Sumário

Lipocalina do tipo da prostaglandina D-sintase (PGDS-G) é um membro da superfamília de lipocalina, que é composta de proteínas transportadoras de secreção, e liga-se uma grande variedade de pequenas moléculas hidrofóbicas. A utilização desta função, que têm relatado a viabilidade do uso de L-PGDS como um veículo de entrega de drogas novo para drogas fracamente solúveis em água. Neste estudo, que mostram o desenvolvimento de um sistema de entrega de droga utilizando L-PGDS, uma que permite a utilização clínica directa da 7-etil-10-hidroxi-camptotecina (SN-38), um fármaco anti-cancro fracamente solúvel em água . Na presença de 2 mM de L-PGDS, a concentração de SN-38 em PBS aumentaram 1130 vezes, em comparação com o que em PBS. experiências de calorimetria revelaram que L-PGDS ligado SN-38 numa proporção molecular de 1: 3 com um valor constante de dissociação de 60 uM. Os resultados de uma

In vitro

ensaio de inibição de crescimento revelou que os complexos SN-38 /G-PGDs mostraram elevada actividade anti-tumoral contra 3 linhas de células de cancro humano, ou seja, Colo201, MDA-MB-231, e PC-3 com uma potência semelhante à de SN-38 utilizados sozinhos. A administração intravenosa de complexos de SN-38 /L-PGDs a ratinhos portadores de tumores Colo201 mostrou um efeito anti-tumor pronunciado. mucosite intestinal, o que é um dos efeitos secundários desta droga, não foi observada em ratinhos administrados complexos de SN-38 /G-PGDs. Tomados em conjunto, L-PGDS permite a utilização directa de SN-38 com efeitos secundários reduzidos

citação:. Nakatsuji H, Inoue H, Kohno M, Saito M, Tsuge S, Shimizu S, et al. (2015) Human Lipocalin-Type prostaglandina D sintetase-Based Drug Delivery Sistema de mal solúvel em água Anti-Cancer da droga SN-38. PLoS ONE 10 (11): e0142206. doi: 10.1371 /journal.pone.0142206

editor: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN

Recebido: 10 Agosto, 2015; Aceito: 19 de outubro de 2015; Publicação: 03 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Nakatsuji et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios 25242046 (para TI) e 21200076 (de TI) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (http: //www .jsps.go.jp /Inglês /)

competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A maioria dos compostos que exibem anti-tumoral as actividades são conhecidos por serem insolúveis em água e têm efeitos secundários graves em tecidos e órgãos normais, limitando assim a sua eficácia clínica e a utilização deles [1]. Algumas abordagens comuns para melhorar a solubilidade de drogas anti-cancro estão a modificação química de medicamentos e a utilização de solubilizantes, tais como solventes orgânicos, agentes tensioactivos, lípidos, ciclodextrina, e modificadores de pH. No entanto, a modificação química da droga diminui a sua potência em muitos casos. A utilização de solubilizantes é limitada devido à sua toxicidade e tendência para causar a instabilidade da droga. Assim, os sistemas de administração de fármacos (DDSS) para drogas anti-cancro fracamente solúveis em água que tornam eficaz o uso de diferentes tipos de veículo de distribuição de tamanho nano, tais como lipossomas, micelas de polímero, e os dendrímeros, têm sido investigados intensamente [2-5]. Estes DDSs estabelecido, no entanto, também foram encontrados alguns problemas associados com toxicidade, imunogenicidade, hemólise, e trombogenicidade [6, 7]. Por conseguinte, existe uma necessidade premente para o desenvolvimento de um novo DDS para drogas anti-cancro pouco solúveis em água; e, portanto, muito esforço tem sido focado na melhoria da potência, melhorar a segurança, e aumentar a solubilidade desses medicamentos.

relatado anteriormente que um novo tipo DDS utilizando-lipocalina sintase da prostaglandina D (L-PGDS, Fig 1A), um membro da família de proteínas lipocalina e uma molécula não-tóxico e não-imunogénico, pode facilitar a farmacêutica e os desenvolvimentos clínicos de compostos pouco solúveis em água, tais como o diazepam e 6- nitro-7-sulfamoylbenzo [f] quinoxalina -2,3-diona, para utilização por administração oral ou intravenosa [8]. L-PGDS é uma actuação proteína multifuncional como o DGP

