Abstract

Objectivo

O nosso estudo anterior sugeriu que as potenciais implicações clínicas de BCAR1 em cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC) (Mol Diagn Ther 2011. 15 (1):. 31-40). Aqui, pretendemos avaliar o poder preditivo de BCAR1 como um marcador de prognóstico desfavorável nos casos NSCLC, verificar os papéis cancerígenos de BCAR1 na linha celular de adenocarcinoma de pulmão A549, e testemunhar o eixo BCAR1 /fosfo-p38.

Métodos

Entre janeiro de 2006 e junho de 2010, havia um total de 182 pacientes com NSCLC (151 casos com disponíveis acompanhamento de dados, e 31 casos perdidos para follow-up, devido às informações de contato inválido). Nós inspeccionados BCAR1, fosfo-BCAR1 (Tyr410), fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) e expressão de p38 em tecidos NSCLC e correspondentes tecidos normais adjacentes por imunotransferência e IHC. Após interferência BCAR1-ARN em células A549, que inspecionou a expressão da proteína (BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 e p38) e realizado experimentos de biologia celular (crescimento celular, migração e ciclo).

Resultados

BCAR1 foi sobre-expresso em tecidos de NSCLC (177/182) e linhas de células (A549 e Calu-3). No entanto, não foi detectado no tecido adjacente normal, em 161 dos 182 casos. níveis mais elevados BCAR1 foram fortemente associada com NSCLC mais pouco diferenciado e previu pior prognóstico. BCAR1 knockdown causou a paragem do crescimento celular, a inibição da migração celular e a paragem do ciclo celular de células A549. Superexpressão de BCAR1 foi associada com ativação de p38 em casos de NSCLC e BCAR1 knockdown causou redução dos níveis de fosfo-p38 em células A549.

Conclusão

superexpressão de BCAR1 é um preditor de mau prognóstico em NSCLC e desempenha papéis cancerígenas importantes na carcinogênese, provavelmente através da activação de MAPK p38. No entanto, novos estudos são necessários imediatamente

Citation:. Huang W, Deng B, Wang R-W, Tan Q-Y, Ele Y, Jiang Y-G, et al. (2012) BCAR1 proteína desempenha um papel importante na carcinogênese e prediz mau prognóstico em Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10.1371 /journal.pone.0036124

editor: Keiran Smalley, O Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de dezembro de 2011; Aceito: 26 de março de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (NSFC) (No. 81.101.782), projeto NSFC CQ CSTC (No. CSTC2011BB5020) e NSFC Terceira Universidade médica Militar (No. 2010XQN36). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Todos os anos, há 1,35 milhão de novos casos de câncer de pulmão no mundo [1]. Mundialmente, o câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer [2]. Devido às funções biológicas complexas, o prognóstico do cancro do pulmão continua a ser muito pobre [1]. Por isso, é vital para desvendar as funções biológicas da doença por causa da melhoria da eficácia terapêutica [3].

O cancro da mama anti-estrogénio resistência 1 (BCAR1), p130cas também direito, foi um dos CAS membros proteína (substrato Crk-associado) familiares. Foi inicialmente identificada como uma proteína celular migrando a 130 kDa, e a ser hiperfosforilada em v-Crk e v-Src células transformadas [4], [5]. Inicialmente, estudos intensivos foram focados sobre a correlação entre câncer de mama e BCAR1 [6], [1], [7], [8]. Por exemplo, Brinkman et al. [7] sugeriu BCAR1 sobre-expressão na ZR-75-1 linha celular de cancro da mama torna resistência antiestrogénio para as células. Além disso, Dorssers et ai. [8] relataram que a expressão BCAR1 foi inversamente relacionada à recaída-free sobrevivência e tempo de sobrevida global de cancro da mama.

Recentemente, nosso estudo sugere que há uma implicação clínica BCAR1 no cancro do pulmão de células não pequenas-( NSCLC) [9]. Foram investigados os níveis séricos BCAR1 em 80 casos de NSCLC e 80 controlos saudáveis, respectivamente, usando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima específica (ELISA) [9]. Curiosamente, verificou-se que os níveis de BCAR1 soro eram significativamente maiores no NSCLC do que no grupo de controlo, aumentou gradualmente com a progressão de estadiamento do tumor, e diminuíram após a remoção das lesões malignas [9]. No entanto, os mecanismos oncogênicos de BCAR1 em NSCLC ainda são os enigmas.

