Abstract

Nós testamos a hipótese de que (i) variações sinónimos dentro de regiões codificantes e (ii) as variações no interior das regiões não codificantes de HPV, influenciar patogênese cervical cancer (CaCx) sob o impacto de genomas HPV16 intactas. análise da sequência do genoma inteiro de HPV16 isola dentro de 70 casos CaCx e 25 amostras não-malignas revelou que as variações sinônimas foram significativamente maiores dentro do E6 (p = 0,014), E5 (p = 0,001) e L2 (p = 0,0002) genes de isolados HPV16 dentro casos, comparativamente com os isolados dentro de amostras não-malignas. Todos os 25 (100%) códons humanizados identificados no L2 ORF das amostras analisadas, foram protegidos pelos casos CaCx, enquanto que 8 em cada 25 (32%) foram protegidos por amostras não-malignas positivos HPV16 (p = 3.87105E-07 ). L2 (ARNm e proteína) expressão era evidente apenas entre os casos com genomas virais epissomais e a expressão de ARNm L2 correlacionadas significativamente com o número de cópias do gene E2 sugerindo a expressão de todos os genomas epissómicos. Entre tais casos, asiática americana (AA) dos isolados retratado todos os codões humanizados (100%; 4-6 /amostra) gravada por L2, o que foi significativamente maior (p = 2.02E-7) em comparação com o Europeu (E) isola (22,8%; nenhum ou 1-2 /amostra). Além disso, a maioria dos variante E isola dentro casos (54/57; 94,7%) retratou uma variação (T4228C) dentro do curto não-codificante região (NCR2) entre genes E5 e L2, que retrata a actividade do promotor fraco específico para a expressão do mRNA L2 . Isto resultou em perda de 9 dos 14 locais de ligação de miRNA (HSA-miR-548 familiares), apesar da superexpressão significativa de miR548a-5p e miR548d-5p entre tais casos (28,64 e 36.25 dobras, respectivamente), em comparação com HPV negativo amostras de controlo. Os resultados exemplificar a relevância biológica de variações de sequência em genomas HPV16 e HPV16 destacar que episs�ica em casos CaCx empregar vários mecanismos para sustentar expressão L2, justificando assim o papel potencial de L2 em tais tipos de câncer, ao contrário daqueles que abriga a integração viral.

Citation: Mandal P, Bhattacharjee B, Das Ghosh D, Mondal NR, Roy Chowdhury R, ​​Roy S, et al. (2013) a expressão diferencial de L2 Gene HPV16 em cancros cervicais Harboring episs�ica HPV16 Genomas: influência das variações Região sinônimos e não-codificante. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10.1371 /journal.pone.0065647

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 26 de abril de 2013; Publicação: 06 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mandal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado parcialmente pelo Departamento de Biotecnologia (Grant No. BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), Governo da Índia, e parcialmente pelo instituto de estatística indiano (intramural) e Instituto Nacional de Biomedical Genomics (Núcleo Grant). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A associação de genital por papilomavírus humano (HPV) com câncer cervical (CaCx) é forte e independente de outros fatores de risco, como é evidente a partir dos resultados consistentes gravados a partir de estudos epidemiológicos realizados em vários países [1]. Aproximadamente 50% dos casos CaCx são causadas por HPV16 [2], [3]. Na Índia, também, infecção HPV16 é o tipo mais predominante associada a CaCx [4] – [6] e também é o tipo mais prevalente identificados nas populações em geral com base nos dados disponíveis em algumas regiões da Índia [5] – [9].