2 produtoras de enzima [9], um sequestrante de espécies de oxigénio reactivas [10], e um transportador de proteína secretora para várias moléculas lipofílicas pequenos [11]. Além disso, demonstramos recentemente que a L-PGDS age como um limpador de biliverdina, cujos produtos estão envolvidos em degradação do aneurisma vasoespasmo induzido por hemorragia subaracnóide e morte de células neuronais [12]. L-PGDS tem uma dobra lipocalina típico que consiste de um barril β-antiparalelo com oito cadeias, e o interior do tambor este forma uma cavidade hidrofóbica [13-15], que se podem ligar uma grande variedade de ligandos lipofílicos dentro dela [11, 16 ]

(A) estrutura cristalina de L-PGDS humana. (massa molecular: 18.777,7, PDB ID: 3O2Y). (B, C) As estruturas químicas de SN-38 (massa molecular relativa: 392,4) e CPT-11 (massa molecular relativa: 677,2)

SN-38, 7-etil-10-hidroxi. -camptotecina (Fig 1B), é um análogo semi-sintético do alcalóide camptotecina anti-cancro que tem como alvo a topoisomerase I de ADN [17]. No entanto, apesar da sua actividade anti-tumoral potente, SN-38 não foi utilizado directamente na prática clínica devido à sua pobre solubilidade em água [18]. Além disso, o anel de lactona de SN-38 mostra a hidrólise dependente do pH reversível, e a um pH abaixo de 5,0, SN-38 existe numa forma activa com um anel de lactona estreita na sua estrutura, ao mesmo tempo que pode ser convertido numa forma carboxilado inactiva ao pH fisiológico por abertura do anel [19]. Assim, é difícil utilizar SN-38 sob uma condição fisiológica. Por outro lado, o cloridrato de irinotecano (CPT-11, a Fig 1C), que é um pró-fármaco solúvel em água de SN-38, é utilizado em combinação com fluoropirimidinas como terapia de primeira linha para os pacientes com cancro colo-rectal avançado [20]. No entanto, a modificação química de SN-38 diminui a sua actividade anti-tumoral, levando a 1000 vezes menos actividade citotóxica de CPT-11 em comparação com a de SN-38 contra várias linhas de células de cancro in

in vitro

[21 , 22]. Assim, a utilização directa do SN-38 como uma forma ativa usando DDS pode ser grande vantagem para o tratamento do câncer.

Aqui, nós detalhe o desenvolvimento de um DDS usando humano L-PGDS, que permitiu o uso direto de SN-38. Investigou-se o efeito da L-PGDS na solubilidade de SN-38, e analisou a interacção entre L-PGDS e SN-38, usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e SAXS (SAXS). A actividade citotóxica dos complexos de SN-38 /L-PGDs foi avaliada através da utilização de colo-rectal humano, da mama, e linhas celulares de cancro da próstata. A sua actividade anti-tumoral foi examinado no modelo de xenoenxerto de Colo201 tumor colo-rectal humano. Para estimar os efeitos secundários destes complexos, foi realizada a análise histopatológica e medidos os níveis de citocinas inflamatórias de expressão no intestino delgado. Finalmente, foi realizada anafilaxia teste para avaliar a potência imunogénica de L-PGDS. Os resultados, em conjunto, demonstrou humano L-PGDS para ser um veículo de entrega de droga potente para SN-38.

Materiais e Métodos

Materiais

SN-38 foi adquirido de Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tóquio, Japão); e CPT-11, da Yakult Honsha Co., Ltd. (Tóquio, Japão).

Purificação de recombinante humana L-PGDS

C65A /C167A (ε

280 = 25900 M

-1 cm

-1) substituído com L-PGDS foi expressa como uma glutationa

S

-transferase proteína de fusão em

Escherichia coli

BL21 (DE3; TOYOBO, Osaka, Japão) tal como descrito anteriormente [16]. A proteína de fusão foi obrigado a glutationa Sepharose 4B (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, UK) e incubadas durante a noite com 165 unidades de trombina para liberar a L-PGDS. A proteína recombinante foi ainda purificado por cromatografia de filtração em gel com Superdex 75 HiLoad 26/600 (GE Healthcare Bio-Sciences) em 5 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) e, em seguida, foi dialisada contra solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Solubilidade