Aqui, realizamos as novas investigações para avaliar o poder preditivo de BCAR1 como um biomarcador para prognóstico pobre em pacientes com NSCLC. E verificamos os papéis cancerígenos de BCAR1 via interferência de RNA (RNAi) na linha de células de adenocarcinoma de pulmão A549. Experimentos in vivo e in vitro demonstrou a correlação entre a expressão fechada BCAR1 e ativação de p38 que é um ramo crucial do (ativada por mitógeno proteína quinase) via MAPK [10], [11].

Materiais e Métodos

os pacientes

o protocolo do estudo foi revisto e aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa no hospital Daping (Chongqing City, República Popular da China) [referência no. TMMU-DPH /2006-012], e o consentimento informado foi escrito e obtido de todos os pacientes.

No estudo realizado entre janeiro de 2006 e junho de 2010, havia um total de 182 pacientes com NSCLC. neoplasia pulmonar foi diagnosticada radiograficamente e confirmado pela patologia. Nenhum dos pacientes havia recebido tratamento antes da inscrição no estudo. As características demográficas e clínico-patológicos de pacientes estão apresentados na tabela 1. Todos os pacientes foram submetidos a lobectomia e linfadenectomia. Cento e trinta e cinco pacientes receberam quimioterapia adjuvante pós-operatória (Paclitaxel mais nedaplatina). Acompanhamento pós-operatório estava disponível em 151 casos por telefone ou carta entrevista, e 31 casos perdidos para follow-up, devido às informações de contato inválido.

Cultura de Células

A549 e Calu -3 linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão foram obtidos a partir da American Type Culture Collection e cultivadas em RPMI 1640/10% de FBS, respectivamente

a interferência de ARN de BCAR1

em primeiro lugar, foram utilizados os seguintes pares de oligorribonucleótido.: 5′-CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 ‘e 5′-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3’. sequências inteiras foram derivados a partir da sequência de ARNm humano BCAR1. Os oligonucleotídeos foram obtidos a partir Sunbio Biotecnologia médica CO., Ltd (Xangai City, P.R.China). Os complementares duas cadeias (cada um a 20 mM) em 60 ul de tampão de emparelhamento (Sunbio Biotecnologia médica CO., Ltd., Shanghai City, P.R.China) foram aquecidos durante 5 min a 95 ° C e, em seguida, incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Depois disso, o pLVT351.LV vector lentiviral GFP-marcadas para BCAR1-RNAi foi construído inserindo os nucleótidos de ligação no local da Idade do I + EcoR I de pMAGic 4.1 (Sunbio Biotecnologia médica CO., Ltd., Shanghai City, República Popular da China).

em segundo lugar, a linha de células A549 foi plaqueada em 2,3 × 10

5 células por poço de 24 cavidades da placa de cultura de células infectadas com lentivírus e a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As células infectadas com pLVT351- LV e CMV-GFP-LV (vector lentiviral em branco, pMAGic 4.1) foi nomeado como A549-BCAR1-RNAi e controle A549-negativos, respectivamente.

análise técnica Western Blot de BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 e p38 em tecidos e células NSCLC

NSCLC e combinados tecidos normais adjacentes (pelo menos 5 cm de distância dos tumores primários) foram disponíveis a partir de um total de sessenta (incluindo 35 adenocarcinomas e 25 carcinomas de células escamosas) casos de western blot . Durante as operações, as amostras foram coletadas pelos técnicos prontamente seguintes remoções. Além disso, também preparadas as linhas de células Calu-3 incluindo, A549, A549-controlo negativo e A549-BCAR1-RNAi.

Em seguida, foram preparados lisados ​​a partir de tecidos e linhas de células num tampão RIPA compreendendo 50 mM de Tris -HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, ácido desoxicólico 0,5% e 0,02% de azida de sódio. As concentrações de proteína foram determinadas com um kit de ensaio de BCA Protein (Pierce, Rockford, IL).

