Abstract

Fundo

células estromais mesenquimais podem representar um candidato ideal para entregar drogas anti-câncer. Em um estudo anterior, demonstramos que a exposição da medula óssea de ratinho derivadas células estromais a doxorrubicina levou-os a adquirir potencial anti-proliferativa sobre as células estaminais hematopoiéticas em co-cultura (HSCs). Nós, portanto, a hipótese de se recentemente isolados óssea humana de células-tronco mesenquimais da medula (hMSCs) e maduros células do estroma murino (linha SR4987) preparado

in vitro

com drogas anti-câncer e, em seguida, localizada perto de células cancerosas, pode inibir a proliferação.

métodos e resultados Principais

O paclitaxel (PTX) foi utilizado para a cultura principal de hMSCs e SR4987. Incorporação de PTX em hMSCs foi estudada usando e analisadas por FACS e microscopia confocal marcado com PTX-FICT. Liberação de PTX em meio de cultura por PTX preparado hMSCs (hMSCsPTX) foi investigada por HPLC. Cultura de células endoteliais (ECS) e ensaio do anel de aorta foram utilizados para testar a actividade anti-angiogénica do hMSCsPTX e PTX preparadas SR4987 (SR4987PTX), enquanto que a actividade anti-tumor foi testado

In vitro

na proliferação de diferentes células tumorais linhas e in vivo por co-transplante hMSCsPTX e SR4987PTX com células cancerosas em ratos. No entanto, apesar de uma perda de células devido à apoptose induzida por quimioterapia, e ambas as hMSCs SR4987 foram capazes de incorporar rapidamente PTX e podia libertam lentamente PTX no meio de cultura de um modo dependente do tempo. PTX células iniciadas adquiriu um anti-tumoral potente e actividade anti-angiogênico

in vitro

que foi dependente da dose, e demonstrável usando seu meio condicionado ou pelo ensaio de co-cultura. Finalmente, hMSCsPTX e SR4987PTX co-injectados com células humanas cancerosas (DU145 e U87MG) e células de melanoma de ratinho (B16) em imunodeficientes e em ratinhos singénicos tumor significativamente atrasada leva e reduziu o crescimento do tumor.

Conclusões

Estes dados demonstram, pela primeira vez, que, sem qualquer manipulação genética, as células estromais mesenquimais são capazes de absorver e, subsequentemente, libertar lentamente a PTX. Isso pode levar a potenciais novas ferramentas para aumentar a eficácia da terapia do cancro

Citation:. Pessina A, Bonomi A, Cocce V, Invernici G, Navone S, Cavicchini L, et al. (2011) As células estromais mesenquimais imunizadas com Paclitaxel uma nova abordagem para a terapia do cancro. PLoS ONE 6 (12): e28321. doi: 10.1371 /journal.pone.0028321

editor: Marc Tjwa, Universidade de Frankfurt – University Hospital Frankfurt, Alemanha |

Recebido: 15 Abril de 2011; Aceito: 05 de novembro de 2011; Publicação: 20 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Pessina et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi parcialmente apoiado pela AIRC (Associazione italiana per la Ricerca sul Cancro) Projeto AIRC IG-9062, National Italian Grant PUR 2008 e Fondazione Banca del Monte di Lombardia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o objetivo principal na quimioterapia do cancro é localizar o efeito de drogas no microambiente tumoral, a fim de matar o máximo de células cancerosas quanto possível, produzindo o menor toxicidade garantia. Para fazer isso, um número significativo de abordagens técnicas, a partir da utilização de imunoconjugados tóxicos para o direccionamento de antigénios específicos de tumor [1] para o uso sofisticado de nanopartículas [2] ou células estaminais manipuladas [3] para a entrega de drogas, têm sido investigados e publicada nos últimos 20 anos. Como as células-tronco mesenquimais (MSCs) se adaptar facilmente às condições de cultura necessárias para

in vitro

manipulação e lar de tecidos patológicos quando injetado

in vivo

, essas células parecem representar a melhor escolha para entregar anti agentes -tumor [4], [5]. procedimentos transgénicas têm sido utilizados para induzir MSCs a secretar citocinas terapêuticos ou de crescimento e factores inibitórios [6], [7]. Dados recentes têm demonstrado que a engenharia MSCs produzem factores anti-tumorais que têm a capacidade de matar as células cancerosas tanto

in vitro

e

in vivo

[3], [8] – [12]. Embora existam resultados promissores em animais, a manipulação genética de MSCs em aplicação clínica em humanos tem alguns riscos [13].