Uma quantidade em excesso de SN-38 foi adicionado ao tampão de PBS (pH 7,4). A suspensão SN-38 /PBS foi pré-incubada a 37 ° C durante 30 min, e depois misturada com uma solução de L-PGDS. Esta solução foi então agitada a 37 ° C durante 6 h e depois concentrou-se utilizando um filtro Amicon Dispositivo ultracentrífugo (Millipore Corporation, Bedford, MA). O espectro de absorção do filtrado foi obtido por utilização de uma cuvete de quartzo de 1,0 cm-caminho de luz e DU800 espectrómetro (Beckman Coulter, Pasadena, CA). As concentrações de SN-38 foram determinados por espectroscopia com base no coeficiente de absorção molar de ε

380 em DMSO para SN-38 = 20985 H

-1 cm

-1.

titulação isotérmica calorimetria (ITC) medições

calorimétricos experiências foram realizadas com um instrumento MicroCal VP-ITC (GE Healthcare Bio-Sciences), com a amostra em tampão PBS (pH 7,4) contendo 5% de DMSO (v /v) a 37 ° C. L-PGDS (840 uM) na seringa de injecção reversa foi titulada em SN-38 a 50 mM na célula. experiências de titulação consistiu em injecções de 50 espaçados a intervalos de 300 seg. O volume de injecção foi de 2 ou 5 ul de cada injecção, e a célula foi continuamente agitada a 286 rpm. O calor de diluição correspondente de L-PGDS tituladas para o tampão foi utilizado para corrigir os dados. Os parâmetros termodinâmicos foram avaliados usando o one-conjunto de modelo de sítios de ligação independentes fornecido por 7,0 software MicroCal Origin.

espalhamento pequeno ângulo de raios-X (SAXS) medições

SN-38 /complexos de L-PGDs em tampão PBS foram passados ​​através de um filtro para remover os compostos insolúveis. A concentração de proteína de cada amostra foi ajustado para se adequar as experiências de SAXS (3,0 mg /ml a 12,0 mg /ml). dados de SAXS foram recolhidos no feixe de linha na mola BL40B2-8 (a instalação de radiação sincrotrão, Hyogo, Japão), e todos os procedimentos experimentais foram os mesmos como descrito anteriormente [23]. Bidimensionalmente padrões de dispersão gravadas foram convertidas para perfis unidimensionais pelo cálculo da média circular. As contribuições para dispersar o solvente de intensidades foram eliminados a partir de dados brutos por subtracção da curva de intensidade obtida para a solução tampão. A fim de calcular o raio de giração para cada proteína, o perfil de dispersão foi analisada por aproximação de Guinier, tal como descrito na literatura e no nosso relatório anterior [23]. A cada passo, a interferência interpartículas e o efeito de agregação na amostra foram cuidadosamente eliminados.

cultura celular

linha de células de cancro do cólon humano Colo201 foi comprado de Ciências da Saúde Research Resources Bank (Osaka, Japão); e linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231, da American Type Culture Collection (Manassas, VA). linha de células de cancro da próstata humano PC-3 foi gentilmente cedido pelo Prof. R. Yamaji (Osaka University, Osaka, Japão). Colo201 e células PC-3 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japão) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico (Life Technologies, Carlsbad, CA), enquanto que o MDA-MB-231 foram cultivadas em D-MEM (Wako) contendo 10% de FBS.

In vitro

crescimento ensaio de inibição

Os efeitos da SN 38-complexos /L-PGDs, SN 38, e CPT-11 no crescimento de células de tumor foram examinadas através da realização do ensaio WST-8 (Nacalai Tesque, Quioto, Japão). Adenocarcinoma do cólon Colo201-derivada, adenocarcinoma de mama derivada de MDA-MB-231, e células da próstata derivadas de adenocarcinoma PC-3 foram usadas neste ensaio. Estas células foram semeadas em placas de 96 poços a densidades de 5 × 10

