Abstract

Os estudos mostraram que miR-221 e miR-222 estão desregulados em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de próstata. No entanto, o papel biológico e os mecanismos subjacentes do miR-221 e miR-222 na patogénese do cancro da próstata independente de androgénios ainda não são claras. A proliferação, apoptose, diferenciação do ciclo celular, e a capacidade de migração de células da próstata foram determinados após a transfecção de miR-221 ou miR-222 inibidor. O impacto biológico e regulação da SIRT1 em células de câncer de próstata foram investigados. MiR-221 e miR-222 foram altamente expresso em células PC-3 comparados com em células LNCaP. Depois de miR-221 ou miR-222 de expressão foi inibida, as taxas de proliferação e migração de células PC-3 e diminuiu a taxa de apoptose aumentada. Além disso, a proteína SIRT1 foi regulado para cima em células depois de terem sido transfectadas com o miR-221 ou miR-222 inibidor. As células transfectadas com siSIRT1 mostrou aumento da migração e uma taxa de apoptose diminuiu, mas não houve nenhum efeito significativo na proliferação de células em comparação com os controlos. Houve uma correlação negativa entre o miR-221 ou miR-222 e SIRT1, mas nenhuma relação alvo direto foi identificado. Estes dados demonstram que o miR-221 e miR-222 são altamente expresso em células PC-3. A sua inibição conduz à proliferação celular e migração reduzida e aumento da apoptose em células de cancro da próstata. Estes efeitos são potencialmente mediadas por aumento da regulação do SIRT1

Citation:. Yang X, Yang Y, Gan R, Zhao L, Li W, Zhou H, et al. (2014) Down-Regulamento de miR-221 e miR-222 Contenha o cancro da próstata proliferação e migração celular Isso é em parte mediada pela ativação de SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10.1371 /journal.pone.0098833

editor: George Calin, Universidade do Texas, MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2014; Aceito: 07 de maio de 2014; Publicação: 03 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China e Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (81170257 e Y2110513). Este estudo também foi parcialmente financiado pelo Fundo de inicialização MD Anderson Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é uma das neoplasias mais comuns e a segunda principal causa de morte por câncer para o sexo masculino no mundo ocidental. Aproximadamente 238.590 novos casos foram diagnosticados em 2013 [1]. A maioria dos PCAs crescem lentamente e são dependentes de andrógeno para o crescimento; assim, eles respondem ao tratamento da privação do andrógeno (ADT). ADT é eficaz, mas a doença da maioria dos pacientes acabará por se tornar refractário e do progresso de CaP andrógeno-dependentes de andrógeno-independente (resistente à castração) APC, que trouxe grandes desafios para o tratamento de CaP [2]. Assim, a identificação de uma nova e eficaz abordagem terapêutica tornou-se o foco na luta contra o CaP.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas (cerca de 21-23 nucleotídeos), RNAs não-codificantes de proteínas que funcionam como pós- reguladores de transcrição de genes alvo. Estas moléculas são encontrados principalmente em eucariotas e estão totalmente ou parcialmente integrada, de uma maneira complementar, com o ARNm alvo 3’UTR, resultando na degradação ou inibição da tradução do mRNA-alvo. miARN funções na regulação da transcrição e pós-transcrição da expressão de genes, que influenciam diversos processos biológicos celulares [3]. miARNs estão envolvidos em vários processos de diferenciação celular, proliferação e apoptose que estão intimamente relacionadas com a tumorigénese [3]. Recentemente, alguns miARNs expressas de forma aberrante foram descobertos em APC e outros cancros, o que indica que eles desempenham um papel fundamental no mecanismo molecular da patogênese e progressão do cancro [2], [4] – [8]. Além disso, estudos têm demonstrado que o miR-221 e miR-222 são desregulados em muitos cancros, incluindo CaP [9] – [14], e os dois miARNs desempenham um importante papel na tumorigénese e progressão de CaP dependente de androgénios para andrógeno-independente CaP [15] – [17]. No entanto, os resultados são inconsistentes e ainda controversos e os mecanismos subjacentes ainda não são claras.