Em um estudo anterior, demonstramos que medula óssea de ratinho (BM) de células do estroma derivadas (SR4987 a linha celular) cultivadas na presença de doxorrubicina (DXR), um composto anti-cancro potente, foram capazes de absorção de quantidades significativas de fármaco sem mostrar sinais de toxicidade significativos. Em contraste, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de BM foram muito sensíveis à DXR. Curiosamente, foi observada uma inibição significativa de unidades de formação de colónias induzidas HSCs (UFC) se o co-cultivadas com SR4987 primeiro sensibilizados com DXR. Concluiu-se que as células de estroma murino pode actuar como um reservatório para o DXR que, posteriormente, podem libertar alguns metabolitos DXR DXR ou ainda na sua forma original, levando a uma inibição induzida de CFU-HSCs [14]. Consequentemente, a hipótese de que, também

in vivo

, células estromais da BM pode desempenhar um duplo papel no controle da toxicidade da droga, dependendo de sua capacidade de absorção e liberação de drogas quimioterápicas [14]. Considerando estas propriedades, nós aqui investigar se MSCs humanas (hMSCs), recentemente preparada a partir BM e SR4987 rato, após a injeção com o anticancerígeno e paclitaxel drogas anti-angiogénico (PTX), pode adquirir a capacidade de matar as células tumorais (TCs) em sua proximidade .

O paclitaxel é um fármaco altamente lipofílico (derivado de

Taxus brevifolia

), muito activo em muitos tumores sólidos e também capaz de inibir a proliferação de células endoteliais. O paclitaxel afecta citoesqueleto, promovendo a polimerização de microtúbulos que induz a paragem da mitose da célula [15], [16].

demonstram, pela primeira vez, que, em um tempo cinética dependentes, as hMSCs e rato SR4987 preparado com PTX (MSCsPTX, SR4987PTX) liberar a droga em uma quantidade suficiente para afetar a proliferação do tumor, para matar as células endoteliais (CEs)

in vitro

e, mais importante, para reduzir o crescimento do tumor

in vivo

. Nossos resultados são a primeira demonstração de que, através de um simples

in vitro

procedimento, hMSCs e células do estroma do mouse pode ser carregado com drogas anti-câncer e usado

in vivo

para liberá-los em um tumor microambiente.

Resultados

Caracterização de MSCs, P-glicoproteína (P-gp) expressão e sensibilidade à PTX

As células utilizadas neste estudo foram três preparações frescas diferentes de hMSCs e a linha celular de estroma SR4987 rato [17]. hMSCs cultivadas foram analisados ​​para confirmar a expressão dos marcadores de MSC, bem como a sua capacidade de diferenciação multipotencial. Eles foram positivas para CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 + e HLA-I e negativo para CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD80 e HLA-II. Quando cultivados em condições diferenciadoras, adquiriram osteo-Adipo e condroblastos marcadores (Fig. S1). A seguir avaliou a sensibilidade de hMSCs e SR4987 para PTX, num teste de citotoxicidade de 24 horas e num ensaio anti-proliferação em 7 dias (Fig. 1a, b). SR4987 e hMSCs foram sensíveis à actividade anti-proliferativa de PTX, de acordo com uma cinética dependente da dose com um IC

50 valor de 25,6 ± 11,08 ng /ml e 4,07 ± 1,75 ng /ml, respectivamente. Por contraste, tanto SR4987 e hMSCs foram fortemente resistente a PTX citotoxicidade directa, com muito pouca morte celular, mesmo a concentrações mais elevadas de 10.000 ng /ml (Fig. 1A, B). A inibição da proliferação e hMSCs SR4987 por PTX foi confirmada através da realização de análise do ciclo celular, mostrando acumulação significativa de células em S, e em menor grau, fase G2 /M. A viabilidade de ambas as hMSCs e células SR4987 não foi afectado de forma significativa e as células isolada, lavada e subcultivadas na ausência de fármaco deu uma monocamada de células com uma viabilidade celular na gama de controlos e um padrão do ciclo celular restaurado após 72 h (Fig. S2 ). Estes dados foram confirmados pelas percentagens de células apoptóticas /necróticas contados nas diferentes condições experimentais por ensaio de Anexina (Tabela S1). O tratamento produz alguma perda de células devido à apoptose induzida por quimioterapia, embora o único aumento significativo na apoptose (P 0,05) foi evidenciada nas células SR4987 (às 24 horas de tratamento com PTX) que se recuperaram depois da substituição de droga (24 + 24 h). Estes dados estão de acordo com os relatos de outros autores sobre a sensibilidade das células estromais de Paclitaxel [18], [19].