3 células /poço para 8 × 10

3 células /poço. Após uma cultura de 24 h, as células foram tratadas com várias concentrações de SN-38 complexos /L-PGDs, SN-38 ou CPT-11 durante 48 h, e, em seguida, a solução de WST-8 foi adicionado ao meio de cultura. Em seguida, as células foram incubadas durante 3 h a 37 ° C. A absorvância de formazano produzido a partir de WST-8 foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas, modelo 680 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

estudo animal

Todos os ratinhos usados neste estudo foram adquiridos a Japan SLC Inc (Shizuoka, Japão). Os ratos foram alojados em um cronograma claro-escuro de 12 h /12 h com comida e água disponível

ad libitum Compra de uma semana para permitir a recuperação do stress de transporte. Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pela Prefeitura de Osaka Animal Care University e do Comitê Use (Permit Number: 21-135). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia isoflurano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

In vivo

crescimento ensaio de inibição

Cinco semanas de idade do sexo feminino BALB /c nu os ratinhos foram injectados por via subcutânea no flanco direito com 5 × 10

6 Colo201 células. Quando o volume do tumor tinha atingido 150 mm

3, estes ratos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos de teste. SN-38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 1,0, 2,0 ou 2,8 mg /kg /d, a CPT-11 numa dose de 4,0 ou 20 mg /kg /d, ou PBS sozinho foi administrado por via intravenosa todos os dias durante 2 semanas. O comprimento (a) e a largura (b) do tumor e o peso corporal foram medidos diariamente, e o volume do tumor foi calculado como 1/2 (um × b

2).

Estudos patológicos na mucosa do intestino delgado

PBS ou SN-38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 2,8 mg /kg /d foram administrados por via intravenosa a ratos ddY machos com 5 semanas de idade, ao mesmo esquema de dose como os utilizados no ensaio de inibição de crescimento

in vivo

. No dia 15 após a primeira administração, os ratinhos foram sacrificados; e, em seguida, foram isolados os seus intestinos delgados. As amostras foram fixadas em formalina a 10%, desidratados e embebidos em parafina, após o que secções de espessura 5 mícrons foram preparadas e coradas com hematoxilina-eosina.

análise em tempo real de RT-PCR

o ARN total foi extraído a partir do intestino delgado através da utilização RNAiso Além disso (Takara, Shiga, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN foi transcrito reverso com os reagentes de um kit de reagente PrimeScript RT (Takara). análise de PCR em tempo real foi realizada por usar o Thunderbird

® qPCR Mix (TOYOBO), e amplificação foi monitorada com um termociclador Dice

® Sistema Tempo real II (Takara). Os iniciadores utilizados para esta análise estão listados na Tabela S1.

Anafilaxia teste

ratinhos ddY macho de seis semanas de idade foram sensibilizados com ovalbumina de galinha, quer (OVA, Sigma, Tóquio, Japão) ou L -PGDS. OVA (2mg /ml) ou L-PGDS (2 mg /ml) foi suspenso numa quantidade equivalente a 13 mg /hidróxido de alumínio ml (Sigma) como adjuvante, e a suspensão (100 ul) foi administrado subcutaneamente em cada ratinho . Depois de 14 dias, quer com OVA ou L-PGDS (1 mg /mL) foi administrada por via intravenosa e a temperatura do corpo foi depois monitorizado pela utilização de um não-contacto Thermofocus termómetro de infravermelho, Thermofocus (TECNIMED SRL, Varese, Itália).

a análise estatística

os dados foram analisados ​​usando

t

teste de Student quando os grupos apresentaram variações iguais (teste F) ou com o teste de Welch quando eles mostraram variâncias desiguais (teste F). Os resultados foram considerados significativos ao nível de significância de 5% (

P Art 0,05). Todos os testes estatísticos foram dois lados.

Resultados

Melhoria da solubilidade do SN-38, L-PGDS

Para examinar o efeito da L-PGDS na solubilidade de SN-38, foi medida a concentração de SN-38 em PBS com ou sem L-PGDS. SN-38 poderia ser dissolvida em PBS apenas até 1,5 uM sem L-PGDS. No entanto, quando 2 mM de L-PGDS foi adicionado a PBS, a solubilidade do SN-38 aumentada até 1.700 uM, que foi 1130 vezes, em comparação com o que em PBS. Além disso, foram realizadas medições de TIC e de SAXS para investigar o modo de ligação detalhado do SN-38 a L-PGDS. Em medições ITC, pela titulação de L-PGDS a SN-38, detectamos reacções exotérmicas, o que indica mudanças de entalpia favoráveis ​​após a ligação (Fig 2A, painel superior). Depois de cada integração da área do pico, o calor integrado obtidos para a ligação a SN-38 foi representada graficamente contra a razão molar ([L-PGDS] /[SN-38]) (Figura 2A, painel inferior). A isotérmica de ligação foi ajustada utilizando o one-definida do modelo de sítios de ligação independentes, e os resultados revelaram que L-PGDS formou um complexo 1: 3 com SN-38 com uma constante de dissociação (