As proteínas foram desnaturadas a 95 ° C durante 5 min, e 50 ug de proteína por pista foi resolvido por dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida electroforese em gel (SDS-PAGE) utilizando gel de poliacrilamida a 10%. As proteínas foram transferidas em difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Thermo), que foram depois bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente. As proteínas foram coradas imunologicamente utilizando o anticorpo anti-BCAR1 (BD Transduction Laboratories, EUA, 1:1000), anticorpo anti-fosfo-BCAR1 (Tyr410) (Abcam, EUA, 1:1000), anti-p38 (material de BD Transduction Laboratories, EUA , 1:1000) e anti-fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) anticorpo (sinalização celular Transduction Laboratories, EUA, 1:1000). Um anti-β-actina (Sigma) ou anticorpo GAPDH (Sigma) serviram como controle.

escalas de cinza de immunoblotting das NSCLC e combinados tecidos normais adjacentes foram quantitativamente analisadas utilizando aquisição de imagem e software de análise (Lab Imagem software, Bio-Rad, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

construção de microsséries de tecido e ensaio de imuno-histoquímica (IHQ) de BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 e fosfo-p38 em NSCLC tecidos

a hematoxilina e eosina (H e) -stained slides de todos os 182 casos foram inspecionados. Para cada caso, o diagnóstico patológico foi identificado em H E de slides corados e, em seguida, circulada. Um slide correspondente de tecido normal adjacente também foi marcado. tissue microarray foi construído de acordo com os protocolos previamente publicados [9]. A corrediça marcado foi alinhada com a superfície do bloco dador correspondente. Depois disso, a área foi marcada sobre os blocos de tecido de parafina. De cada amostra, núcleos de tecido com um diâmetro de 1,5 mm foram perfurados e depois vestiu em um bloco de parafina receptor. Secções (4 mm) de estes blocos de microarray foram cortadas e, em seguida, utilizado para a análise IHC

.

As secções foram incubadas com soro e solução de anticorpos primários, incluindo anticorpos anti-BCAR1 (BD Transduction Laboratories, EUA bloqueio, 1: 100), anti-fosfo-BCAR1 (Tyr410) anticorpo (Abcam, EUA, 1:100), anticorpo anti-p38 (BD Transduction Laboratories, EUA, 1:50) e anti-fosfo-p38 /Tyr182) anticorpo (Thr180 ( sinalização celular Transduction Laboratories, EUA, 1:10), o anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina-peroxidase de rábano. solução de diaminobenzidina foi utilizada como um cromogénio. As lâminas foram então contrastadas numa solução de hematoxilina. Os resultados IHC sobre a abundância de proteína foram classificados de acordo com as percentagens de células positivas a seguinte: -, coloração negativa; +, Posição fraca ( 25%); ++, Posição moderado ( 50%); +++, Posição forte (≥50%). ” 25%” foi classificada como baixa expressão, caso contrário, como alta expressão Três observadores realizada para marcar os slides e os valores médios foram obtidos finalmente

dUTP nick ensaio de rotulagem final mediada por TDT (TUNEL) de.. tecidos NSCLC

foi realizado ensaio TUNEL em cortes de tecidos de todos os 182 casos. a apoptose no tumor foi inspecionado com In kit de detecção Cell Death Situ, POD (Roche, Alemanha). as secções de tecido foram Desparafinar em xileno, e hidratados através etanol graduado e pré-tratado com recuperação de antigénios microondas (tampão citrato, pH 7,5). a peroxidase endógena foi bloqueada por 0,3% H

2O

2 em metanol durante 15 minutos. Depois disso, as secções de tecido foram tratadas com 3% de bovino albumina de soro durante 30 min e incubaram-se com a mistura reaccional de TÚNEL. (TDT: dUTP, 01:20) durante 45 min a 37 ° C As secções de tecido foram combinadas com o conversor-POD, seguido por lavagem e DAB (Zhong Shong, China) reacção de cor . Durante o procedimento de TUNEL, as secções foram lavadas em tampão fosfato salino (PBS). As secções de tecido foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas através de etanol graduado, apuradas em xileno, e montadas. Para controlos negativos, foi utilizada água deionizada, em vez de TDT. Os controlos positivos consistiam em amígdalas humana inflamada. As células foram consideradas positivas quando a reactividade intensa castanha foi detectado nos núcleos. índice apoptótico foi calculada a percentagem de mancha positiva nuclear em 1000 células em cinco locais diferentes de cada seção com uma ampliação de 400 ×.

