [28]. dados de estilo de vida e demográficos foram coletados mediante entrevista pessoal em ambos os estudos.

Os métodos de laboratório

DNA genômico foi extraído de amostras de sangue usando o 96 DNA Kit sangue QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha), ou com Puregene química (Gentra Systems, Minneapolis, MN, EUA) sobre um instrumento Autopure (Gentra Systems) no estudo IARC. No estudo de Mumbai, o DNA foi extraído seguinte protocolo padrão por Sambrook et al [29]. As concentrações de ADN foram medidos usando kits de PicoGreen ADN de cadeia dupla de quantificação (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Todos os polimorfismos foram analisados ​​centralmente no IARC utilizando o ensaio de 5 ‘exonuclease. Os iniciadores de PCR e sondas TaqMan foram sintetizados pela Applied Biosystems (Foster City, CA). Para garantir o controle de qualidade, amostras de DNA de pacientes casos e controles foram distribuídos aleatoriamente em cada placa PCR, e todos genotipagem foi realizada por pessoal cegos para o status de caso-controle. Dez por cento dos sujeitos do estudo (isto é, ambos os casos e controles), foram selecionados aleatoriamente para voltar a genotipagem de cada polimorfismo para examinar a confiabilidade dos testes de genotipagem, todos os ensaios tiveram concordância de 99%. As análises finais incluiu amostras que passaram critérios de controle de qualidade rigoroso (QC). Os indivíduos foram excluídos se falhou duas ou mais das seis ensaios de genotipagem realizados. Além disso, apenas os casos com taxa de genotipagem de sucesso de 95% foram incluídos. O estudo original IARC recrutados 582 casos e 582 controles da Índia. Destes, 935 indivíduos foram genotipados, dos quais 872 passaram os critérios descritos QC e foram incluídas na presente análise. No estudo Mumbai, dos 576 indivíduos genotipados, 226 casos e 332 controles limpou o QC descrita e foram incluídos nesta análise. Um total de 639 casos e 791 controles foram incluídos nesta análise a seguir exclusões descritas acima.

Métodos estatísticos

Os dados sobre o consumo de álcool, uso de tabaco, mastigação e tabagismo foram coletados em ambos os estudos participantes . A definição de bebedor, fumador e mastigador foram consistentes em ambos os estudos e incluiu indivíduos que responderam confirmando que nunca uso de álcool, nunca fumar qualquer produto de tabaco (cigarro, charuto, cachimbo, hooka, cigarro e /ou bidi), nunca use de qualquer smokeless produto do tabaco, com ou sem quid betel. Várias formas de tabaco são consumidos na Índia, enquanto

khaini, mawa, mishri, Zarda, gudakhu

e

Gutkha Quais são todas as formulações que contenham tabaco com diferentes agente aromatizante

s, masala pan

é um produto porca areca que não contém tabaco, tabaco ao qual podem ser adicionados externamente. Duração e frequência de exposição ao tabaco e álcool foram calculados em cada estudo, como descrito anteriormente [25] – [28]. Resumidamente, a duração de fumar foi calculada como a diferença entre a idade de início e idade na paragem de fumar, tendo em conta os períodos de vários tipos de fumar sobrepostos (exceto no estudo Mumbai, onde apenas cigarro e bidi uso foi gravado, e muito poucas exposições sobrepostas foram observados). a frequência de fumar foi calculado como o número de equivalentes de cigarros fumados por dia, com um charuto = 4 cigarros, 1 tubo = 5 cigarros e 1 bidi = 0,5 cigarros. Mastigar incluiu o uso de produtos do tabaco sem combustão, incluindo quid betel, noz de areca com /ou sem tabaco e

pan masala

no estudo IARC, eo tabaco com cal,

pan masala, khaini, mawa, mishri, Zarda, gudakhu, rapé

e

Gutkha

no estudo Mumbai. Gomas de frequência foi calculada como o número acumulado de mascar eventos por dia, tendo em conta os períodos de exposição de sobreposição. Para o cálculo do consumo de álcool na vida, o percentual de etanol foi estimada em 40% para as bebidas espirituosas (whisky, gin, rum, conhaque, araca e licor país), de 3% para cerveja e 5% para toddy (exceto no estudo Mumbai) . Fumar, mastigação e álcool relacionados risco de câncer oral foi calculada utilizando modelos de regressão logística ajustados para idade, sexo, nível de educação e centro. As fracções correspondentes foram atribuíveis calculado com base na fórmula: P (CE) x (OR-1) /OU; onde p (CE) é a proporção de expostos entre os casos [30], [31]. Qui-quadrado foram realizados para comparar as freqüências alélicas observadas no presente estudo com os resultados publicados anteriormente [16], [17]. As associações entre as variantes genéticas e câncer bucal foram estimados por regressão logística ajustado para idade, sexo e centro e uso de tabaco, quando apropriado. A associação entre o