K

d ) valor de SN-38 para G-PGDS de 60 ± 4,0 uM. Os valores de variação de entalpia e entropia prazo para ligação SN-38 a L-PGDS foram -17 ± 0,13 e -8,5 ± 0,22 kJ /mol, respectivamente. Estes resultados mostraram que a interacção entre L-PGDS e SN-38 foi entalpia-dirigido. Em seguida, em medidas de SAXS, as curvas de intensidade de espalhamento de L-PGDS e SN-38 /complexos de L-PGDs revelou que os complexos de L-PGDs e SN-38 /G-PGDS foram monodispersa sem mostrar qualquer agregação até a concentração de proteína de 640 uM (Fig 2B). Estas curvas foram semelhantes, mas, obviamente, diferente apenas na região de pequeno ângulo (um vetor de reciprocidade (

S

) 0,02 Å

-1, Fig 2b, inserir). Os valores de raio de giração de SN-38 /complexo de G-L-PGDS PGDS e foram calculadas para ser de 18,1 ± 0,09 para 16,5 ± 0,20 Å, respectivamente. Estes resultados demonstraram que a estrutura de L-PGDS diminuiu quando a proteína ligada SN-38.

(A), calorimetria de titulação de SN-38 com L-PGDS. L-PGDS na seringa de injecção foi reversamente titulado para SN-38 na célula. O painel superior mostra a alteração no calor ao longo do tempo como L-PGDS foi titulada em SN-38. O painel inferior mostra a variação normalizada no calor depois de subtrair dados de referência de injeções L-PGDs em PBS. O one-conjunto de modelo de sítios de ligação independente foi usado para ajustar as isotérmicas de ligação. (B) Os perfis de SAXS do SN-38 /L-PGDS complexo (linha azul) L-PGDS (linha vermelha) e. Estes perfis foram obtidos por extrapolação de todos os dados em diferentes concentrações (12, 9,0, 6,0, e 3,0 mg /ml) para a concentração zero. O logaritmo da intensidade de dispersão é mostrado como uma função do vector recíproco (

S

). A inserção mostra o logaritmo da dispersão intensidade na pequena

S e região.

In vitro

crescimento ensaio de inibição

A fim de investigar o efeito inibidor da /L-PGDS complexo SN-38 sobre o crescimento de células

in vitro

, medimos a actividade anti-tumor de complexos de SN-38 /G-PGDs 3 contra linhas celulares de cancro humano, Colo201, MDA-MB-231, e PC-3, através da realização de ensaios de WST-8. SN-38 /complexos de L-PGDs, SN-38, e CPT-11 foram dissolvidos separadamente em PBS e diluiu-se com meio de cultura para as concentrações apropriadas. Todas as amostras reduziu a viabilidade celular de todas as linhas de células de cancro 3 de um modo dependente da concentração (Fig 3). O IC calculado

50 valores estão resumidos na Tabela 1. A IC

50 valores de Sn 38-complexos /L-PGDs sobre o crescimento de Colo201, MDA-MB-231, e células PC-3 foram de 35 ± 6.5, 900 ± 190 ± 1,5 e 10 nM, respectivamente, indicando que o complexo foi mais potente contra células PC-3. Em contraste, aqueles de CPT-11 no crescimento de Colo201, MDA-MB-231, e células PC-3 foram de 26 ± 4,1, 35 ± 5,2 e 9,8 ± 0,75 pM, respectivamente. Assim, os efeitos inibidores destes /L-PGDs-complexos SN-38 sobre o crescimento de células foram 39- e 980 vezes mais potente do que os de CPT-11. Além disso, o CI

50 valores de SN-38 para a inibição do crescimento de Colo201 e células PC-3 foram de 15 ± 0,66 e 18 ± 2,4 nM, respectivamente, semelhantes às do SN-38 /G-PGDS complexo. Assim, SN-38 mostraram alta actividade citotóxica quando foi possível ser solubilizado em água. No caso de MDA MB-231, SN-38 a 1? M, a sua concentração máxima em PBS, diminuiu a viabilidade celular apenas para cerca de 80%, e, assim, o IC

50 valor de SN-38 não pode ser obtida (Fig 3B). Estes resultados demonstraram que o /L-PGDS complexo SN-38 tinha uma potência do fármaco semelhante ao do SN-38 sozinho.