em tempo real RT-PCR

Para avaliar a eficácia da RNAi de BCAR1, foi realizada quantitativo em tempo real de RT-PCR em células de controlo negativo A549-A549-BCAR1-RNAi e. Qualquer das células foi semeado a uma concentração de 1 × 10

5cells /poço em placas de 6 poços. Após dois dias de sementeira, o RNA total foi extraído a partir de células utilizando o reagente Trizol (Invitrogen). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado com M-MLV de transcriptase (Promega) e oligo dT. PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green PCR master mix (Takara) e o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os iniciadores de PCR foram utilizados como segue: 5′-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 ‘e 5′-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3’. A especificidade dos sinais detectados foi confirmada por uma curva de dissociação consiste de um único pico. Todas as amostras foram testadas em duplicado em cada experimento. Os valores foram normalizados por β-actina humana.

Ensaio de Crescimento de Células

Para avaliação do crescimento celular, as células de controlo negativo e A549-A549-BCAR1-ARNi foi plaqueada a 2,0 x 10

2 células por poço em placas de seis poços, respectivamente. E uma das células foi inspecionado e fotografado após coloração Giemsa, onze dias após o plaqueamento.

Cell Migration Assay

Para avaliação da motilidade celular, ensaios de migração de câmara foram conduzidos utilizando uma inserção de cultura de células ( 8 mícrons tamanho dos poros, o formato de 24 poços; Célula Invasion Assay Kit Cat CHEMICON, No. ECM550).. As células A549-negativos de controlo e A549-BCAR1-RNAi foram semeadas em duplicata, a uma densidade de 3,0 × 10

5 células /câmara. Após 48 horas, as células que não se moveu para os poços inferiores foram removidos a partir da face superior dos filtros, utilizando compressas de algodão, e as células que se tinham mudado para a superfície inferior do filtro foram coradas usando um Kit de Ensaio celular Invasão do gato. (CHEMICON, No. ECM550). A migração celular foi quantificada por contagem visual após a ser fotografado. As experiências foram realizadas em duplicado. Os valores médios para três campos aleatórios foram obtidos para cada poço.

Ensaios ciclo celular

Para a determinação de citometria de fluxo de ciclos celulares, 2,0 × 10

6 de células de controlo A549-negativo e A549 células -BCAR1-ARNi foram fixadas em etanol a 70% e coradas com iodeto de propídio, respectivamente. As células coradas foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan para ciclos celulares relativas. Os experimentos foram realizados em duplicado.

celulares de apoptose Ensaios

Foram avaliados apoptose celular usando citómetro de fluxo FACScan. 2.0 × 10

6 de células A549-negativos de controle (48 h após transfecção transitória), células de controle A549-negativos (transfecção estável), células A549-BCAR1-RNAi (48 h após transfecção transitória) e A549-BCAR1-RNAi células (transf ecção estável) foram fixadas em etanol a 70% e coradas com iodeto de propídio, respectivamente. As células coradas foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan para a apoptose de células relativo. Os experimentos foram realizados em duplicado.

Análise de Dados

A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student, Mann-Whitney U, teste de Kruskal-Wallis,

X

2 de teste e rho de Spearman, respectivamente. Morte por qualquer causa foi incluído no cálculo de sobrevivência pós-operatória. A sobrevida específica da doença foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. fatores prognósticos foram examinadas por análise uni e multivariada usando um modelo de riscos proporcionais de Cox. Todos os cálculos acima referidos foram realizadas usando SPSS versão 11.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, EUA). Um valor de p 0,05 (dois lados) foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