Diferentes concentrações de PTX (,1-10,000 ng /ml) foram adicionados à cultura de hMSCs (Fig. 1A) e SR4987 rato (Fig. 1B). A actividade citotóxica foi avaliada após 24 horas de tratamento; o efeito sobre a proliferação de 7 dias de cultura através de um ensaio MTT. Densidade óptica medida em culturas de MSC que não receberam PTX foram considerados como 100% de proliferação. Note-se que a concentração de PTX até 10.000 ng /ml não afetou tanto hMSCs ou a viabilidade celular SR4987. As pequenas mesas inserir na A e B indicar a IC

50 e IC

90 induzida pela PTX em hMSCs e SR4987 respectivamente. Tanto o meio condicionado (CM) a partir de células imunizadas PTX (hMSCsPTX-CM e SR4987PTX-CM) produziu uma inibição do crescimento dependente da dose de células MOLT-4 relatado (Fig. 1C) como percentagem do produzido por CM a partir de células não tratadas (hMSCs-CM e SR4987-CM). Note-se que a diluição 1:16 de ambos hMSCsPTX-CM e CM-SR4987PTX produziu uma inibição de crescimento de 100% iguais aos obtidos com 3,13 ng /ml de PTX. Este ensaio biológico foi utilizado para estimar o PEC divulgado pela única PTX tratada hMSC e a sua acumulação no meio de cultura durante o tempo (D). O histograma indica PEC lançado pela hMSCPTX em diferentes momentos da cultura. A curva indica a acumulação PEC na hMSCsPTX-CM. Note que cada hMSCPTX libera cerca de 1 pg de PEC em 24 h, atingindo uma acumulação máxima de cerca de 1,7 pg após 144 h. Valor são a média ± desvio padrão (SD) de cinco experimentos independentes.

Ambos os hMSCs e células SR4987 expressas P-gp que foi down-modulada por tratamento com PTX e com verapamil (VP). A presença de VP aumento da sensibilidade SR4987 com a actividade anti-proliferação de PTX, ao passo que não foi eficaz em hMSCs (Fig. S3).

PTX-absorção e liberação de hMSCs

Com base em estudos anteriores [14], a cultura sub-confluente (3 × 10

5) de hMSCs aderentes foram expostos durante 24 h a 2,000 ng ml PTX /(suficiente para bloquear completamente a proliferação celular, mas não é capaz de afectar a viabilidade celular). Após várias lavagens e tripsinização, hMSCsPTX foram ainda cultivadas durante 24 h e o seu meio condicionado (CM) foi testado em Molt-4, uma linha celular de leucemia muito sensível a PTX (IC

50 de 1,48 ± 1,06 ng /ml) [ ,,,0],20]. O CM a partir de ambas as culturas de hMSCPTX (hMSCsPTX-CM) produziu um efeito anti-proliferativo dependente da dose forte em MOLT-4, equivalente aos obtidos com PTX puro em doses de 0,39 a 50 ng /ml (Fig. 1C). Em contraste, o CM a partir de células de controlo (as hMSCs-CM) não eram eficazes. Comparando-se a actividade inibidora de puro PTX e CM em Molt-4, calculou-se a concentração equivalente a PTX (PEC) no CM utilizado para estimar o PEC libertada por uma célula única (pg /célula PEC). O total PEC internalizado por hMSCsPTX em 24 h, avaliada testando os lisados ​​de células hMSCsPTX, foi de 2,67 ± 0,8 pg /célula, o que sugere que as hMSCs em 24 h poderia incorporar cerca de 8% do PTX inicialmente disponível (33,3 pg /célula). Os resultados em lisados ​​de hMSCs fixados em formalina antes PTX priming indicou alguma ligação inespecífica da PTX, que corresponde a 0,11 ± 0,01 de PEC pg /célula (cerca de 4% do total PEC presente no ligado de células vivas).

