Abstract

As diatomáceas são uma importante classe de algas unicelulares que produzem aldeídos poliinsaturados bioativos (PUAs) que induzem abortos ou malformações na prole de invertebrados expostos a eles durante a gestação. Aqui nós comparar os efeitos da PUAs 2-

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, 4-

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-decadienal (DD), 2-

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, 4-

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-octadienal (OD) e 2-

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, 4-

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-heptadienal (HD) sobre o A549 linhas de células de adenocarcinoma de pulmão e cólon cOLO 205, eo pulmão /brunch normais epitelial BEAS-2B linha celular. Usando o MTT de viabilidade /ensaios de azul de tripano, mostramos que PUAs ter um efeito tóxico sobre ambos A549 e COLO 205 células tumorais, mas não as células normais, BEAS-2B. DD foi o mais forte dos três PUAs testados, em todos os intervalos de tempo considerados, mas HD era tão forte como DD após 48 h. OD era a menos activa dos três PUAs. O efeito dos três PUAs foi um pouco mais forte para as células A549. Por isso, estudaram a morte via activado em A549 que mostra que as células tratadas com DD activado Factor de Necrose Tumoral Receptor 1 (TNFR1) e Fas Associated domínio de morte (FADD), levando a necroptosis via de sinalização da caspase-3 sem activar a via de sobrevivência Proteína de interacção com receptor ( DESCANSE EM PAZ). A via /FADD /caspase TNFR1 também foi observada com OD, mas apenas após 48 h. Esta foi a única PUA que ativou RIP, consistente com a constatação de que OD causa menos danos à célula em comparação com DD e HD. Em contraste, as células tratadas com o HD activado /FADD via Fas /caspase. Este é o primeiro relatório de que PUAs activar uma maquinaria apoptótica extrínseca, em contraste com outros fármacos anticancerígenos que promovem uma via de morte intrínseca, sem afectar a viabilidade de células normais do mesmo tipo de tecido. Estas conclusões têm implicações interessantes também do ponto de vista ecológico, considerando que o HD é um dos PUAs mais comuns produzidos por diatomáceas

Citation:. Sansone C, Braca A, Ercolesi E, Romano G, Palumbo A, Casotti R, et ai. (2014) Diatom-Derived Poliinsaturadas aldeídos Activate Cell Death em linhas celulares de cancro humano, mas não as células normais. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10.1371 /journal.pone.0101220

editor: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Índia |

Recebido: 14 Janeiro, 2014; Aceito: 04 de junho de 2014; Publicação: 03 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sansone et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Stazione Zoologica Anton Dohrn e pela National Projeto operativo Estudo italiano PON01_02093 de novas tecnologias e plataformas tecnológicas para a melhoria dos processos de produção de ingredientes farmacêuticos ativos de interesse industrial e busca de novas moléculas bioativas a partir de fontes naturais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores confirmam que o co-autor Adrianna Ianora é um PLOS ONE editor acadêmico, mas que isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

as diatomáceas são microscópicos, algas unicelulares que representam organismos fotossintéticos dominantes nos oceanos do mundo. O seu papel benéfico como alimento para ruminantes foi desafiado mais de uma década após a descoberta de que algumas espécies de diatomáceas produzir compostos teratogênicos, como aldeídos poliinsaturados (PUAs) que induzem abortos, defeitos de nascimento, o fraco desenvolvimento e mortalidade alta prole em planctônicas predatória e invertebrados bentônicos [ ,,,0],1] – [3]. PUAs são os produtos finais de uma via metabólica da lipoxigenase liase /hidroperóxido [4] iniciada por danos para as células de algas, como ocorre através do pastoreio por predadores. dano celular activa enzimas de lipase que libertam ácidos gordos poli-insaturados (PUFAs) a partir de membranas de células que são imediatamente oxidados e clivados dentro de segundos, para formar PUAs e uma variedade de outros compostos denominados colectivamente Oxilipinas [4], [5]. Numerosas funções têm sido propostos para PUAs tais como: pastador defesa [6], [7]; alelopatia [8], [9], uma célula para outra sinalização [10], a actividade antibacteriana [11], [12], e florescer rescisão [13], [14]. Assim, os mesmos metabólitos secundários têm múltiplas funções de pastoreio defesa para sinalizar moléculas que medeiam várias interações de plâncton.