Nos mamíferos, regulador de informações silencioso 1 (SIRT1) é um membro da família sirtuina e foi mostrado ser altamente homóloga com SIRT2 em levedura [18]. SIRT1 também é conhecido como histona-desacetilase dependente de NAD e está envolvido na regulação de vários processos fisiológicos, tais como a proliferação de células, da resposta inflamatória, do ciclo celular, e a migração de células [19]. No entanto, desconhece-se se a SIRT1 actua como um gene supressor do gene promotor ou devido à sua complexidade [20] – [23]. O seu papel no câncer não foi bem definida. Por exemplo, mostrou SIRT1 acção anti-oncogene e do seu nível de expressão foi associada com o prognóstico do cancro do cólon em [24], [25]. No entanto, considera-se um oncogene no cancro da mama [26]. Na APC, no entanto, o papel da SIRT1 ainda é controverso [27], [28].

Neste estudo, nós investigamos o seu papel regulador dos seus mecanismos moleculares potenciais miR-221 e miR-222 e na CaP por transfecção de miR-221 ou miR-222 inibidor em células APC.

Materiais e Métodos

cultura de células e plasmídeo transfecção

CaP Human células PC-3 (andrógeno-independentes ) e células LNCaP (andrógeno-dependentes) foram adquiridos a partir do Instituto de Bioquímica e Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências. As células foram mantidas em meio F12 (Gibco, Carlsbad, CA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%.

O pcDNA3.1- vetor vazio (pEX-5), pcDNA3.1-HSA-miR-221 esponjas de inibidores (miR-221 inibidor), pcDNA3.1-HSA-miR-222 esponjas de inibidores (miR-222 inibidor), pGPU6-vazio (pGPU6) e pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). A região SIRT1 3’UTR do tipo selvagem foi construído em psiCHECK-2 por GenePharma (Xangai, China). Células PC-3 foram cultivadas até 80% -90% de confluência e transf ectadas com os plasmídeos utilizando lipofectamina 2000 (ADN /Lipofectamina 2000 = 1/2) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído com F12 fresco contendo 10% de FBS. Uma expressão de transfecção estável de linhas celulares foi estabelecida após as células foram incubadas em meio F12 completo com G418 (1000 ug /ml) durante 15 dias. Verificamos os clones usando western blot e PCR em tempo real, e reuniram os clones de sucesso para os experimentos. Os resultados da verificação de western blot são mostrados na Figura S1. Além disso, todas as experiências foram também confirmados por transfecção transitória.

proliferação celular e ensaio do ciclo celular

Para o ensaio de proliferação de células, que semeadas células PC-3 com expressão estável estabelecida (pEX- 5, o miR-221 inibidor, o miR-222 inibidor, pGPU6, ou siSIRT1) em microplacas de 96 poços a uma densidade de 2 × 10

3 células por poço e incubou-se-lhes durante vários períodos de tempo (1 a 7D). Depois disso, 10 ul de Contador celular Kit-8 (CCK-8) reagente de células a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 1,5 h. A absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de electroluminescência ensaio imunoenzimático (ELISA).

Para o ensaio do ciclo celular, as células transfectadas foram semeadas em placa de 12 poços durante 48 h. As células em cada poço foram recolhidas e fixadas com etanol a 70% arrefecido com gelo durante 24 h a -20 ° C. Depois de ter sido lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS), três vezes, elas foram incubadas com a RNase durante 1 h em gelo e coradas com iodeto de propídio durante 15 min em gelo. A distribuição de ADN foi medida por citometria de fluxo em 4 h.

Ensaio de Apoptose

células transfectadas estavelmente foram semeadas em placas de 12 poços e cultivadas durante 48 h. As células foram então colhidas e recolhidas por centrifugação a 2000 rpm. Depois de ter sido lavada com PBS três vezes, elas foram coradas com anexina V-reforçada proteína verde fluorescente (FITC) e iodeto de propídio (PI), durante 15 minutos, ao abrigo da luz. A taxa de apoptose celular foi determinada por citometria de fluxo em 1 h.