Posteriormente, foi calculado o libertação dependente do tempo de PEC por hMSCsPTX substituindo e recolher o seu CM em diferentes intervalos de tempo. actividade detectável de PEC estava presente depois de 2 h de incubação de hMSCsPTX atingindo um PEC de 1 pg /célula durante as primeiras 24 h de cultura, e uma concentração máxima de cerca de 1,7-2,0 pg /célula em 144 h (Fig. 1D). Uma vez que estes valores não aumentar com o tempo de incubação, estimou-se que cerca de 25-30% do total de PEC encontrado no ligado celular foi retido pelas células e nunca libertada. A internalização de PTX em hMSCs foi investigada por microscopia confocal utilizando fluorescente PTX (PTX-F) (fig. 2A). PTX-F localização para hMSCs foi analisada ao longo do tempo. Após 1 h de priming, a internalização de PTX-F por hMSCs foi apreciável. A coloração foi intensa e enriquecido no interior de vesículas no final da escorva (24 h). Após 24 horas, observou-se que a distribuição de PTX-F permaneceram confinados a vesículas, muitos dos quais estavam perto da membrana celular, o que sugere uma secreção possível. Para avaliar se a PTX-F foi enriquecida em vesículas derivadas do aparelho de Golgi, a análise de co-localização foi realizada em hMSCs coradas com o marcador de ceramida TR BODIPY® específica. Como pode ser visto nas manchas brancas na máscara Figura 2A, observou-se um elevado nível de co-localização entre PTX-F e BODIPY® TR ceramida, o que significa que a PTX-F foi internalizado no interior de vesículas de Golgi-derivados. Assim, a PTX-F acumula em vesículas, em vez de se acumular em microtúbulos [15], tal como muitos outros xenobióticos fazer [21], e os seus níveis diminuem em hMSCs seguintes a cinética mostrados por análise de FACS (Fig. 2A e Fig. S4).

a internalização de PTX-F foi analisada por microscopia confocal (a) em hMSCs vivo imunizadas um (1) ou 24 (24) h com PTX-F (verde) e carregados com o Golgi marcador específico BOPIPY®TR ceramida (vermelho). As células também foram observados 24 horas após a etapa de lavagem (24 + 24). PTX-F se acumula nas células e co-localiza com o aparelho de Golgi ou vesículas derivadas de Golgi. Máscara painel destaca a co-localização entre PTX-F e BODIPY®TR ceramida mostrando pontos brancos, que indicam os pixels em que ambos os sinais fluorescentes são detectáveis ​​.. linhas brancas representam o limite da célula e as setas indicam vesículas perto da membrana celular. Barra de escala: 20 ^ m. A libertação de PTX na hMSCsPTX-CM em 24 horas foi analisada por HPLC. O perfil de eluição (B) foi comparada com a de puro PTX em 1.000 ng /mL (C). A figura reporta um perfil cromatográfico de uma experiência típica em que hMSCsPTX-CM evidencia um pico que claramente identificado PTX e que foi quantificada de uma curva padrão como a PTX 68,1 ng /ml. Figura 2D relata o perfil do hMSCs CM-cultivadas na ausência de PTX. O pico rotulado como I.S. é a cefalomanina padrão interno adicionado a todas as amostras para a quantificação correcta de PTX.

A presença de PTX em hMSCsPTX-CM foi confirmada por análise de HPLC. Os cromatogramas de HPLC obtidos a partir de hMSCsPTX CM-e a partir de uma amostra padrão de PTX em PBS (1,000 ng /ml) (Fig. 2B, C) mostram que um pico de tempo de retenção idêntico de PTX foi eluída a partir da hMSCsPTX-CM. A análise por HPLC revelou a presença de outros picos inespecíficos (2,5-4 minutos), provavelmente devido aos compostos produzidos pelas células e não correlacionada com a presença de PTX porque também presente no cromatograma de controlo médias hMSCs-CM (Fig. 2D). A presença do principal metabolito PTX, o 6-alfa-hidroxi de paclitaxel, normalmente eluiu a 5,5 minutos e de outros metabolitos de PTX pode ser excluída [22].

Uma técnica de priming PTX semelhante foi aplicada ao rato SR4987 que mostrou uma cinética semelhantes de incorporação e liberação de PTX com uma maior tendência de libertação do fármaco durante as primeiras 24 h de incubação (dados não mostrados).