Os dados são expressos como a média ± SE. (

n

= 6).

In vivo

crescimento ensaio de inibição

Foi avaliada a actividade anti-tumoral do SN-38 /complexos de L-PGDs em ratinhos portadores de tumores Colo201. Figura 4A mostra o efeito de administrações intravenosas de SN-38 /complexos de L-PGDs sobre o tumor em ratinhos Balb /c nus portadores de tumor no seu flanco direito. O grupo PBS-administrado apresentou um aumento progressivo do volume do tumor, atingindo 572 ± 62,8 milímetros

3 no dia 15 após a primeira administração de PBS. No grupo de CPT-11 administrada (4,0 mg /kg /d), o volume de tumor aumentou rapidamente, de um modo dependente da dia e atingiu 555 ± 31,3 milímetros

3 no dia 15 após a primeira administração de CPT-11, mostrando nenhuma actividade anti-tumoral. Este padrão de aumento dependente da dia foi semelhante ao que para os ratinhos tratados com PBS utilizadas como um controlo. Em contraste, embora o crescimento do tumor nos ratos tratados com uma dose elevada de CPT-11 (20 mg /kg /d) foi quase a mesma que a observada em murganhos tratados com PBS por dia 6 após a primeira administração, o crescimento depois foi inibida. O volume do tumor foi significativamente diferente daquela do grupo PBS-administrada após o dia 11, e atingiram 231 ± 36,5 milímetros

3, que é 40,4% do que no grupo de PBS-administrada no dia 15 após a primeira administração. Por outro lado, embora o crescimento do tumor nos ratos tratados com SN-38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 1,0 mg /kg /d também foi quase a mesma que a observada em ratinhos PBS ou CPT-11-tratada por 4 dias após a primeira administração, o crescimento foi inibido mais tarde. O volume do tumor foi significativamente diferente daquela do grupo PBS-administrada após o dia 11, e atingiram 301 ± 37,9 milímetros

3, que é 52,6% do que no grupo de PBS-administrada no dia 15 após a primeira administração. Além disso, nos ratos tratados com SN 38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 2,0 mg /kg /d (que é uma dose equimolar de CPT-11 a uma dose de 4,0 mg /kg /d) ou a 2,8 mg /kg /d, observou-se a regressão do tumor após o dia 4. após 8 dias, o volume do tumor dos ratinhos tratados com SN-38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 2,0 mg /kg /d ou 2,8 mg /kg /d foi significativamente menor do que a observada no grupo de PBS-administrada, alcançando 249 ± 19.9 e 212 ± 36,9 milímetros

3, respectivamente, que foi de 43,5 e 37,1%, respectivamente, do que no grupo de PBS-administrada no dia 15 depois a primeira administração. Assim, a /G-PGDS complexo SN-38 demonstrou actividade significativa e dependente da dose anti-tumoral. No grupo (0,0029 mg /kg /d, a sua concentração máxima em PBS) SN-38-administrada, no entanto, o volume de tumor aumentou de um modo dependente-dia com o crescimento do tumor semelhante ao do PBS ou CPT-11-administrado grupo (4,0 mg /kg /d) e atingiu 536 ± 79,6 milímetros

3 no dia 15 após a primeira administração (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que SN-38 /solução de PBS teve qualquer actividade anti-tumoral significativa

In vivo

. Além disso, a fim de avaliar os efeitos secundários da /L-PGDS complexo SN-38, que registou o peso corporal dos ratinhos diariamente durante o tratamento (Fig 4B). No grupo de PBS-administrado, não foi observada a mudança de peso corporal. No grupo (20 mg /kg /d), no entanto, observou-se a perda de peso corporal CPT-11-administrado, e não recuperou para níveis normais em dia15 após a primeira administração. Por outro lado, em SN-38 grupos /L-PGDs complexos-administrados, a perda de peso corporal significativa não foi observada dentro de 15 dias após a administração. Estes resultados, tomados em conjunto, sugerem que a administração intravenosa de complexos de SN-38 /G-PGDs a uma dose baixa apresentou maior actividade anti-tumoral do que CPT-11.