Wound healing e ensaio Transwell migração ensaio

Um ensaio de cicatrização da ferida foi realizado para mimetizar a migração de células [26]. Em resumo, as células transfectadas foram plaqueadas numa placa de seis poços a uma densidade de 1 × 10

6 células por poço. As células foram cultivadas até 80% de confluência e várias linhas de feridas foram riscados verticalmente para o fundo com uma ponta de pipeta de 200 uL. Depois de ter sido lavada com PBS três vezes, as células foram incubadas em meio de crescimento contendo 1,5% de soro. A largura da ferida foi determinada a cada 24 h durante um período de 72 h a 100 × sob um microscópio Nikon Eclipse TS100 (Nikon, Japão). Os valores foram expressos como a percentagem de fechamento da ferida, que foi calculado da seguinte forma: percentual de fechamento da ferida = 1- (largura

t

/largura

0

) × 100 %.

para o ensaio de migração de células Transwell, as células foram privadas durante 24 h, ressuspensas com meio F12 isento de soro, e semearam-se (5 × 10

4 células) em um transwell de 24 poços com um 8- uM inserção membrana de poro (Corning, EUA). meio F12, suplementado com FBS a 10%, foi colocada na câmara inferior como um quimioatractor. As células foram incubadas durante 72 h. As células que penetrou a membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos, coradas com violeta de cristal durante 30 minutos à temperatura ambiente, e fotografadas sob um microscópio (Nikon, Japão). células invadidas eluíram-se com ácido acético. A absorvância foi medida a 590 nm num leitor de ELISA.

A transcrição reversa e em tempo real de reacção em cadeia da polimerase

Quarenta e oito horas após a transfecção, o RNA total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando TRIzol (Invitrogen , EUA) seguindo os protocolos do fabricante. Para miARN e SIRT1 transcrição reversa, 500 ng de ARN total foram sujeitas a transcrição inversa em ADNc com iniciadores específicos de miARN RT (RiboBio, China) e o iniciador aleatório (Takara, Japão), respectivamente. A expressão de genes foi medida por reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (PCR), utilizando um Applied Biosystems 7500 rápida Sequence Detection System e SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Alemanha) sob as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 5 minutos, seguido pela 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 10 seg e emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 30 seg. Os níveis de expressão relativa de ARNm de miARN e foram normalizadas por U6 e β-actina, respectivamente.

Western blot análise

Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas em presença de um cocktail inibidor de protease e centrifugou-se a 12500 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. A fracção sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi medida utilizando um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Shenggong Bio-Tech Co., Ltd., Shanghai, China). Uma alíquota de 80 ^ g de proteína desnaturada a partir de cada amostra foi aplicado a electroforese em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida a 10% de sódio e transferida para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 2 h à temperatura ambiente, seguido de incubação com o anticorpo primário (diluição 1:2000, Abcam, EUA) a 4 ° C durante a noite e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1:1000, Abcam , EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. As manchas foram então incubadas com quimioluminescência aumentada por 2 min. Os sinais foram detectadas e quantificadas por densitometria utilizando Quantity One Software. β-actina foi usado como um controle endógeno para dados de expressão normalizados

previsão alvo SIRT1 e atividade luciferase ensaio

alvos miRNA foram previstos utilizando o banco de dados Miranda (http:. //www.microrna. org /). Para o ensaio de actividade de luciferase, nucleótidos 2341-2731 (The Complete previu miR-221 e miR-222 local alvo do SIRT1-3’UTR) foram inseridos a jusante do gene da luciferase de Renilla em um /plasmídeo repórter de Renilla luciferase de pirilampo, psiCHECK- 2 (GenePharma, Xangai, China). Células PC-3 foram transfectadas com 0,5 ug de plasmídeos repórter por poço mais miR-221 ou miR-222 de plasmídeo inibidor. Quarenta e oito horas após a transfecção, Renilla /pirilampo actividade da luciferase foi medida por ensaio de repórter duplo de luciferase (Promega, EUA) num leitor de microplacas automático (Thermo, EUA).

A análise estatística

Todos análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS versão 17.0 (Chicago, Illinois, EUA). Os dados foram expressos como o valor médio ± SEM. A significância estatística foi determinada por uma análise de variância ou bicaudal teste t de Student. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes.