BCAR1 é overexpressed em tecidos e linhas celulares de NSCLC

expressão BCAR1 foi detectado (seja. no núcleo, citoplasma, ou ambos) em 57 dos 60 casos de NSCLC utilizando imunotransferência (Figura 1a), e 177 dos 182 casos de NSCLC utilizando ensaio IHC (Figura 1C), respectivamente. No entanto, não foi detectado no tecido adjacente normal em 53 dos 60 casos, utilizando imunotransferência (Figura 1a), e 161 dos 182 casos por IHC utilizando o ensaio (Figura não mostrada), respectivamente. Análise de escalas de cinzento de imunotransferência também sugerido BCAR1 níveis eram significativamente mais elevados em NSCLC do que no tecido adjacente normal (48,2 ± 24,7 vs 11,0 ± 9,8, t-teste de Student,

P

0,001, Figura 1b).

a: Immunoblotting indicado quer BCAR1 ou fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) níveis em três tecidos NSCLC (C) foram significativamente maiores do que em tecidos normais adjacentes (N). Mas fosfo-BCAR1 (Tyr410) e p38 níveis em NSCLC e os tecidos normais adjacentes foram semelhantes. BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 e expressões fosfo-p38 também foram detectados em A549 e Calu-3 linha de células NSCLC usando ensaio de imunotransferência. BCAR1 knockdown faz com que a redução significativa dos níveis de fosfo-BCAR1 e fosfo-p38 em células A549. B: Cinza escalas de análise de immunoblotting também sugeriu BCAR1 e fosfo-p38 (/Tyr182 Thr180) níveis foram significativamente maiores em NSCLC do que no tecido adjacente normal (48,18 ± 24,7 vs 10,97 ± 9,8,

P Art 0,001 ; 16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,

P Art 0,001). No entanto, fosfo-BCAR1 (Tyr410) e p38 não tinha a tendência (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22; 25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476 ). C: IHC sugeriu as expressões de BCAR1 (quer no núcleo, citoplasma), fosfo- BCAR1 (propenso para localizar no citoplasma), fosfo-p38 (propenso para localizar no núcleo), p38 (propenso para localizar no citoplasma ) e os corpos apoptóticos. Nota: N (tecido normal adjacente); C (tecido NSCLC); ** (

P Art 0,001); # (

P Art 0,05).

No entanto, foi detectada fosfo-BCAR1 (Tyr410) em citoplasma em 29 dos 60 NSCLC usando Immunoblotting (Figura 1a) e 32 casos de NSCLC os 182 casos por IHC utilizando o ensaio (Figura 1C), respectivamente. No entanto, também foi detectado no tecido adjacente normal em 30 dos 60 casos, utilizando imunotransferência (Figura 1a), e 34 dos 182 casos por IHC utilizando o ensaio (Figura não mostrada), respectivamente. Análise de escalas de cinza de immunoblotting sugeriu que não havia diferença significativa dos níveis de BCAR1 entre NSCLC eo tecido adjacente normal (25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476, teste t de Student, Figura 1b) .

BCAR1 e fosfo-BCAR1 (Tyr410) foi detectada em A549 e Calu-3 células NSCLC usando ensaio de immunoblotting (Figura 1a).

Superior BCAR1 níveis estão fortemente correlacionadas com mais pouco diferenciado tumores e prediz pior prognóstico

usando ensaio IHC nos 182 casos NSCLC, descobrimos que os níveis mais elevados BCAR1 foram fortemente correlacionada com a diferenciação mais mal. (Teste de Kruskal-Wallis,

P

= 0,01; Tabela 1). No entanto, não houve correlação significativa entre BCAR1 e outras características clínico-patológicos, incluindo idade, sexo, histologia, estádio TNM, tamanho do tumor e a metástase de linfonodo (Tabela 1). Apesar BCAR1 expressão foi detectada tanto no citoplasma, núcleo, ou ambas em NSCLC, não houve correlação significativa entre a localização de proteínas e parâmetros clínicos-patológica (dados não mostrados). Além disso, não houve correlação significativa entre a fosfo-BCAR1 e as características clínico-patológicas (dados não mostrados).