Durante a fase de infecção transiente, de forma epissomal HPV replica juntamente com os diferenciação de células epiteliais de membrana basal para a zona superficial, e as partículas virais são aí lançar fora juntamente com as células epiteliais descamadas-off [10] . No entanto, neoplasia cervical de alto grau parece ser caracterizada por expressão genética viral desregulamentado e ciclo de vida abortiva do vírus [11]. Por conseguinte, o potencial de transformação de HPV são susceptíveis de ser correlacionados com o potencial de desregular a expressão de proteínas virais chave [12] – [14], bem como, com a capacidade de evitar o ataque do sistema imunológico pelo hospedeiro de modo a persistirem dentro o epitélio cervical acolhimento [15].

a integração de genomas virais no genoma do hospedeiro, principalmente em locais frágeis [16], [17], afeta vários caminhos celulares da maquinaria do ciclo celular do hospedeiro. Isto leva a disrupção do gene E2 virai, mais vulgarmente na região que codifica para a região da dobradiça da proteína E2 de HPV16. Na ausência de repressão E2-driven, E6 e E7 são sobre-expressos, aumentando assim as células infectadas para a transformação. Pelo contrário, o nosso estudo [18], bem como alguns outros [19], identificaram que uma proporção considerável de indivíduos com CaCx abrigar gene E2 intacta [20]. Isto poderia ser puramente intacta (epissomal) ou concomitante, isto é, uma mistura de intactas (epissomal) e formas interrompidas (integrado). Tais observações, apontam para a plausibilidade biológica da carcinogênese cervical sob o impacto do gene E2 intacta HPV16 ou genomas virais intactas, ao contrário de E2 perturbação ou integração.

Em uma maior exploração de novos paradigmas de HPV16 relacionados CaCx patogênese sob o impacto de genomas virais epissómicos com genes intactos E2, realizamos genoma ampla sequenciação de genomas virais tais casos dentro CaCx e amostras não-malignas, inicialmente excluindo o gene E1 [21] e subsequentemente incorporando E1 neste estudo. Assim, geramos dados de sequência de todo o genoma HPV16. A variante europeia (E, 86,32%) foi o mais prevalente na nossa população, tanto entre controlos, bem como casos, seguido de variantes asiático-americanos (AA, 13,68%), que registrou apenas entre os casos.

polimorfismos de um único nucleótido (SNP) nonsynonymous são considerados funcionais porque resultam em alterações no nível de aminoácido que pode influenciar funcionalmente as proteínas. A nossa análise anterior [21] foi focado em tais variações dentro do mais comum E variante haplótipo P-12, com base no banco de dados SIFT. Este estudo revelou que raras variações deletérios dentro genes implicados na infecção produtiva (L1, L2, E2 e E5), sobre o haplótipo fundo E-12 do HPV16 intactos isolados, pode ser de relevância causal para o desenvolvimento CaCx. variações sinônimas, por outro lado, também poderia influenciar a expressão dos genes virais, modulando os padrões de uso de códon [22].

Estudos anteriores do nosso grupo têm também forneceu uma visão sobre a relevância biológica das regiões não codificantes de HPV16, tais como o envolvimento de variação de nucleotídeos dentro E2BSIV no LCR [18], a metilação de CpG dentro E2BSI /II no LCR [23] e repita expansões dentro NCR-2 [21] na patogênese dos cancros cervicais abrigar HPV16 intacta genomas. Nosso objetivo era aqui para re-investigar os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no âmbito de todo o genoma de HPV16, que incorpora o gene E1, entre HPV16 epissomal isola dentro de amostras não-malignas e em casos CaCx. Particularmente, enfatizamos sobre a determinação da associação de variações, sinónimo genomas HPV16 intacta, se houver, com CaCx patogênese e identificação dos genes que abrigavam tais variações, tendo em vista sua relevância biológica. Nós explorada a possibilidade de que nucleotídeos variações dentro de regiões não codificantes, especificamente as regiões não traduzidas de genomas HPV16 são biologicamente relevantes, bem como, para além daqueles dentro das regiões de codificação.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todas as amostras, malignas e não malignas, foram coletados dos indivíduos com consentimento informado aprovado pelo comitê de ética institucional para a experimentação humana do Instituto de estatística da Índia, Kolkata, na Índia.

as amostras e os assuntos

detalhes sobre assuntos, amostras, isolamento de ADN, rastreio do HPV e determinação de HPV16, E2 número de cópias e o status interrupção são descritos em detalhes em nosso estudos anteriores [8], [18], [20] , [21], [23], [24]. Foram analisadas amostras de ADN, compreendendo: um painel de casos positivos HPV16 malignas (n = 94) e controlos positivos HPV16 citologicamente normais (n = 29), que aqui denominado amostras não malignas positivos HPV16. Destes, 70 amostras malignas e 25 amostras não malignas foram incluídos do nosso relatório anterior sobre os dados de sequência de HPV16 sem os dados sobre o gene E1 [21]. As amostras malignas foram caracterizados por idade mediana de 50 anos (intervalo = 27-60 anos) e as amostras não-malignas por idade mediana de 34 anos (intervalo = 27-80 anos).