HMSCsPTX e SR4987PTX inibir a proliferação de diferentes tipos de TCs

in vitro

Para avaliar a

in vitro

potencial anti-tumoral de hMSCsPTX e SR4987PTX rato, que, em seguida, investigaram o efeito da hMSCsPTX-CM em duas linhas de células humanas (DU145, T98G ) e de SR4987PTX-CM na linha de células de melanoma B16 de rato. Como mostrado na Fig. 3, a adição de hMSCsPTX-cm a 1:04 – 1:08 diluição induzida até 80% de inibição do crescimento em todas as linhas de células de tumor (Fig. 3A). Na diluição 1:02, equivalente à adição de cerca de 25 ng /ml de PTX puro, obteve-se 100% de inibição do crescimento do tumor (Fig. 3B). Combinando estes dados com os da libertação cinética (Fig. 1D), podemos estimar que, em 24 horas, 3 × 10

5 hMSCsPTX pode liberar cerca de 50-60 ng /ml de PEC que são concentrações de 3-5 vezes o IC

90 valores de PTX para as células cancerosas estudados. A adição de controle hMSCs-CM não afectou a proliferação CTs (dados não mostrados). A capacidade de hMSCsPTX para inibir a proliferação CTs diferente foi confirmada por ensaio de co-cultura em que hMSCsPTX e CTs foram misturados em diferentes proporções (de 1:01 para 1:100). A presença de hMSCsPTX inibiu a proliferação de todas as linhas celulares tumorais testadas, de acordo com a sua presença proporcional (Fig. 3C, D, E). Isto permitiu-nos para calcular um valor arbitrário expresso como uma razão entre hMSCsPTX e TCs que produziu IC

50. O

50 valores IC foram 01:47 para MOLT-4, 01:05 para T98G e DU145 e só 1:2-3 para células tumorais B16. A adição de hMSCs de controlo não afectou substancialmente a proliferação CTs, embora uma inibição significativa do crescimento de baixo (p 0,02) foi observada a razão de 1:01 para todas as linhas celulares tumorais testadas

(A) é mostrado. a cinética da inibição do crescimento induzida por diluições em série de hMSCsPTX-CM em T98G, DU145 e de SR4987PTX-CM em B16, que foi comparada com a actividade de diferentes concentrações de PTX na mesma CTs (B). A adição de farelo produziu um efeito anti-proliferativo forte em todos os CTs testadas de uma forma dependente da dose: 1:16 e 1:4 diluições IC

50 e IC

90 inibição do crescimento em todas as linhas TC, respectivamente, correspondendo à PTX concentrações necessárias para obter IC

50 e IC

90 sobre as diferentes células de tumor como relatado na tabela pequena inserção em (B). A inibição da proliferação CTs também foi obtida por um ensaio de co-cultura directa. Preparado hMSCsPTX misturado, em proporções diferentes (1:100-1:10-1:1 MSC /TCS), com células MOLT-4 (C), T98G (D), DU145 (E) mostraram capacidade de dose dependente para bloquear a proliferação CTs avaliada num teste MTT aos 7 dias expressos como percentagem da dO medida para CTs cultivadas no meio de controlo sozinho (CTR) ou na presença de hMSCs não imunizadas. SR4987PTX comportou-se como hMSCsPTX. No entanto, ainda não SR4987 preparado por si só demonstrou alguma capacidade anti-proliferativo sobre o melanoma B16 em 01:01 proporção (F). Os histogramas relatam a média ± DP de três experiências, com a significância estatística do seguinte modo:

* (P 0,05)

,

** (P 0,01) contra o crescimento de células tumorais

(CTRL) .

mouse SR4987PTX funcionou como hMSCsPTX na captação e liberação da droga como testado pelo ensaio MTT em CM (Fig. 1A). No entanto, no ensaio de co-cultura, as células SR4987 “per se” se produziu uma inibição de células de melanoma B16 (p 0,05). Que não diferiu da que é produzida por SR4987PTX (Fig. 3F)

hMSCSPTX e rato SR4987PTX exibir potente

in vitro

actividade anti-angiogênico

Porque PTX é considerado um inibidor da angiogênese [16], [23], que, assim, investigou se hMSCsPTX e SR4987PTX poderia afetar a angiogênese

in vitro

(Fig. 4). A actividade anti-angiogénica do puro PTX foi inicialmente testado em células HUVEC e microvascular na ECS (HMECs) proliferação. PTX em doses de até 10 ng /ml foi extremamente citotóxico para ambas as células HUVEC e HMECs. PTX produziu cerca de 50% de inibição de crescimento de células endoteliais (IC

50) a 4,6 ng /ml (Fig. 4a). O efeito de hMSCsPTX-CM em células HUVEC e HMECs foi extremamente citotóxico em 1:2 e 1:4 diluições (Fig. 4B, C). No 01:08 hMSCsPTX-CM inibiu ambas as células HUVEC e a proliferação HMECs mas menos de 5 ng /ml de PTX puro. Resultados semelhantes foram obtidos pelo ensaio de co-cultura (Fig. 4D, E, F). Rácio 01:01 e 01:05 de hMSCsPTX /ECs produziu um efeito citotóxico forte em ambas as HUVECs e HMECs, enquanto em relação 1:10, sem citotoxicidade, mas significativa inibição do crescimento ECs foi observada (Fig. 4D, E). Curiosamente, na proporção 01:05, hMSCsPTX iniciado matando HMECs durante as primeiras 24 horas de co-cultura; após 72 h de incubação muito poucas HMECs sobreviveram (Fig. 4F). hMSCs-CM controle não afetou a proliferação de células endoteliais.