Resultados

A expressão de miR-221 e miR-222 em células pca

miR-221 foi altamente expressa em PC-3 células em comparação com LNCap (P 0,05) (Figura 1A). Da mesma forma, o miR-222 também foi acentuadamente aumentada em células PC-3 comparados com LNCap (P 0,01) (Figura 1B). A transfecção com o miR-221 inibidor dramaticamente suprimida a expressão de miR-221, em células PC-3 (P 0,05) (Figura 1C). Da mesma forma, o miR-222 de expressão foi significativamente diminuída após a transfecção do inibidor de miR-222 (P 0,01). (Figura 1D)

miR-221 níveis de (A) em células LNCaP de PC-3 e. (B) o miR-222 em níveis de células LNCaP PC-3 e. (C) o miR-221 em níveis de células PC-3 após a transfecção com pEX-5 (vazio vector plasmídico) ou inibidor de miR-221. (D) o miR-222 em níveis de células PC-3 após a transfecção com pEX-5 ou o miR-222 inibidor. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

* P 0,05,

** P . 0,01

Efeitos de miR-221 e miR-inibidor de 222 inibidor sobre a proliferação celular, a distribuição do ciclo celular e apoptose em PC- 3 células

Como se mostra na Figura 2, em comparação com células transfectadas com vector vazio (pEX-5), as células transfectadas com o miR-221 inibidor ou inibidor de miR-222 mostraram uma redução significativa a proliferação na quinta, sexta, e sétimo dia (P 0,01-0,05).

células PC-3 foram transfectadas com vector vazio plasmídeo (pEX-5), o miR-221 inibidor, ou de miR-222 inibidor. A proliferação celular foi analisada utilizando um ensaio de CCK-8. A proliferação de células transfectadas com o miR-221 inibidor ou inibidor de miR-222 foi reduzida em comparação com o que transfectadas com pEX-5. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

*, # P 0,05 vs pEX-5,

**, ## P 0,01 vs pEX-5

A citometria de fluxo revelou que 70,2 ± 1,8% de. as células transfectadas com pEX-5 estavam nas fases G0 /G1, enquanto que 87,1 ± 2,0% e 81,9 ± 0,9% das células transfectadas com o miR-221 inibidor e miR-222 inibidor foram em G0 /G1, respectivamente (P 0,01) ( As figuras 3 A e B). A transfecção com o miR-221 inibidor ou inibidor de miR-222 resultou numa percentagem muito inferior de células na fase S em comparação com as transfectadas com pEX-5 (4,9 ± 1,9% ou 9,9 ± 1,1% vs. 21,9 ± 1,7%, P 0,01 ). Não houve diferenças significativas nas células em G2 /M fases entre os grupos.

(A) de distribuição de conteúdo de ADN celular em cada fase. (B) Percentagem de células distribuídas em cada fase do ciclo celular. **

## P 0,01 vs pEX-5

As taxas de apoptose de células PC-3 transfectadas com miR-221 inibidor ou miR-222 inibidor foram aumentados em 2,8 vezes. e 2,6 vezes, respectivamente, em comparação com as transfectadas com pEX-5 (P 0,05). (Figuras 4A e B)

(a) distribuição celular apoptótica de células PC-3 transfectadas com pEX-5 miR -221 inibidor ou inibidor de miR-222 por citometria de fluxo. (B) taxa de apoptose relativa de cada grupo. Os dados representam a média ± SEM de três experiências separadas (

*, # P . 0,05 vs pEX-5

Efeitos de mir-221 inibidor e inibidor de miR-222 em PC-. 3 migração celular

Tal como mostrado nas Figuras 5A e B, as taxas de encerramento do inibidor de miR-221 e miR-grupos de inibidor 222 eram mais baixos do que era a de pEX-5 grupo. Por exemplo, as taxas de fecho eram 25 ± 1.5% e 34 ± 2.9% para miR-221 e inibidores de miR-222, respectivamente, versus 57 ± 7% para o pEX-5 (P 0,01-0,05) durante 48 h; e 47 ± 2.7% e 59 ± 9.9 % versus 100% (P 0,01).. a 72 h resultados similares para a inibição da migração foram observadas utilizando um ensaio Transwell Tal como mostrado nas Figuras 5C e D, a migração celular foi significativamente reduzida após a transfecção com o miR-221 inibidor ou miR-222 inibidor em comparação com a das células transfectadas com pEX-5 (P 0,01).