Todas as amostras malignas (histologicamente confirmados carcinomas de células escamosas invasivo e clinicamente diagnosticada como tumor estádio III e acima de acordo com a classificação e maioria FIGO foram diagnosticados como carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado patologicamente) foram derivadas de indivíduos casados. As amostras não-malignas foram arranhões cervicais normais confirmados pelo teste de Papanicolau e derivados de mulheres casadas e não-grávidas (ou, 6 meses pós-parto), sem história prévia de cervical displasia /malignidade. Algumas das amostras deste grupo foram histologicamente confirmados biópsias cervicais normais derivados de mulheres submetidas a histerectomia por vários outros do que de câncer, como prolapso uterino, miomas, cistos, etc e sem história prévia de cervical displasia /malignidade razões.

re-sequenciamento do genoma HPV16

a re-sequenciação de genomas HPV16 foi restrita a essas amostras (não-malignas e casos) que abrigam genomas virais intactas com base em (i) gene E2 intacto como determinado no DNA nível por PCR de todo o gene E2 [18] e (ii) ensaio TaqMan para a estimativa de E2 e E6 números de cópias do gene (epissomal, quando E2 /ratio≥1 E6 e misturado ou concomitante, quando 0 E2 /rácio E6 1 ) [20].

foram utilizados quinze conjuntos de iniciadores sobrepostos para re-sequenciação do genoma HPV16. Destes, as sequências dos iniciadores de PCR e as condições para onze conjuntos foram descritos anteriormente no nosso laboratório [21]. Além destes, quatro conjuntos de iniciadores que se sobrepõem foram usadas abrangendo toda a região do gene E1. Os pormenores sobre as sequências de iniciadores e condições de PCR para o gene E1 encontram-se descritos na Tabela S1. Re-sequenciamento dos genomas intactos HPV16 foi feito como descrito anteriormente [21] em um sequenciador automático ABI Prism ™ 3100 utilizando química corante terminador. As sequências de DNA foram analisadas usando o pacote de PolyPhred (https://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) e a sequência de HPV16R foi utilizado como referência nos alinhamentos [25]. Identificação de variantes raras e eliminação de chances de erros de sequenciação foram realizadas de acordo com o relatório anterior do nosso grupo [21].

identificação de variações sinônimo biologicamente relevantes dentro das regiões de HPV16 genoma

codificação

A variações sinônimo dentro das ORFs de HPV16 foram determinados a partir da análise dos dados de seqüência. A frequência de uso de códons e aminoácidos devido a variações sinônimo foi identificado com base no programa “Graphical Codon Usage Analyzer (gCua), disponível em https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html e, finalmente, humanizado códons dentro do HPV16 foram identificados ORF.

Identificação das variações biologicamente relevantes dentro de regiões não codificantes do genoma HPV16 (short non região codificadora NCR2 entre E5 e L2)

nucleotídeo variações na grande região não codificante do HPV16, ou seja, LCR foram analisados ​​e relatados anteriormente [18]. Na presente comunicação, o nosso foco foi na região de codificação não short, NCR2, entre as regiões E5 e L2 de HPV16 em vista o possível envolvimento da região na regulação da expressão L2 [26]. Ele foi identificado recentemente que miRNAs hospedeiras são capazes de colidir com ciclos virais vida, tropismo viral e patogênese de doenças virais [27]. Portanto, usando software RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/), foram identificados locais dentro do NCR2 do HPV16 isola e perda de tais sítios de ligação de ligação miRNA, se houver, sob o impacto de variações de nucleotídeo único. Nós reconfirmada ainda mais a perda de tal ligação, empregando miRBase [28].