PTX inibe a proliferação de células endoteliais (A). HUVECs e HMECs (2 × 10

5) foram cultivadas durante 72 h na presença de concentrações diferentes de PTX. A IC

50 foi de cerca de 4,69 ng /ml de PTX e a 10 ng /ml de PTX bloqueou significativamente a ambas as células HUVEC e a proliferação HMECs, que em doses mais altas foi citotóxico. Da mesma forma, a adição de hMSCsPTX-CM inibir significativamente células HUVEC (B) e HMECs proliferação (C). No 1:02 de diluição, hMSCsPTX-CM foi citotóxica, enquanto em maiores 1:4 e 1:8 diluições inibir significativamente a proliferação de células endoteliais. A inibição da proliferação de células endoteliais foi obtido por ensaio de co-cultura. HMSCsPTX co-cultivadas a 1:01 e 01:05 proporção (MSC /ECs) foi citotóxico para células HUVEC ambos (D) e HMECs (E). Em razão 1:10 hMSCsPTX continuou a inibir a proliferação de células endoteliais. hMSCs de controlo não tratados não afetou ECs. Em (F) fotografias da cultura de hMSCsPTX misturado 01:05 com HMECs. As células fixadas e coradas em intervalos de tempo diferentes são mostrados. hMSCsPTX matar HMECs tão cedo quanto 24 horas após a semeadura. setas brancas indicam as ilhas de HMECs ainda presente na cultura. Note-se que depois de 72 h a maioria dos HMECs semeadas foram mortos e apenas hMSCsPTX permanecem na cultura (20 x de ampliação). Bares nas figuras são as médias ± DP de três experiências separadas realizadas em triplicado.

* p 0,05

,

** p 0,01 vs

hMSCs não tratados

O potencial anti-angiogênico do hMSCsPTX também foi investigado usando a aorta de ratos. ensaio de anel [24]. Como mostrado na Fig. 5A, a adição de 1:02 e 1:04 de diluição de hMSCsPTX-CM fortemente reduzida, quer espontânea ou surgimento de neocapillaries VEGFA induzida a partir de anéis de aorta. Diluição 1:08 de hMSCsPTX-CM que inibem a proliferação de células endoteliais da aorta não afectou a formação de capilares de anel (Fig. 5A). HMSCsPTX-CM também foi capaz de induzir a regressão capilar se adicionado a anéis de aorta após 7 dias de cultura. Sob exame microscópico, várias zonas de necrose recipiente foram observados (Fig. 5B). A adição de hMSCs-CM não afecta substancialmente a formação capilar (Fig. 5A). Resultados semelhantes foram obtidos com SR4987PTX (Fig. S5).

(A) e ensaio (B) do anel de aorta de rato foi utilizado para testar a inibição do crescimento de microvasos hMSCsPTX-CM. Em (A) hMSCsPTX-CM em diferentes diluições adicionados aos anéis de aorta de rato na presença ou na ausência de VEGFA induziu uma grande redução de crescimento capilar em relação ao meio de CTRL e hMSCs-CM. VEGFA 20 ng /ml foi usado como controle positivo (

** p 0,01 vs

hMSCs-CM). Nas fotografias (b) mostram hMSCsPTX-CM (em diluição 1:02), que induziu a regressão capilar como demonstrado pela presença de ruptura do vaso e zonas necróticas (setas) (ampliações de 20 ×). Em (C), (D) e (E) os efeitos da hMSCsPTX

in vivo

no tumor leva (C), em DU145 (D) e B16 crescimento (E) são mostrados. Cerca de 0,4 × 10

6 hMSCsPTX e controlar hMSCs não tratados foram misturados (na proporção 01:05 hMSCs /TCs /), com 2 × 10

6 DU145 ou B16 e depois injectado por via subcutânea (s.c.) em ratinhos. Os volumes dos tumores foram calculados por medição dos diâmetros tumorais tomadas a cada dois dias, com um calibre. A co-injecção de hMSCsPTX com DU145 ou B16, produziu um atraso significativo de aparecimento de tumores (C), bem como uma grande redução de DU145 (D) e o volume do tumor B16 (E), enquanto que a co-injecção com hMSCs não tratados não fez afetar volumes quer DU145 ou B16, nem a injeção de TCs misturados 5 minutos antes da injeção com 2.000 ng /ml de PTX (ver Tabela 1). A inserção em (D) e (E) é a foto de tumores de controle, hMSCsPTX e hMSCs ratos tratados no momento do sacrifício.