A taxa de sobrevivência de BCAR1 grupo de alto expressão foi significativamente menor do que no grupo de baixa expressão (

P

= 0,001, Figura 2a). A análise multivariada revelou que BCAR1 níveis (taxa de risco 1,777,

P

= 0,028), metástase de linfonodo (taxa de risco 1,277,

P

= 0,040) e estágio TNM (hazard ratio 1.298,

P

= 0,007) foram indicadores prognósticos significativos e independentes para casos NSCLC (Tabela 2)

A:. A taxa de sobrevivência de um grupo de alto expressa BCAR1 foi significativamente menor do que no grupo de baixa expresso (

P

= 0,001). B: células positivas Phospho-p38 foi significativamente e positivamente correlacionada com percentagens de células positivas BCAR1, nos 182 tecidos NSCLC (Rho de Spearman, coeficiente de correlação = 0,811, p 0,001). E percentagens de células positivas fosfo-p38 em BCAR1 tecidos de alto expressa foram significativamente maiores do que em tecidos de baixa expresso (Mann-Whitney U z = -3,689

P Art 0,001). C: As secções sequenciais foram coradas para BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 e p38, o que demonstra que as células que sobre-expressam BCAR1 também têm um maior nível de fosfo-p38 (× 200). Ou fosfo-BCAR1 ou p38 foi ligeiramente positivo.

BCAR1 knockdown provoca a paragem do crescimento celular, inibição da migração celular e interrupção do ciclo celular de células A549

Nós estabelecemos células A549 câncer NSCLC humanas que estavelmente expressos pLVT351-LV (células A549-BCAR1-RNAi) e CMV-GFP-L.V. (Células de controlo negativo A549-) através do uso de um sistema de lentivírus. Pelo menos uma redução de 80% nos níveis de ARNm de BCAR1 em células A549-BCAR1-ARNi foi confirmada por em tempo real de RT-PCR (Figura 3a) e Western blotting (Figura 1-A), respectivamente. Ao mesmo tempo, podemos ver a inibição de fosfo-BCAR1 juntamente com BCAR1 knockdown (Figura 1a)

A:. Pelo menos uma redução de 80% no mRNA de BCAR1 em células A549-BCAR1-RNAi foi confirmada por real tempo de RT-PCR. B: Unidades Formadoras de Colônias de A549-BCAR1-RNAi foram detectável inferior a das células de controlo A549-negativos, onze dias após o plaqueamento. C: ensaio de migração celular sugeriu BCAR1 knockout impediu a migração de células de células A549-BCAR1-RNAi. D: A citometria de fluxo indicou BCAR1 knockout também causou a parada do ciclo celular de células A549-BCAR1-RNAi. E:. Fluxo knockout BCAR1 citometria indicou não aumentou a taxa de apoptose, quer após o transiente (39,1% vs 42,1%) ou estável transfecção (0,33% vs 0,4%) em células A549

Figura 3b unidades formadoras de colónias de células A549 sugeridas-BCAR1-ARNi foram detectavelmente inferior a das células de controlo A549-negativa, onze dias após o plaqueamento (Figura 3b). Ensaio de migração celular sugeriu BCAR1 knockdown impediu a migração de células de células A549-BCAR1-RNAi (Figura 3c). E citometria de fluxo indicou BCAR1 knockdown também causou a parada do ciclo celular de células A549-BCAR1-RNAi (Figura 3d).

BCAR1 está negativamente correlacionada com índice de apoptose em tecidos NSCLC. No entanto, BCAR1 knockdown não pode aumentar a apoptose em células A549

os corpos apoptóticos foram detectados em todos os tecidos 182 NSCLC (Figura 1C). Entre os tecidos, houve uma correlação significativa e inversa entre BCAR1 e índice de apoptose (rho de Spearman, coeficiente de correlação = -0,183;

P

= 0,013). índice apoptótico em BCAR1 tecidos de alto expressa foi substancialmente menor do que em BCAR1 tecidos de baixa expresso (teste t de Student t = 2.312

P

= 0,022).