Isolamento de ARN e ADNc preparação

Os ARNs totais, a partir das amostras de tecido cervical foram isolados, purificados e tratado com ADNase I usando o kit Qiagen RNeasy, seguindo o protocolo do fabricante. Um micrograma de RNA total de cada amostra foi transcrito de forma inversa utilizando o iniciador (dT) 17-P3, isto é, um iniciador oligo (dT) 17-iniciador acoplado a uma sequência de ligante (5’GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ‘) [29] num 20 mistura reaccional ul. Em resumo, cada amostra de ARN foi misturada com 400 ng de oligo (dT) -P3 iniciador e incubou-se a 70 ° C durante 10 minutos. A mistura (10 ul) foi rapidamente arrefecida em gelo e, em seguida, misturado com igual volume de uma mistura de 2X tampão de transcriptase, dNTPs 8 mM (com DTT), inibidor 20 U de RNase e 50 L MultiScribe ™ transcriptase reversa (alta capacidade de ADNc ordem reversa kit de transcrição, Applied Biosystems) e transcrito de forma inversa a 42 ° C durante 60 minutos, seguido de inactivação a 70 ° C durante 10 minutos. reacção de transcrição inversa, com o mRNA e todos os reagentes, mas sem transcriptase reversa, foi realizada para as amostras como controlos negativos.

PCR quantitativa baseada análise de expressão de ARNm de L2

A expressão de ARNm de L2 foi determinada pela PCR quantitativo (qRT-PCR) em ABI 7900 HT plataforma de PCR, a seguir a quantificação relativa com expressão ACTB. Para este ensaio, 100 ng de cDNA foi usado numa mistura de reacção de 10 ul com

poder

SYBR® Mix verde PCR Master (Applied Biosystems) e 25 ng de ambos para a frente (L2 (3) F: 5 ‘TAT GGA AGT ATG GGT GTATTT T 3 ‘) e reverso iniciadores (L2 (1) R: 5’ ATC TGG GGG AAT AGG GGA T 3 ‘). expressão ACTB também foi quantificada por PCR em tempo real em um volume de reacção de 10 ul incluindo 100 ng de ADNc e 25 ng de frente (ACTB RTF: 5 ‘ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3’) e iniciadores (ACTB RTR: 5 ‘TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3’) inverso. expressão ACTB serviu como o controlo interno para garantir a integridade da amostra de RNA total. análise de curva de dissociação foi feito, a fim de excluir a ocorrência de amplificação não específica e primer formação de dímeros. O PCR-controlos foram NTC (controlo não-molde), bem como alíquotas separadas de reacções de transcrição inversa com (i) todos os reagentes excepto ARNm, (ii) ARNm e todos os reagentes, mas não a transcriptase reversa, e (iii) o HPV-negativo celular mRNA

a análise de imunotransferência de expressão L2

As amostras de tecido (10 mg, aproximadamente) foram homogeneizados em 100 gelo ul de tampão de lise de proteínas fria (mM Tris HCl 30;. pH = 7,5, MgCl 1 mM

2, 1 mM de EGTA, 0,67% β-mercaptoetanol, 0,5% de CHAPS, 10% de glicerol e 0,5% de Triton X100) contendo mistura de inibidores de protease (Roche). Após incubação durante a noite a 4 ° C com agitação, e subsequente centrifugação a 12.000 rpm a 4 ° C durante 20 minutos, o sobrenadante foi recolhido e avaliado pelo ensaio de Bradford (Biorad Hercules, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Trinta microgramas de proteína de todas as amostras foram corridas em SDS-PAGE a 12,5%, em duplicado, e em seguida, transferido para membranas de PVDF. Após o bloqueio não específica, a membrana foi tratada com 3:5000 diluição de anticorpo primário L2 rato (Santa Cruz Biotechnology, sc-65709; produzido contra os aminoácidos 40-150 de L2 de HPV16) durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, a membrana foi novamente tratado com anticorpo anti-ratinho secundário (diluição 1:5000, de cabra anti-IgG de ratinho-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) a 37 ° C durante 2 horas e 30 minutos. A expressão da proteína L2 foi detectada por ensaio de quimioluminescência base, após a lavagem da membrana. A expressão da proteína foi determinada ACTB como controlo interno. anticorpo primário monoclonal de ratinho ACTB (2:5000 diluição, Abcam, ab6276) e anticorpo anti-murganho secundário (diluição 1:5000, de cabra anti-IgG de ratinho-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) foram utilizados para análise da expressão de proteína ACTB . A análise densitométrica de cada banda de L2 e ACTB foram realizadas utilizando software IMAGE J (https://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). a expressão da proteína L2 foi representada em termos de densidade relativa de cada banda de L2 normalizada com a banda correspondente proteína ACTB (área da banda de proteína L2 /área da banda de proteína ACTB).