(a) ensaio de cicatrização de feridas mostra as taxas de fechamento de células transfectadas com pEX-5 (vazio plasmídeo vector), o miR-221 inibidor, ou miR-222 inibidor. (B) a determinação quantitativa das taxas de encerramento de feridas em diferentes pontos de tempo. ensaio (C) Transwell mostra que as células penetrou a membrana de inserção. (D) A quantificação do número de células que penetrou a membrana de inserção. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

*, # P 0,05 vs pEX-5,

**, ## P 0,01 vs pEX-55)

A inibição de miR-221 e miR-222 aumento. a expressão da proteína SIRT1

análise de transferência de Western demonstrou que os níveis de proteína SIRT1 de células transfectadas com o miR-221 inibidor e miR-222 inibidor estavam acentuadamente aumentadas em comparação com os de células transfectadas com pEX-5 (P 0,05 e P 0,01, respectivamente) (Figuras 6A e B). No entanto, não houve diferenças significativas nos níveis de ARNm (Data foi mostrado na Figura S2).

(A) Expressão dos níveis de proteína SIRT1 em células PC-3 após a transfecção foram determinados por análise de Western blot. (B) Quantificação da expressão da proteína SIRT1. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

* P 0,05 vs pEX-5,

## P . 0,01 vs pEX-5

Efeitos da SIRT1 na proliferação, apoptose e migração em células PC-3

SIRT1 expressão foi significativamente suprimida em células transfectadas com siSIRT1 comparação com as transfectadas com pGPU6 como um controlo (Figura 7A). Não houve diferenças significativas na proliferação de células entre as células transfectadas com siSIRT1 pGPU6 e (Figura 7B). No entanto, as células transfectadas com siSIRT1 resultou numa redução de duas vezes na taxa de apoptose em comparação com a de células transfectadas com pGPU6 (P 0,01) (Figuras 8A e B). Curiosamente, a migração de células transfectadas com siSIRT1 foi significativamente aumentada em comparação com a de células transfectadas com pGPU6 (P 0,05). (Figuras 9A e B)

os níveis de proteína SIRT1 (A) em células PC-3 transfectadas com pGPU6 (vazio vector plasmídico) ou siSIRT1 (pGPU6-Si-SIRT1) por análise de Western blot. proliferação (B) celular foi quantificado utilizando um ensaio de CCK-8. Não houve diferenças significativas entre os dois grupos (P 0,05). Os dados representam a média ± SEM de três experiências separadas.

(A) A apoptose foi medida por citometria de fluxo INPC-3 transfectadas com pGPU6 ou pGPU6-siSIRT1. (B) taxa de apoptose relativa de cada grupo. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

** P . 0,01 vs pGPU6

(A) A transpoço ensaio foi utilizado para medir a migração de células transfectadas com pGPU6 ou pGPU6-siSIRT1. (B) Número de células penetrou a membrana de inserção. Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

* P . 0,05 vs pGPU6

Sirt1 não é um alvo direto de miR-221 e miR-222

Como os dados mostram Miranda, miR-221 e miR -222 ligado a uma das sequências-alvo situadas na 3’UTR do ARNm SIRT1 (Figura 10A). Para verificar a interação direta entre miR-221 ou miR-222 e SIRT1 mRNA-3’UTR, foi realizado ensaio de actividade de luciferase. No entanto, as actividades da luciferase não revelou diferenças estatisticamente significativas no miR-221 ou miR-222 nível em PC-3 células co-transfectadas com a ligação SIRT1-3’UTR sequência de plasmídeo repórter em comparação com o controlo (Figura 10B). Em outras palavras, o miR-221 e miR-222 não se ligam à sequência de SIRT1 directamente e não exercem uma interacção biológica directa.

(A), os locais de ligação complementares do miR-221 e miR-222 em SIRT1-3’UTR previsto pela base de dados miranda. (B) A actividade de luciferase foi realizado para verificar a interação de ligação e de miR-221 e miR-222 com SIRT1. Não foram observadas diferenças na actividade de luciferase entre os grupos (P 0,05). Os dados representam o valor médio ± SEM de três experiências separadas.