No entanto, em comparação com o controlo negativo células, BCAR1 knockout não aumentou a taxa de apoptose, quer após o transiente (39,1% vs 42,1%) ou estável transfecção (0,33% vs 0,4%) em células A549 (Figura 3e).

a superexpressão de BCAR1 correlacionados com a ativação da p38 em casos de NSCLC e BCAR1 knockdown causa redução de fosfo-p38 em células A549

Phospho-p38 expressão foi detectada em 31 dos 60 casos NSCLC usando immunoblotting (Figura 1-a), e 91 do 182 NSCLC (casos propensas para localizar no núcleo) usando ensaio IHC (Figura 1C). Semelhante à tendência de níveis BCAR1, análise escalas cinza revelou níveis de fosfo-p38 foram significativamente maiores do que em NSCLC nos tecidos adjacentes normais (16,03 ± 5,8 vs 8,0 ± 28,82,

P

0,001; Figura 1b) . No entanto, p38 não tinha a tendência (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22) (Figura 1b). Além disso, sugeriu IHC taxa positiva de qualquer BCAR1 ou fosfo-p38 foi significativamente maior em NSCLC do que no tecido normal (

P

0,001 e P 0,001, respectivamente) (Tabela 1). No entanto, p38 não tinha essa tendência (

P

= 0,62).

Nós encontramos percentagens de células positivas fosfo-p38 foi significativamente e positivamente correlacionados com os de células positivas BCAR1, em todos os 182 tecidos NSCLC (Rho de Spearman, coeficiente de correlação = 0,811, p 0,001; Figura 2b). E percentagens de células positivas fosfo-p38 em BCAR1 tecidos de alto expressa foram significativamente maiores do que em BCAR1 tecidos de baixa expresso (Mann-Whitney U z = -3,689

P Art 0,001; Figura 2b). No entanto, não houve qualquer correlação entre os níveis de fosfo-p38 (p = 0,892) fosfo-BCAR1 e.

Em uma tentativa de retratar a forte correlação entre células positivas positivos e fosfo-p38 BCAR1, que apresentou o sequencial secções coradas em um caso para BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 e p38, o que demonstra que as células que sobre-expressam BCAR1 também têm um maior nível de fosfo-p38 (Figura 2c).

níveis

em BCAR1 células Calu-3 foram detectavelmente mais elevado em comparação com as células A549 (Figura 1a). Curiosamente, Figura 1a sugeriu níveis de fosfo-p38 também teve a mesma tendência. Além disso, BCAR1 knockdown também faz com que a redução sensível da abundância fosfo-p38 em células A549 (Figura 1a).

Discussão

BCAR1 como uma proteína adaptadora localiza no cromossoma 16q22-q23

7 , e consiste principalmente em quatro porções funcionais, incluindo uma Src homologia do terminal amino 3 (SH3) domínio, um domínio Src de ligação (SBD), um domínio amplo de substrato (SD) e um domínio de hélice-laço-hélice (HLH) [12 ], [13]. BCAR1 localiza ubiquamente in vitro e in vivo [14], [15], [16], e está envolvido em vários processos celulares, incluindo a migração, a quimiotaxia, a apoptose, ciclo celular, a diferenciação e assim por diante [17], [18].

até agora, muito poucos estudos voltados para a carcinogénese do BCAR1 no câncer de pulmão. Wei et al. [19] sugerido que a fosforilação independente de ancoragem de células BCAR1 protegido adenocarcinoma do pulmão de anoikis. Recentemente, o nosso estudo sugere que os níveis séricos foram significativamente maiores BCAR1 em NSCLC do que no grupo de controlo, aumentou gradualmente com a progressão de estadiamento do tumor, e diminuíram após a remoção das lesões malignas [9]. Como resultado, nós presumido um papel oncogênico novela de BCAR1 em NSCLC. Aqui, nós teve como objetivo verificar as implicações clínicas da BCAR1 superexpressão e NSCLC, e para elucidar os mecanismos carcinogênicas de BCAR1 em NSCLC. Como esperado, verificou-se proteína BCAR1 é especialmente abundante em células NSCLC e tecidos. E os nossos estudos in vivo e in vitro mostraram a estreita correlação entre a expressão BCAR1 e ativação de MAPK p38. Embora os estudos anteriores demonstraram que a fosforilação de tirosina de BCAR1 pode ser crítica para a sinalização a jusante [20], o nosso estudo indicou que a fosfo-BCAR1 (Tyr410) foi detectada em apenas 34 dos 182 casos, e não correlacionada com características clínico-patológicos. Até agora, vários locais de fosforilação BCAR1 humano são encontrados como: tirosina resíduos aa 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666; resíduos de serina aa 134, 139, 292, 437, 639; e treonina aa 269, 326, 385. Nós presumimos que alguns sites específicos de fosforilação são críticos para as cascatas de sinalização de BCAR1 em NSCLC. Curiosamente, os tecidos normais adjacentes mostram níveis muito mais elevados de fosfo-BCAR1 que BCAR1 de proteínas (Figura 1A). Nós também confirmou a inibição da fosfo-BCAR1 juntamente com BCAR1 knockdown na tentativa de verificar a eficácia do presente anticorpo. Presumimos que uma enzima especial nos tecidos pulmonares decompõe especificamente não-fosfo-BCAR1, no entanto, fosfo-BCAR1 pode sobreviver. E todas as hipóteses acima mencionadas merecem mais mais investigações.