* p 0,05 e ** p . 0,01 vs sozinho

TCs ou

vs ratos tratados

hMSCs

hMSCsPTX e rato SR4987PTX inibir o crescimento tumoral

in vivo

in vitro

dados demonstraram que tanto hMSCsPTX e SR4987PTX foram fortemente inibidora para TCs e até mesmo citotóxica para ECs. Para ver se eles podem afetar o crescimento do tumor

in vivo

, hMSCsPTX e hMSCs controle foram co-injetado em razão de 1:05 ou com DU145 ou B16 rato células cancerosas de melanoma humano em ratinhos imunodeficientes. Os grupos de controle também foram injetados com TCs sozinho ou TCs misturados, 1-2 minutos antes da injeção, com 2.000 ng /ml de livre PTX. Na Tabela 1 e na Figura 5 os resultados estão resumidos. HMSCsPTX misturado quer com DU145 ou melanoma B16 produziu um atraso significativo no tumor demora (Fig. 5C) e reduziu tanto DU145 (Fig. 5D) e o crescimento de tumores B16 (Fig. 5E). O efeito anti-tumoral em DU145 induzida por hMSCsPTX foi mais potente do que na B16. No entanto, os pesos dos tumores de DU145 e B16 foram significativamente reduzidas pelo tratamento hMSCsPTX; 25% dos ratinhos tratados com DU145 e hMSCsPTX foram também livres de tumor (Tabela 1). Curiosamente, a co-injecção de células DU145 e B16 com uma elevada concentração de PTX livre não atrasar tumor leva ou afectar o crescimento (Tabela 1), o que sugere que a libertação dependente do tempo de PTX por hMSCsPTX é necessária para afectar a proliferação de células cancerosas. Isso também pode ocorrer

in vivo

.

Foram obtidos resultados semelhantes usando SR4987 mouse sobre B16 melanoma (Tabela 1). co-injectados com B16 (em razão de 1:05) em ratos C57B16, que são singénicos para SR4987 [14] SR4987PTX, atrasou significativamente tumor leva e reduziu B16 crescimento, embora o co-injeção com controle SR4987 “per se” produziu alguns inibitória atividade em crescimento B16 (Fig. S6).

Efeitos de SR4987PTX mouse sobre xenoenxertos subcutâneos de células U87MG de glioblastoma

Experimentos utilizando células de glioblastoma U87MG RFP + e GFP + SR4987 foram concebidos a fim de traçar os dois frações celulares e para investigar suas interações

in vivo

. Os ratos de controlo, enxertados ou com células U87MG ou com células U87MG e SR4987, demonstrou que a expressão de RFP e GFP não alterou tumorigenicidade e sobrevivência destas células no

in vivo

condição. Em geral, as células SR4987PTX teve um efeito inibidor sobre o crescimento de xenoenxertos de glioblastoma (fig. S7A-B). Nos pontos de tempo 2, 4 e 6 semanas, a RFP + U87MG /GFP + SR4987PTX xenoenxertos foram significativamente menores do que os xenotransplantes RFP + U87MG (

p Art 0,01,

p Art 0,05 e

p Art 0,001, respectivamente; Estudante de

t

-teste). No mesmo intervalo de tempo, a RFP + U87MG /xenotransplantes SR4987-PTX GFP + foram significativamente menores do que RFP + U87MG /GFP + xenotransplantes SR4987, bem como (

p Art 0,02,

p Art 0,05, e

p Art 0,001, respectivamente; Estudante de

t

-teste). A microscopia de fluorescência revelou que, no contexto do tumor, as células GFP + SR4987PTX-se dispostos em cadeias e colunas de modo a formar redes que aprisionadas as células U87MG RFP + (Fig. S7C). Por outro lado, a GFP + SR4987 que não tinham sido imunizadas com PTX foram misturados com as células de U87MG sem qualquer propensão para se organizarem em estruturas secundárias (Fig. S7C). O exame histológico revelou que as células contendo xenoenxertos SR4987, independentemente da sua iniciação PTX, não desenvolveram focos de necrose, que são normalmente vistos nos xenoenxertos U87MG no tempo de sobrevivência de 4 e 6 semanas (Fig. S7D). Tanto o tamanho e aparência histológica de U87MG e U87MG xenoenxertos /SR4987 não diferem significativamente dos xenoenxertos gerado por injecção dos vírus transduzidas células RFP + U87MG e RFP + U87MG /GFP + SR4987, respectivamente (dados não mostrados).