Primeiro descrito em diatomáceas marinhas por Miralto et al. [15], que mostrou que a PUAs 2-

trans,

4-

cis

, 7-

cis

-decatrienal, 2-

trans, 4-

trans, 7-

cis

-decatrienal e 2-

trans, 4,

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-decadienal (DD) prendeu o desenvolvimento embrionário em copépodes e ouriços do mar, e teve efeitos antiproliferativos e apoptóticos na linha de células de adenocarcinoma CaCo2 humano. Sucessivamente, ambos os estudos laboratoriais e de campo têm demonstrado um impacto negativo de dietas de diatomáceas na copépode grazer sucesso reprodutivo [6], [16] – [19]. PUAs pode ser seqüestrado durante o desenvolvimento do oócito e ser passado maternalmente para o embrião, ou pode agir diretamente em embriões. Por qualquer rota, o tempo de reprodução em relação à abundância de diatomáceas tóxico terá consequências importantes para o recrutamento de invertebrados [6].

compostos similares são produzidos por plantas com flores maiores que são acreditados para jogar um papel fundamental na defesa da planta porque eles agem como atratores químicas (por exemplo, feromonas, atração de polinizadores) ou sinais de alarme contra ataque herbívoro (por exemplo, nas interações tritróficas) e compostos protectores (antibacteriano, cicatrização de feridas) [20]. Oxilipinas diatomáceas também mostram uma elevada similaridade com compostos orgânicos voláteis liberados das algas castanhas que são sugeridos para ser envolvido na sinalização química e atração feromônio entre gametas de sexo diferente [20] e parecem ser intermediários para a imunidade inata [21].

o PUA DD é o metabolito mais bem estudado deste grupo e tornou-se assim um aldeído modelo para estudos experimentais sobre os efeitos da Oxilipinas sobre organismos marinhos (revisto em [1], [3]). No entanto, vários diatomáceas marinhas foram mostrados para produzir outros que DD PUAs, incluindo

Skeletonema marinoi

, uma diatomácea formação cosmopolita flor que produz 2-

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-heptadienal (HD), 2-

trans, 4-

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-octadienal (OD) e 2-

trans, 4-

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, 7-octatrienal (octatrienal) [22], [23]. Destes, o mais comum é HD [13], [24]. Ceballos e Ianora [25] conduziram experiências testar os efeitos de DD, OD e HD no ovo copépode sucesso incubação que mostram que quanto maior o comprimento da cadeia do PUAs, mais forte a actividade biológica destas moléculas, tal como confirmado por [26] sobre bactérias, algas, fungos, equinodermes, moluscos e crustáceos, e [27] usando ovos de ouriço do mar. Ribalet et ai. [9] também encontraram uma redução dependente da concentração na taxa de crescimento do fitoplâncton marinho, pertencentes a diferentes grupos taxonômicos, expostos a PUAs com aldeídos mais longos de cadeia com efeitos mais fortes sobre o crescimento de aldeídos mais curtos de cadeia.

Aqui que compara os efeitos de diferentes PUAs, incluindo DD, OD, HD e na linha celular de adenocarcinoma do pulmão A549, adenocarcinoma do cólon derivada de ascite metastáticos linha de células cOLO 205, e o pulmão /Brunch normais linha celular epitelial BEAS-2B. PUAs são conhecidos por causarem apoptose [15], [28] – [29], mas num estudo anterior [6] que foram mostrados para exercer efeitos dramáticos apenas em proliferação, células indiferenciadas. Por isso, utilizadas duas linhas celulares de tumores altamente agressivos para melhor compreender os processos envolvidos na morte celular e um normal para avaliar uma acção específica hipotética contra a proliferação de tipos de células. Outro importante objetivo foi comparar os efeitos do DD, um modelo PUA em testes toxicológicos, mas não o PUA mais comum presente em fitoplâncton marinho (em uma pesquisa de 51 espécies de diatomáceas marinhas, DD foi o menos detectado PUA, [24]), com o mais prevalente diatomáceas PUAs HD e OD. Estes são mais propensos a causar (sensu [15]) efeitos antiproliferativos insidiosas sobre planctônicos e bentônicos herbívoros

In situ

durante florações de diatomáceas naturais, como as relatadas por [3] e as referências aí.