Discussão

Vários estudos têm mostrado que o miR-221 e miR-222 são regulados positivamente em vários tipos de cancro e são, portanto, oncogenes estudo [9], [13], [29]. Com efeito, estudos verificaram que miARNs afectar uma série de processos biológicos por meio de ligação complementar de um ou vários genes alvo. Por exemplo, p27, TRPS1, PTEN, Arhi, TIMP3, HECTD2 e RAB1A eram os genes alvo de miR-221 e miR-222 [10], [11] ,. Estas descobertas sugerem que estes miRNAs são um alvo terapêutico. Demonstrámos que os níveis de miR-221 e miR-222 foram significativamente aumentados em células PC-3 comparados com em células LNCaP, o que é consistente com outros achados [34]. A sub-regulação de miR-221 ou miR-222 inibiu a expressão proliferação e migração celular e aumento da apoptose em células PC-3. Além disso, a transfecção eficaz de miR-221 inibidor ou inibidor de miR-222 resultou numa maior percentagem de células nas fases G0 /G1 e uma menor percentagem de células em fase S. Estes resultados indicam que a inibição de miR-221 ou miR-222 expressão exerce efeitos biológicos importantes na proliferação celular, a apoptose, a migração celular, a distribuição do ciclo celular, e a transição de células em células PC-3. A expressão de SIRT1 foi aumentada em células PC-3 depois de miR-221 e miR-222 foram regulados negativamente. Esta constatação sugere que SIRT1 desempenha um papel supressor contra a acção de promoção do tumor de miR-221 e miR-222. SIRT1 foi reportado para conter a proliferação celular LNCap [35]. Wang et al. demonstrou expressão SIRT1 reduzida no tecido CaP em comparação com o tecido em hiperplasia benigna da próstata [27]. SIRT1 pode servir como um promotor tumoral ou supressor de tumor, dependendo da via oncogénica específica para tumores específicos [19], [22], [24]. SIRT1 pode agir como um oncogene por inibição genes supressores de tumor, tais como p53 [36], e pode actuar como um anti-oncogene reprimindo vários oncogenes ou oncoproteinas tais como β-catenina e survivina [37], [38].

em nosso estudo, derrubando SIRT1 no PC-3 células levaram ao aumento da migração celular e uma taxa de apoptose diminuiu, mas nenhuma diferença significativa foi observada na proliferação celular. Estes achados sugerem que SIRT1 participa na supressão de migração e promoção da apoptose em células PC-3, mas tem pouco papel na regulação da viabilidade celular. A inibição de miR-221 e miR-222 SIRT1 expressão aumentada de expressão, o que sugere que o aumento da apoptose observada e diminuição da migração após transfecção com miR-221 ou miR-222 inibidor é regulado por activação SIRT1. capacidade de supressão de proliferação ‘Estas células, após o miR-221 e miR-222 sub-regulação pode ser modulada por meio de outras vias moleculares, tais como p27 [31] ou Arhi [39]. Embora SIRT1-3’UTR existe nos locais de ligação de miR-221 e miR-222, num ensaio de repórter de luciferase não identificar uma relação de ligação directa entre a SIRT1 e miR-221 ou miR-222. Isto sugere que o miR-221 e miR-222 indirectamente restringir a expressão de SIRT1 através de outras vias moleculares. São necessários estudos adicionais para ilustrar os mecanismos e vias moleculares de miR-221, o miR-222, e SIRT1 que estão envolvidos na patogénese CaP por sobre-expressam as duas microARNs e modulando a expressão de SIRT1 em diferentes linhas celulares. Investigação das funções biológicas de miR-221/222 e SIRT1 e a sua relação in vivo utilizando o modelo animal deve igualmente ser considerada.

Em resumo, o miR-221 e miR-222 são altamente expresso em células PC-3 . A inibição de miR-221 ou miR-222 reduz a expressão proliferação e migração celular e aumenta a apoptose em células APC. proteína SIRT1 é sobre-regulada em células após a transfecção de miR-221 ou miR-222 inibidor. As células transfectadas com siSIRT1 mostram aumento da migração e uma taxa de apoptose diminuiu, mas nenhum efeito sobre a proliferação celular. Estes dados indicam que os efeitos biológicos de miR-221 e miR-222 em células de cancro da próstata estão associados com SIRT1. A modulação da expressão destas moléculas pode afectar a tumorigénese de cancro da próstata. Estas descobertas podem fornecer uma abordagem terapêutica potencial para o câncer de próstata.

Informações de Suporte

Figura S1. Autenticação de células transfectadas com o miR-221 ou miR-222 inibidor por Western blot. 1-8: clones numerados. clones de sucesso indicadas pelas setas foram reunidas para verificar as experiências biológicas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s001

(TIF)

Figura S2. Expressão de ARNm de SIRT1. PCR em tempo real foi realizada para medir as alterações de ARNm SIRT1 em células PC-3 transfectadas com pEX-5, o miR-221 inibidor ou inibidor de miR-222. Não houve diferença estatística entre os grupos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s002

(TIF)