CHRN

variantes e propensão ao uso de tabaco foi avaliada utilizando modelos de regressão linear com log transformado número de equivalentes de cigarros fumados por dia, ou o número de mascar eventos por dia como variável desfecho. Os resultados representam a dobra-a mudança no número de cigarros fumados por dia ou o número de eventos de mascar por dia para cada cópia do alelo raro. Estas análises foram ajustadas para idade, sexo, centro e estado de caso-controle. Análises semelhantes foram realizadas para examinar a associação entre variantes /ALDH2 ADH e a propensão para beber álcool, medido como número de bebidas de álcool consumidas por dia. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando STATA versão 11 (Stata Corp, College Station, TX), e os valores de p relatados são dois lados.

Resultados

A Tabela 1 descreve as características do estudo população. Dos 639 casos e 791 controles incluídos na presente análise, a IARC estudo internacional contribuiu com a maior proporção de indivíduos (61%). Maioria dos casos eram do sexo masculino (65%) e tinha completado os níveis mais baixos de educação e foram cânceres da cavidade oral (96%). tabagismo e mastigação foram associados com risco aumentado de câncer oral (OR = 5,23, 95% CI = 3.39- 8,07 e OR = 8,30, 95% CI = 5.78- 11,93, respectivamente), e o uso combinado de fumar e sem fumaça produtos do tabaco conferiu um risco 12 vezes maior de câncer oral (OR = 12,40, IC 95% = 7.80- 19,70). Nunca usar de álcool foi associado com um 1,67 vezes maior risco de câncer oral (OR = 1,67, IC 95% = 1,25- 2,22).

A distribuição de todas as seis variantes examinados na presente análise foi consistente com as expectativas de distribuições de genótipos com base no princípio de Hardy-Weinberg. As frequências alélicas foram semelhantes em todos os estudos que participam (dados não mostrados). Descobrimos que as variantes em rs1229984 álcool desidrogenase genes- (

ADH1B)

, rs698 (

ADH1C) Comprar e rs1573496 (

ADH7) Comprar e o gene da dependência de nicotina rs16969968 variantes foram menos comum entre os índios em comparação com estudos anteriores em populações predominantemente ocidentais. Por outro lado, rs578776 era mais comum entre os índios (Table2)

Foi examinada a associação entre

CHRN

variantes e a propensão ao uso do tabaco.; os resultados estão resumidos na Tabela 3. Os portadores do alelo raro rs16969968 (A) mostrou alguma tendência a fumar mais, embora não foram estatisticamente significativas. Observou-se também um aumento na propensão para mastigar tabaco com a variante rs16969968 (p = 0,03). Presença de cada cópia do alelo A correspondeu a um aumento de 13% mais eventos de mastigação por dia (fold-change = 1,13, 95% CI = 1.01- 1,25) em comparação com não-portadores. A associação com a mastigação permaneceu robusto em cima do ajuste adicional para a frequência de fumar (fold-change = 1,13, 95% CI = 1.01- 1.26) ea associação foi consistente entre os não fumantes que mascavam tabaco (p = 0,003) (fold-change = 1,19, IC95% = 1.06- 1.34). Observou-se uma redução semelhante na propensão para mastigar entre os portadores da rs578776 rara variante (dobre-change = 0,91, 95% CI = 0.84- 0.99), a associação mais forte entre os chewers que nunca fumaram.

Nenhuma associação foi observada para rs16969968 eo risco de câncer oral no presente estudo global (OR = 1,01, 95% CI = 0.83- 1.22), por sexo (p-heterogeneidade = 0,33). Embora não se observou qualquer modificação do efeito de fumar ou mascar de estado, foi observada uma relação oddds estatisticamente não significativa de (IC 95% = 0.69- 2.13) 1.22 em mastigadores e fumante (Figura 1). Observamos pouca evidência para uma interação estatística entre a variante rs16969968 e uso de tabaco no risco de câncer oral (OR: CI 1,18, 95%: 0.68- 2.07). Por outro lado, rs578776 foi associado com diminuição do risco de câncer bucal neste estudo (OR = 0,84, 95% CI = 0.72- 0.98). Foi observado um efeito dose-gene para os portadores do alelo raro (p-tendência = 0,02). Embora nenhuma heterogeneidade foi observada com base nos hábitos de tabaco, também foi observada uma diminuição do risco entre os que nunca fumaram e nunca mastigadores (OR = 0,64, IC 95% = 0,43-0,96) (figura 1).

O painel A mostra a associação entre rs16969968 e câncer bucal; O painel B mostra a associação entre rs578776 e câncer oral. parcela florestal representa odds ratio derivadas do modelo multivariada aditivo log ajustado para idade, sexo, nível de escolaridade e no centro, conforme o caso.