discussão

A linha de células SR4987 rato estromal preparado primeira

in vitro

com DXR e depois co-cultivadas com resultados HSCs em uma forte inibição de formações UFC [14]. Observando esta propriedade, que se perguntou se hMSCs e SR4987 imunizadas com uma droga anti-câncer poderia adquirir actividade anti-tumoral e, consequentemente, ser usado para a terapia do cancro.

A fim de validar essa hipótese, tanto SR4987 mouse e hMSCs foram preparadas com PTX, porque demonstrou tanto forte anti-tumoral [15], [25] e as actividades anti-angiogénicas [16], [23]. Uma vez liberado por células iniciadas, PTX poderia afetar tanto tumor e proliferação ECs

As experiências iniciais demonstraram que a PTX foi capaz de inibir hMSCs e proliferação SR4987, mas não foi citotóxico.; até 10.000 ng /ml não afetou a viabilidade celular. Esta concentração PTX foi de aproximadamente 500 vezes mais elevada do que a necessária para produzir um IC

50 em MOLT-4, uma linha celular de leucemia humana muito sensível à actividade PTX [20] que foi utilizado para monitorizar a hMSCsPTX-CM e SR4987PTX-CM atividade. Com base em um estudo anterior [14], que assim estabelecido um protocolo padrão para hMSCs de primeira linha e SR4987 com PTX, que consiste em tratar a 3 × 10

5 células aderentes com 2.000 ng /ml de PTX para 24 h em cultura. Em resumo, verificou-se que: a) as hMSCs foram capazes de incorporar rapidamente PTX como confirmado usando a PTX-F; b) hMSCsPTX pode libertam lentamente PTX, pelo menos em parte, no meio de cultura de uma forma dependente do tempo, tal como confirmado pela análise de HPLC; c) formalina hMSCs fixa e não foram eficazes para a captação PTX; d) ambos hMSCsPTX e SR4987PTX adquiriu um anti-tumoral e atividade anti-angiogénico potente

in vitro

que foi dependente da dose, e demonstrável usando seu CM ou pelo ensaio de co-cultura; e) hMSCsPTX co-injectados em ratos imunodeficientes com DU145 humana e SR4987PTX co-injectados com U87MG ou melanoma rato B16, atrasou significativamente tumor leva e reduziu o crescimento do tumor. No modelo de melanoma B16 observou-se que as células de rato são capazes de estroma SR4987 “per se” para inibir a proliferação de células tumorais a um nível semelhante ao SR4987PTX. Esta descoberta parece estar de acordo com os dados contraditórios relatados a partir da literatura sugerem que tanto a capacidade das células mesenquimais e células do estroma, para favorecer ou para inibir a progressão tumoral [26]. Em particular, o modelo de tumor B16 representa uma condição na qual foi demonstrada actividade anti-tumor de células de estroma murino [27]. Nesta condição, pode ser que PTX carregado células SR4987 aumentar a sua eficácia antitumoral basal sem um efeito mensurável significativa.

Independentemente deste resultado, podemos concluir que nossos resultados, tomados em conjunto, apoiar fortemente a nossa hipótese inicial propondo mesmo hMSCs como transportador para drogas quimioterapêuticas no ser humano. Em nossa opinião, nossos resultados revelam importantes novos insights sobre as propriedades funcionais de MSCs de mamíferos. Do ponto de vista toxicológico, os nossos resultados apoiam a ideia de que os mamíferos, pelo menos dentro do compartimento estroma BM, contêm células que podem desempenhar um papel duplo no controle da toxicidade da droga. Estas células podem reduzir ou melhorar a toxicidade do fármaco, em função da sua capacidade “para adsorver” e, posteriormente, para libertar um fármaco mesmo, como mostrado aqui para PTX, na sua forma original. Esta ocorrência

in vivo

ainda precisa ser esclarecida. No entanto, os dados de pacientes com câncer que receberam doses muito elevadas de quimioterapia parecem apoiar esta hipótese [28].