volumes (A) de tumor de PBS, CPT-11-, e SN-38 /L-PGDs grupos administrados com complexos. células Colo201 foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito de ratinhos. PBS, a CPT-11 numa dose de 4,0 ou 20 mg /kg /d, ou SN-38 a uma dose de 1,0, 2,0 ou 2,8 mg /kg /PGDs-complexos de L-/d foi administrado intravenosamente uma vez em dias alternados durante 2 semanas. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 comparado com PBS. alteração de peso (B) do corpo de ratos depois de cada tratamento. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 comparado com PBS. As barras de erro do grupo administrado com complexo SN-38 /G-PGDS a uma dose de 2,8 mg /kg /d estão expressos como a média ± SE de 4 experiências independentes; e as dos outros, como a média ± SE de 6 experiências independentes.

Avaliação da toxicidade intestinal do complexo SN-38 /G-PGDS

É bem conhecido que um dos principais efeitos colaterais clínicos da CPT-11 é a diarreia grave [24, 25]. Vários relatórios demonstraram que a administração de CPT-11 induz a mucosite intestinal caracterizadas pela perda da arquitectura da cripta e a produção de citocinas inflamatórias [26, 27]. Assim, foram investigados por meio de análise histopatológica e a medição dos níveis de expressão de diversas citocinas inflamatórias no intestino delgado ou não esses efeitos colaterais da CPT-11 foram manifestados pela /L-PGDS complexo SN-38 (Fig 5). Os murganhos administrados por via intravenosa, SN-38 complexos /L-PGDs a uma dose de 2,8 mg /kg /d, usando o mesmo esquema de dosagem como utilizada para o ensaio de inibição de crescimento não mostra qualquer diarreia. As observações histológicas da mucosa intestinal demonstrou a preservação das vilosidades e de cripta arquitectura, que era semelhante ao observado no grupo de PBS-administrada (Figura 5A), indicando assim que o /L-PGDS complexo SN-38 não induziu intestinal lesões. Além disso, os níveis de expressão de interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1β (IL-1β) no intestino dos ratos administrados SN-38 /complexos de L-PGDs ficaram inalterados em comparação com os dos ratinhos que se administrou PBS ( 1.3- e 1,0 vezes, respectivamente; Figura 5B). Por outro lado, no intestino dos ratos administrado lipopolissacárido, como um controlo positivo, foi observada a sobre-regulação de IL-6 e IL-1β (dados não mostrados). Assim, estes resultados revelaram que a administração da /L-PGDS complexo SN-38 não mostra quaisquer efeitos secundários, tais como a mucosite intestinal.

(A) Histologia da mucosa ileal. O encarte mostra a arquitetura vilosidades. A barra de escala representa 100 fim. O painel da esquerda mostra a mucosa ileal dos ratos administrados complexos de Sn-38 /G-PGDS; ea da direita, a dos ratos administrados PBS. A mucosa ileal em ambos os grupos foi quase a mesma. os níveis de (B) a expressão de citocinas inflamatórias na mucosa ileal. Cada barra representa a média ± SD (

n

= 3).

Avaliação da potência imunogênica do ser humano L-PGDS

Finalmente, avaliamos que seja humano L-PGDS era imunogênica ou não para os ratos (Fig 6). A temperatura corporal de ratinhos sensibilizados com OVA após a administração intravenosa de OVA rapidamente caiu. Esta diminuição da temperatura do corpo não se recuperar para até 60 minutos após a administração. Por outro lado, a temperatura do corpo de ratos L-PGDS-sensibilizadas humanos após a administração intravenosa de L-humano PGDS não diminuiu. Estes resultados revelaram que L-PGDS não causou quaisquer respostas anafilaxia nesses camundongos.

Mudança na temperatura corporal de ratos. Os ratinhos foram sensibilizados com OVA ou L-PGDS, e depois desafiados com OVA (○) ou L-PGDS (●). A temperatura corporal foi medida durante 60 minutos. Os dados são expressos como a média ± SE de 6 experiências independentes.