A quantificação relativa de miARNs maduros por TaqMan miARN PCR em tempo real

miARN TaqMan Ensaios para miR-548a-5p e miR-548d-5p foram realizados, utilizando ADNc preparadas a partir de amostras de ARN total, utilizando iniciadores específicos de miARN os miARN TaqMan Ensaios TaqMan ® e reagentes de Mirna Transcrição reversa Kit (ABI; Cat # 4366596). As reacções de transcrição reversa 15 uL consistia em 10 ng de ARN total, 5 U de Transcriptase Reversa MultiScribe, 0,5 mM de cada dNTP, 1 x tampão de transcrição reversa, 4 U de inibidor de RNase, e água isenta de nuclease. Isto foi realizado a 16 ° C durante 30 min e a 42 ° C durante 30 min, terminada a 85 ° C durante 5 min. Para PCR em tempo real de TaqMan Mirna ensaios, utilizou-se 0,5 mL de 20 × TaqMan Mirna Ensaio Primer, 1,33 mL de cDNA não diluído, 5 jul 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix e 3,17 mL de água livre de nuclease. O programa de PCR em tempo real incluído desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos e hibridação a 60 ° C durante 1 minuto. O PCR-controles foram NTC (controlo não-modelo). Cada ensaio foi realizado pelo menos duas vezes, com três réplicas por amostra em cada ensaio, em MicroAmp placas de 96 poços ópticos utilizando um sistema HT 7900 PCR (ABI). A expressão relativa das miARNs foram calculados usando RNU6b (ensaio de controlo TaqMan miARN) como controlo endógena, e calibrado para as amostras de controlo.

Análise estatística

A associação das várias alterações de nucleótidos dentro da genoma viral, com CaCx patogênese, foram determinados por meio do teste do qui-quadrado, conforme apropriado. Para isso, comparados entre os casos e grupo não-malignas após o ajuste para o tamanho dos respectivos ORF. taxas de detecção postiços de 0,05 foram obtidos para corrigir para múltiplos testes usando o Benjamini e o método de Hochberg [30] .A diferença na percentagem de codões e SNPs humanizados em NCR2 entre casos CaCx e amostras não-malignas, e entre variantes AA e E foi também determinado pelo teste do qui-quadrado. expressão de mRNA L2 e análise baseada densitometria de L2 dados expressão da proteína foi expressa como média ± desvio padrão. teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizada para identificar se as variáveis ​​de teste como a expressão de ARNm e proteína L2, seguido de distribuição normal. Duas amostras teste t foi utilizado para identificar associação do fenótipo da doença com as variáveis ​​que se seguiram distribuição normal. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise de regressão linear foi realizada para determinar a associação do número de cópias de E2 com expressão de ARNm de L2. Os diagramas de caixa foram construídos para observar a diferença na distribuição dos miRNAs expressões entre as diferentes categorias de amostras cervicais. Kolmogorov-Smirnov teste identificou miRNAs expressão como uma variável não seguinte distribuição normal. Portanto, o teste não-paramétrico (teste U de Mann- Whitney) foi realizada para estudar a associação da expressão de miARN com o fenótipo da doença. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando pacotes de software SPSS (versão 16.0 para Windows) e R (www.r-project.org)