Foram examinados variantes em genes relacionados ao metabolismo do álcool, uma vez que foram fortemente associados com câncer de cabeça e pescoço em estudos anteriores. Nenhum dos quatro variantes (rs1229984, rs698, rs1573496 e rs4767364) examinaram, mostrou qualquer associação com o risco de câncer oral (tabela 4). Realizamos ainda restrito análises entre os bebedores de sempre, dada a importante modificação de efeito pelo consumo de álcool. Embora a falta de associação permaneceu consistente, as estimativas observadas seguiu a direção antecipado com base em expectativas de estudos GWAS e genes candidatos anteriores. análise estratificada com base no sexo não reflecte qualquer heterogeneidade na observada falta de associações (tabela 4). Além disso, nenhuma das variantes genéticas em genes do metabolismo do álcool pareceu influenciar os níveis de consumo de álcool (Tabela S1).

Discussão

O

CHRN

variantes, rs16969968 e rs578776, têm sido associados com a dependência da nicotina e risco de câncer de pulmão e estas associações parecem ser independentes [15], [32]. Aqui, nós demonstramos que a associação entre

CHRN

variantes também se estende à propensão para mastigar tabaco, um fator de risco do câncer bucal relevante na população indiana.

Várias formulações de tabaco estão comercialmente disponíveis e comumente utilizado na Índia; agruparam-se neste estudo. O número de mascar eventos por dia foi gravado em ambos os estudos incluídos nesta análise; no entanto, é importante notar que isso não reflete a quantidade de produto mastigado cada vez e, portanto, constitui uma fonte potencial de má classificação da exposição. Dado que observamos uma associação mensuráveis ​​com uma estimativa de tais crude implica que o verdadeiro efeito da

CHRN

variantes e dependência de mascar pode ser potencialmente maior que o observado no presente estudo. Estudos anteriores demonstraram que o risco de câncer de VADS associado com rs16969968 é maior entre as mulheres e para os cânceres da cavidade oral e laringe [13], [33]. Neste estudo, o aumento da propensão para mastigar tabaco não se traduzir em um aumento do risco de câncer oral para rs16969968; embora rs578776 foi associada tanto diminuiu mascar propensão e uma redução modesta no risco de câncer oral. Curiosamente, rs578776 também foi associado à diminuição do risco de câncer oral em usuários nunca tabaco, embora com base em números pequenos. Esta associação pode ser influenciada pela má classificação da exposição ou potencialmente através de um efeito independente do tabaco. estudos voltados maiores serão necessários para resolver esta questão.

O

genes ADH

, correlacionados como consequência do desequilíbrio de ligação, estão localizados no 4q23 lócus. Três alelos, rs1229984, rs698 e rs1573496 dentro do

ADH

lócus têm sido associados com o risco de câncer VADS em europeus e de outras populações asiáticas [17], [34] – [36]. Embora tenha havido alguns indícios que sugerem

ADH

variantes podem influenciar o risco oral e cancro do pescoço, na Índia, em rs698 particulares [37], não observamos associação entre rs1229984, rs698 e risco de câncer oral. Da mesma forma o

ALDH2

rs4767364 variante, identificada através de uma recente VADS GWAS [17], não foi associada a câncer bucal neste estudo. A fração de consumidores de álcool neste estudo foi comparável a outros relatórios a partir desta população, mas é notavelmente menor do que o registrado entre os europeus [38], [39]. Além disso, a raridade dos alelos de risco na população indiana sugere que a contribuição de álcool e variantes relacionadas com o álcool para a susceptibilidade câncer bucal na Índia é susceptível de ser limitado.

Para o melhor de nosso conhecimento, nós relatamos para a primeira vez que a associação entre 15q25 lócus e propensão a fumar estende-se a mascar tabaco. Nós também fornecemos evidências sugestivas de que 15q25 região que contém o

CHRN

agrupamento de genes podem contribuir para a susceptibilidade câncer bucal na Índia. Neste estudo, a variante rs16969968 foi associado com o aumento da propensão para mastigar tabaco e rs578776 foi associada com a diminuição da propensão de mascar eo risco de câncer oral. Maiores estudos serão necessários para esclarecer a extensão da modificação risco mediada pela propensão a consumir tabaco. Este estudo também indica que as variantes em genes de metabolização do álcool parecem ser menos importantes para a susceptibilidade câncer bucal na Índia. Esses dados reiteram a importância da etiologia da doença, a contribuição relativa dos fatores de risco e seu impacto na replicação de GWAS identificados loci de risco entre as populações.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Variantes em álcool metabolizando os genes e os níveis de consumo de álcool. Fold-change foram derivadas de modelos de regressão linear ajustados para idade, sexo, centro e estado de caso-controle. Log número transformadas de bebidas alcoólicas por dia foi tratado como variável desfecho para cada um dos respectivos variante genética como o explicativa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088240.s001

(DOCX)

Agradecimentos

os autores agradecem a todos os participantes que tomaram parte na pesquisa.