Material e Métodos

culturas e tratamento com células

O A549 (ATCC CCL185) adenocarcinoma de pulmão humano e cOLO 205 (ATCC CCL-222) colon adenocarcinoma linhas de células-derivando ascite metastáticos foram mantidas em DMEM ( meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades de ml

-1 de penicilina e 100 ug ml

-1 estreptomicina. As células foram incubadas em 5% de CO

2 câmara humidificada a 37 ° C durante o crescimento. As células A549 e COLO 205 (2 × 10

4 células bem

-1) foram semeadas numa placa de 24 poços e mantidas durante a noite para fixação. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio fresco com três concentrações (2, 5 e 10 uM) para cada um dos três PUAs (dd, OD, e HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Itália) testadas; As células foram deixadas crescer durante 24, 48 e 72 h. Após incubação, o sobrenadante foi removido e as células aderentes foram examinadas quanto à viabilidade. As células A549 utilizados para análise de proteínas de extração /RNA e ciclo celular 2 × 10

6 foram semeadas em placas de Petri (90 mm de diâmetro) e tratado como relatado acima.

Em uma experiência independente, células A549 (2 × 10

3 células bem-1) foram semeadas numa placa de 96 poços e mantidas durante a noite para fixação. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio fresco com três concentrações (2, 5 e 10 uM) para cada um dos três PUAs (dd, OD, e HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italy) e testados com a caspase-3 inibidor (C

30H

41FN

4O

12, sc-3075, Santa Cruz) em 9,7 mM; As células foram deixadas crescer durante 24, 48 e 72 h. Após o tratamento aldeído, as células viáveis ​​foram avaliadas como descrito abaixo. O BEAS-2B (ATCC CRL-9609) de pulmão /Brunch linha celular epitelial normal foi mantida em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com soro a 50% de bovino fetal (FBS), 100 unidades de ml

-1 de penicilina e 100 ug ml

-1 estreptomicina. As células foram incubadas em 5% de CO

2 câmara humidificada a 37 ° C durante o crescimento. BEAS-2B (2 × 10

3 células bem

-1) foi semeada numa placa de 96 poços e mantidas durante a noite para fixação. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio fresco com três concentrações (2, 5 e 10 uM) para cada um dos três PUAs (dd, OD, e HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Itália) testadas; As células foram deixadas crescer durante 24, 48 e 72 h. Após incubação, o sobrenadante foi removido e as células aderentes foram examinadas quanto viabilidade

ensaios de viabilidade

Foram realizados dois tipos de ensaios de viabilidade:. MTT e azul de Tripano. Nós aqui escolher para representar os dados mais significativos obtidos com um ou o outro tipo de ensaio de acordo com as características das células tratadas. Em particular, as células normais (BEAS-2B) que não foram afectadas pelo tratamento PUAs (e, portanto, não havia células mortas) foram analisados ​​com o ensaio colorimétrico MTT enquanto que as células A549 e Colo 205 foram coloridas com azul de tripano que cora apenas as células mortas. Além disso, as células A549 tratadas com PUAs na presença de inibidor da caspase-3 foram também analisados ​​com o ensaio de MTT para avaliar a inibição da toxicidade.

para o azul de Tripano, A549 e células COLO 205 (2 × 10

4 /po) foram semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços e mantidas durante a noite para a ligação na presença de meio de Dulbecco. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio fresco contendo 0, 2, 5 ou 10 uM de DD, OD ou HD. As células tratadas foram incubadas durante 24, 48 e 72 h. Após a incubação, o sobrenadante foi recolhido e descartado, enquanto as células aderentes foram tratadas com uma solução de azul de tripano a 0,4% (Hyclone, Lote N: JRH27098) de acordo com o ensaio de exclusão com Trypan Blue Dye [30]. Após coloração, as células foram descoladas com tripsina, centrifugadas e o sedimento foi lavado com tampão fosfato salino (PBS); 10 ul desta solução foi colocado numa câmara de contagem Burker. células azuis (que indicam as células mortas) foram contadas em cada área e em relação aos controles para calcular a viabilidade celular%.