Resultados

variações de nucleotídeos dentro E1 ORF:. Tipo e frequência

as variações de nucleotídeos dentro das ORFs de genoma HPV16, exceto para E1, foram relatados anteriormente em nosso laboratório [21]. variações de nucleótidos individuais foram registados a 20 posições dentro E1 ORF (Tabela 1). Das variações de nucleotídeo único, 19 eram mudanças bi-alélicas barrando um, que foi tri-alélicas. A frequência das variações variou entre 0,01 e 0,45 e com base na frequência de alelos menores (Mafs) foram classificados como polimorfismos (MAF≥0.05) e as variações de baixa frequência (MAF 0,05). Dos 20 variações dentro do ORF, houve 9 (45%) variações não sinônimas e 11 (55%) variações sinônimo distribuídos em todo o gene E1.

mudanças de aminoácidos não-sinônimas em todos os ORF de HPV16 genoma

No início, registramos 110 variações não sinónimas distribuídas pelas ORFs de HPV16, com exceção E1 [21]. Tais variações permaneceram inalterados, mesmo depois de aumentar o tamanho da amostra de 70 casos e 25 amostras não-malignas. Assim, a nossa análise da sequência do genoma de HPV16 genomas virais intactas revelaram um total de 119 variações não sinónimas. A percentagem de tais variações dentro E1 não foi significativamente diferente entre os casos (0,08%) e amostras não-malignas (0,11%). Várias correcções de ensaio foram feitas, após a inclusão das variações não sinónimos dentro de E1 ORF juntamente com as dos outros ORFs. Tal re-análise confirmou que a percentagem de variações não sinónimas em L2 ORF era significativamente maior nos casos, em relação ao grupo de HPV16 positivo não-maligno (Tabela 2).

alterações de aminoácidos sinónimos e humanizados codões entre as várias ORFs de HPV16 genoma

Um total de 124 variações sinônimas foram registrados distribuídos em todas as regiões codificantes dos genomas HPV16 de isolados intactos. A percentagem de variações sinónimas foram significativamente maiores nos casos em comparação com amostras não malignas para E6 (casos = 0,104%, as amostras não malignas = 0,026%, p = 0,014), E5 (casos = 0,296%, as amostras não malignas = 0,064 %, P = 0,001) e L2 (= 0,22% dos casos, as amostras não malignas = 0,121%, p = 0,0002) ORFs (Tabela 3). Uma análise mais aprofundada foi realizada, utilizando a ferramenta gCua (https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), para identificar os códons humanizados dentro E5, E6 e L2 ORF sob o impacto de variações sinônimos.

Havia 25 códons humanizados em L2 e 2 tais códons em ambos E5 e E6 (Tabela S2). Observou-se que todos os 25 (100%) codões humanizados identificados por L2 ORF das amostras analisadas, foram protegidos por CaCx casos, enquanto que 8 dos 25 (32%) foram protegidos por amostras positivas não malignas HPV16. Assim, a frequência de codões humanizados em L2 ORF foi significativamente maior (p = 3.87105E-07) nos casos CaCx, em comparação com amostras não malignas positivos HPV16. Não foram encontradas diferenças significativas nas freqüências de códons humanizados em E5 e E6 ORF, entre os casos CaCx e amostras positivas HPV16 não malignas (Tabela 4).

Nós classificamos ainda mais o HPV16 isolados intactos em E e AA variantes na sequência de um esquema de classificação, conforme relatado anteriormente em nosso laboratório [21]. Após a inclusão de amostras adicionais neste estudo não conseguimos gravar variantes AA entre as amostras não-malignas, enquanto que entre os casos CaCx intacta E2, a proporção de variantes AA e E foi de 18,6% (13/70) e 81,4% (57 /70), respectivamente. Por isso, fez uma tentativa de comparar variantes AA e E em termos de códons humanizados em L2 ORF entre únicos casos CaCx. Nossa análise revelou que todas as variantes AA (13 /13.100%) abrigava códons humanizados na região de L2 enquanto apenas algumas variantes E (13/57, 22,8%) abrigavam tais códons e esta diferença foi estatisticamente significativa (p = 2.02E-7) . O número de codões humanizados também foi distintamente diferente entre as duas variantes. Caracteristicamente, cada variante AA nutria 4-6 codões humanizados em contraste com cada variante E que abrigava nenhum ou um máximo de 2 codões humanizados.