Discussão

Neste estudo, nós mostramos a viabilidade do uso humano L-PGDS como um veículo de entrega de drogas romance para SN-38, um fármaco anti-cancro fracamente solúvel em água. As medições de solubilidade revelaram que a concentração de SN-38 foi significativamente melhorada na presença de L-PGDS. Além disso, os resultados do

In vitro

ensaio de inibição de crescimento revelou que o /L-PGDS complexo SN-38 mostraram uma actividade anti-tumoral potente, e que a formulação complexa não afectar a potência do fármaco de SN-38 . Além disso, os resultados do

In vivo

experiências revelaram que a administração intravenosa de SN-38 /complexos de L-PGDs resultou numa actividade anti-tumoral acentuada, sem os efeitos secundários típicos de SN-38, tais como intestinal mucosite. Estes resultados demonstraram que a formulação complexa usando humano G-PGDS torna agora possível a utilização de SN-38 para o tratamento do cancro.

SN-38 possui uma actividade anti-cancro eficaz contra várias linhas celulares de cancro colo-rectal, tais como, pulmão, pâncreas, e de células do cancro do ovário [21, 22], mas que não tem sido utilizado clinicamente devido à sua fraca solubilidade em água e solventes f armaceuticamente aceitáveis ​​tais como etanol. Embora a CPT-11, um pró-fármaco solúvel em água de SN-38, é utilizado em alternativa para o tratamento de cancro colo-rectal, da taxa de conversão metabólica é inferior a 10% e depende da variação genética em termos da actividade da carboxilesterase [28, 29]. Portanto, a administração de uma dose elevada de CPT-11 é necessária para obter o efeito terapêutico esperado (Fig 4A) [30]. No entanto, doses múltiplas, com uma grande quantidade de CPT-11 é limitada devido aos efeitos secundários graves. A toxicidade limitante da dose de administração de CPT-11 é bem conhecido para resultar nos mucosite intestinal caracterizadas por diarreia grave [24, 25]. No presente estudo, mostraram que a administração intravenosa de complexos de SN-38 /L-PGDs a uma dose baixa apresentou uma actividade anti-tumor pronunciado, em comparação com a de CPT-11 (Figura 4A). Além disso, a análise histológica revelou que a mucosa intestinal de ratos tratados com SN 38 /complexos de L-PGDs a uma dose de 2,8 mg /kg /d não mostrou vilosidades ou a perda da arquitectura da cripta (Figura 5A) reduzido, que é um dos sinais da mucosite intestinal. complexos de SN-38 /G-PGDs Além disso, os níveis de mRNA de citocinas inflamatórias, tais como IL-6 e IL-1β no intestino dos ratos administrados foram semelhantes aos de ratinhos injectados com PBS (Fig 5B). Assim, demonstrou-se que a utilização directa de SN-38, como um complexo com L-PGDS mostrou uma actividade anti-tumoral sem evocar efeitos secundários indesejáveis, tais como a mucosite intestinal.

Até agora, diversas abordagens para solubilizar SN 38 têm sido relatados, por exemplo, utilizando pró-fármacos macromoleculares e formulações nanomedicina, tais como lipossomas e micelas poliméricas [18]. No entanto, estes métodos envolvem reacções múltiplas e complicadas; e é necessária a utilização de solventes orgânicos tóxicos. Por exemplo, EZN-2208, uma pró-droga macromolecular solúvel em água de SN-38, é produzido por etapas complicadas, incluindo reacções durante a noite [31]. Um clorina-núcleo de micela copolímero em bloco em forma de estrela, que é um agente de fotossensibilização nanodimensionada capaz de encapsular SN-38, foi preparado utilizando um método de liofilização-hidratação [32]. No entanto, este processo de liofilização é demorada; e, além disso, este processo requer o uso de um solvente orgânico tal como dimetilsulfóxido. Assim, a toxicidade dos solventes orgânicos residuais deve ser motivo de preocupação. No nosso caso, no entanto, a formulação de complexos SN-38 /G-PGDs poderia ser conseguida através de uma reacção simples, isto é, apenas a mistura de uma suspensão SN-38 com solução de L-PGDS sem qualquer solvente orgânico. Além disso, também demonstramos que a formulação oral sólida de fármaco fracamente /complexo L-PGDS solúvel em água pode ser conseguido simplesmente por utilização de uma técnica de secagem por pulverização [33]. Portanto, a formulação de fármaco utilizando L-PGDS tem uma grande vantagem em termos de tempo e segurança preparação.