Nossos experimentos in vitro demonstraram que BCAR1 knockdown em células A549 causou a paragem do crescimento celular, paragem do ciclo celular e inibição de migração celular. Embora BCAR1 knockdown em células A549 não causar apoptose celular, houve uma correlação inversa entre apreciável e BCAR1 e índice apoptótico em tecidos NSCLC. Não sabemos as razões para a discrepância entre células e tecidos NSCLC. Além disso, nosso estudo in vivo demonstraram que os níveis BCAR1 foram significativamente e inversamente correlacionada com a diferenciação do tumor, por qualquer contagem percentuais positivos de células (teste de Kruskal-Wallis,

P

= 0,010) ou avaliar a intensidade manchado (achromasy = 0 , stramineous = 1, buffy = 2, marrom = 3; teste de Kruskal-Wallis,

P

= 0,014). Kaplan-Meier também indicou que os níveis mais elevados de BCAR1 previu pior prognóstico em 151 casos com válidas acompanhamento de dados. Todos os experimentos acima mencionados sugeriu BCAR1 teve um papel crucial na carcinogênese. Além disso, é conhecido como BCAR1 substrato Src, AZD0530 e inibidor de Src também pode resultar em inibição significativa da migração celular e invasão de matrigel em células de cancro do pulmão [21], o que potencialmente suporta a carcinogénese do eixo Src /BCAR1.

utilizando imunotransf erência, Greenberg et ai. [22] verificou que apenas activado p38 MAPK foi consistentemente aumentada em NSCLC em comparação com o tecido normal, o que sugere uma função adicional para este percurso no crescimento de células malignas ou transformação. De facto, numerosos estudos tinham revelado as actividades carcinogênicas de p38, incluindo a estimulação da proliferação e migração de [1], [23], [24]. Matsuda K et al. [23] verificaram que o EGF promove a proliferação através de p38 MAPK cascatas de sinalização em ASPC-1, PANC-1 e T3M4 linhas celulares de cancro pancreático, e SB203580 inibidor de p38 MAPK pode inibir mitogénese estimulada por EGF. Além disso, a via da MAPK p38 tem sido implicada como desempenhando um papel importante na migração de células endoteliais, porque a inibição da actividade de p38MAPK sub-regula a migração estimulada por VEGF [24]. Recentemente, de Wendt et ai. Estudo [25] demonstraram que a expressão crescente de quer a de comprimento completo ou apenas o terminal carboxilo de BCAR1 em células epiteliais mamárias de aumento de activação de p38. Curiosamente, em 182 tecidos NSCLC, encontramos houve uma estreita correlação entre a expressão de BCAR1 e fosfo-p38. Ao avaliar a intensidade manchado de fosfo-p38 e BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, buffy = 2, marrom = 3, ” 2 scores” foram classificados como baixa expressão, caso contrário, como alta expressão), encontramos a abundância de fosfo-p38 também foi significativamente e positivamente correlacionada com a de BCAR1 (rho de Spearman, p 0,001). Além disso, BCAR1 knockdown também causou a redução sensível dos níveis de fosfo-p38 em células A549 no entanto, os mecanismos subjacentes merecem mais investigações Além disso..