A expressão diferencial de mRNA de L2 entre os casos CaCx albergando epissomal (puro ou concomitante) e HPV16 genomas integrados

no nosso estudo anterior, foi confirmada a intacto do gene de E2 através da análise da presença da transcrição virai (E7-E1∧E4) que produz o repressor E2, por APOT (amplificação de papilomavírus oncogênicos transcrição) -coupled-quantitativa por RT-PCR de E7 e E4 (aninhados para o gene E2) os genes [31]. Com base nessa análise, as amostras foram classificadas como episs�ica puro ou concomitante (epissomal e integrada) com genes E2 intactas, e integrada com genes E2 interrompidas. O estudo [31] também revelaram que estes dois tipos de cancros diferiam na expressão de E7 e E2 de mRNAs. Por conseguinte, determinada a expressão de ARNm L2, por PCR em tempo real quantitativa em 23 epissomal /CaCx casos positivos concomitantes HPV16, e comparados com os dados que de 11 casos CaCx integrados. Nenhuma expressão de L2 foi registada entre os casos integrados, em oposição à expressão de ARNm de L2 distinta em epissomal /casos CaCx concomitantes (Figura 1), que foi muito semelhante ao registado no caso da expressão de E2 no nosso estudo anterior [31]. Todas as amostras analisadas, retratada a expressão de transcritos de ARNm de ACTB como controlo interno. Uma análise posterior não revelou significativa (p = 0,224, t-teste) diferenças na expressão do ARNm de L2 entre AA [média (L2 C

T /ACTB C

T) ± SD = 0,834 ± 0,127] e E [significa (L2 C

T /ACTB C

T) ± dp = 0,904 ± 0,128] variantes (Figura 2). A relação, L2 C

T /ACTB C

T, também foi encontrado para ser significativamente correlacionada com os números de cópias E2 (p = 0,004; R

2 = 0,336) nos casos episs�ica CaCx (Figura 3 ), justificando a expressão de L2 a partir de genomas virais episs�icas.

(a) Amplificação enredo baseado em quantitativa PCR em tempo real de expressão HPV16 L2. L2 é transcrito em E2 intacta /episs�ica (epissomal ou concomitante), mas em E2 interrompidas casos /integrados. curva (B) que descreve a dissociação da primeira derivada da curva de fusão para a reacção de caracterizar a expressão de L2 (Tm de 80,5 ° C). (C) Amplificação trama baseada em PCR em tempo real quantitativa de expressão ACTB. ACTB é expresso por ambos epissomal e integrado casos positivos de HPV16. (D) da curva de dissociação que descrevem a primeira derivada da curva de fusão para a reacção de caracterizar a expressão de ACTB (Tm de 81,0 ° C).

L2 expressão de ARNm relativa é representado por L2 significativo C

T /C ACTB

T.

A expressão diferencial da proteína L2 entre os casos CaCx abrigando episs�ica (puro ou concomitante) e genomas HPV16

Foram determinadas proteínas L2 integrado a expressão por análise de imunotransf erência, em um subconjunto de 12 casos CaCx (integrado ou E2 interrompido casos CaCx = 4, epissomais americana asiática ou E2 casos CaCx intacta = 3 e epissomal Europeia ou casos CaCx intacta E2 = 5) a partir do conjunto que foi usado para análise da expressão de ARNm de L2. expressão L2 foi registrada entre os casos episs�ica CaCx, AA e E variante isolados, ao passo que tal expressão não puderam ser identificados entre os casos CaCx integrados (Figura 4). Todas as amostras CaCx, independentemente de epissomal ou integrada, retratada a expressão da proteína ACTB (controle endógeno). O estado de codões humanizados dentro da AA e variante E isolados de amostras que revelem a expressão da proteína L2 está representada na Tabela 5. expressão da proteína L2 foi quantificada através de análise densitométrica dos resultados de imunotransferência de Software de Imagem J (http: //rsb.info.nih. gov /ij /docs /index.html) e não houve diferença significativa (p = 0,562, t-teste) foi gravado entre AA [média (área de L2 banda de proteína /área da banda de proteína ACTB) ± sd = 2,66 ± 1,85] e variantes E [média (área da banda de proteína L2 /área da banda de proteína ACTB) ± DP = 1,95 ± 0,61], como retratado na Figura 5.

painel superior retrata expressão L2. As pistas 1 e 2: as amostras positivas de E2 de HPV16 interrompido /caso CaCx integrado (D1 e D2); Pistas 3, 5 e 7: HPV16 positivo E2 intacta /episs�ica (episs�icas ou concomitantes) variantes europeus (EV1, EV2, EV3, respectivamente); Lanes 4, 6 e 8: HPV16 positivo E2 intacta /episs�ica (epissomal ou concomitante) variantes americanos asiáticos (AAV3, AAV2, AAV1, respectivamente). painel inferior mostra a expressão ACTB entre todas as amostras analisadas. detalhes da amostra são ilustradas na Tabela 5.

sítios de ligação de miRNA na região curto não codificação (NCR2) e perda de tais sítios de ligação devido à presença de SNPs no NCR2 de CaCx casos

Um curto região não codificante (NCR2) comumente existe entre os E5 e L2 quadros de leitura aberta de HPVs. NCR2 é caracterizada por uma fraca actividade de promotor que está fortemente regulada pela diferenciação dos queratinócitos e usados ​​apenas para transcritos que codificam a menor proteína da cápside L2 de HPV16 [26]. Outro estudo relatou 13 transcrições de HPV16 em linha cervical células epiteliais W12 (abrigando genomas HPV16 episs�icas), dos quais, 6 transcritos foram encontradas para abranger o NCR2 e L2 [32]. Em vista do facto de que os casos CaCx albergando genomas epissómicos HPV16 também expressa o gene L2, que centrou-se em decifrar os factores que poderiam estar associados com a expressão de L2 em tais casos CaCx. Ao usar o software RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/), foram identificados locais de ligação no NCR2 (nt 4139-4234) de HPV16 isolados intactos, o que corresponde a 14 miRNAs humano (HSA-miR-3148, HSA -miR-3174, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-3916, hsa-miR-495, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548c-5p, HSA -miR-548d-5p, hsa-miR-548h-5p, hsa-miR-548i-5p, hsa-miR-548j-5p, hsa-miR-548w-5p, hsa-miR-548y-5p) (Figura 6 ). Tais locais de ligação de miRNA foram selecionados com base no mínimo de energia livre (MFE≤7) e pontuação de hibridação (≥140) (Tabela S3) como por padrões normalmente utilizados para a formação de miRNA: RNAm híbrido. Os nossos dados re-sequenciados revelou a ocorrência de um SNP (T4228C) (Figura S1) na variante NCR2 de E intacta somente isolados, o que poderia levar a uma perda de 9 locais de ligação de miARN nos transcritos correspondentes (HSA-miR-548a-5p, HSA -miR-548b-5p, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548h-5p, hsa-miR-548i-5p, hsa-miR-548j-5p, hsa-miR -548w-5p, hsa-miR-548y-5p) (Figura 6), os quais pertencia à família hsa-miR-548 de miRNAs. Curiosamente, proporção de casos CaCx intacta E2 (54/70, 77%) ancorando SNPs nos locais de ligação de miARN no NCR2 foi significativamente maior (p = 0,007) comparado com o das amostras não malignas (12/25, 48%) . Dentro E2 casos CaCx intacto, observou-se também que nenhum dos AA as variantes (0/13, 0%), continham um SNP nos locais de ligação de miARN no NCR2. Assim, não se observou nenhuma perda de miARN sites na NCR2 obrigatório em variantes AA.

(A) representa os nucleótidos 4139-4236 (posições) NCR2 localizados dentro de 5 ‘UTR do gene L2, com um single nucleotide polymorphism (SNP) na posição 4228 (T para C). identificação baseada em software RegRNA (B) de catorze locais de ligação de miARN dentro NCR2 com perda de locais de ligação correspondentes aos nove miARNs (

*) de HSA-miR-548family devido ao SNP (T4228C).

estudo anterior de nosso laboratório [21] revelou a ocorrência de variações repetidas dentro do NCR2.