Para MTT, as células A549 e BEAS2B foram semeadas em placa de 96 poços (2 × 10

3 células /poço), depois de tempos de tratamento, e foram incubadas com 10 uL (10 mg /ml) de MTT (brometo de 3- [4,5-metiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazoliumbromide, Applichem A2231). O número de células viáveis ​​depois de aldeído (dd, OD, HD) tratamento foi avaliada pelo ensaio de MTT espectrofotométrico de acordo com o protocolo do fabricante e calculada como a razão entre a média da absorvância (λ = 570 nm) da amostra e absorvância da média de controlo e expressa como percentagem de viabilidade.

acridina laranja /brometo de etídio teste de coloração dupla para análise morfológica

Controle e células A549 aderentes tratados foram tripsinizadas e recolhidas por centrifugação a 500 g durante 5 min. As células foram lavadas 3 × com PBS e as alterações na morfologia celular foram detectados com o /brometo de etídio teste de coloração laranja de acridina. As células foram re-suspensos em 25 ul de corante (100 ug ml

-1 de laranja de acridina e 100 ug ml

-1 de brometo de etídio preparadas em PBS e misturada suavemente). 10 ul de células coradas foram colocadas sobre uma lâmina de microscópio, cobertos com uma lamela e examinadas com um microscópio confocal (Zeiss LSM510, laser de 488 com filtro LP505 para a fluorescência verde; laser de 543 a PL 560 de filtro de fluorescência vermelha) com 25 × objectivo. laranja de acridina penetra tanto células mortas que emitem fluorescência verde quando intercalado em ácidos normais de cadeia dupla nucleicos (ADN) e fluorescência vermelha quando ligado com os ácidos nucleicos de cadeia simples e de estar danificados. O brometo de etídio penetra apenas células mortas com membranas danificadas emissores de fluorescência vermelha. Quatro tipos celulares foram identificados de acordo com [31] com base na emissão de fluorescência e aspecto morfológico de condensação da cromatina em núcleos corados: (1) células viáveis ​​com núcleos uniformemente verde brilhante e uma estrutura organizada (controlo); (2) células início apoptóticos com núcleos verdes irregulares com cromatina condensada e com corpos apoptóticos coradas em vermelho, (3) células tarde apoptóticos com laranja para núcleos vermelhos com cromatina altamente fragmentado; (4) de modo uniforme laranja para núcleos vermelhos com uma estrutura imputável organizado para células necróticas.

isolamento do RNA e RT

2 Profiler PCR Arrays

Após o tratamento, as células A549 foram lavados em cultura de tecidos prato, adicionando frio PBS e balançando suavemente. As células foram lavadas directamente numa placa de cultura pela adição de 1 ml de Trizol (Life Technologies Reagente, cat. 10296-010) por placa de 10 cm de diâmetro e raspagem com raspador de células. O ARN foi isolado de acordo com o protocolo do fabricante. concentração e pureza RNA foi avaliada usando o NanoDrop nanophotomer (Euroclone). De ARN (400 ng) foi submetido a transcrição reversa usando a reacção de RT

2 primeiro kit de cadeia (Qiagen, cat.330401) de acordo com o protocolo do fabricante.

Para avaliar a expressão de genes apoptóticos, real PCR em tempo transcrição reversa quantitativo (qRT-PCR) foi realizada utilizando a RT

2 Profiler PCR matrizes kit (Qiagen, cat.330231). As experiências foram realizadas em triplicata para linha de células A549 tratadas com puas a 5 concentração? M para 2 horas de tempo de exposição.

As placas foram executados em um VIIa 7 (Applied Biosystems 384 bloqueia bem), padrão de protocolo rápido PCR Ciclismo com 10 volumes de reacção de microlitro. As condições de amplificação utilizadas foram – início um ciclo a 95,0 ° C durante 10 min e seguido de amplificação durante 40 ciclos a 95,0 ° C durante 15 s e 60,0 ° C durante 1 min. dados de amplificação foram recolhidas através VIIa 7 ORALL Software (Applied Biosystems). O CT-valores foram analisadas com dados da matriz software on-line análise de PCR (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).

A extração de proteínas

ligado de células A549 , após o tratamento, foi preparado através de raspagem das células de cada placa de Petri em 1 ml de tampão de lise RIPA (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, 0,5% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1 % SDS) suplementado com inibidores da protease (PMSF 1 mM e completa Tablets cocktail inibidor da protease, a Roche, Monza, Itália) e inibidores de fosfatase (Tabelas Cocktail PhosSTOP, Roche). O lisado foi incubado em gelo durante 15 minutos e depois clarificada por centrifugação a 14000 g durante 20 min. A concentração total de proteína foi determinada utilizando um Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Milão, Itália) com albumina de soro bovino (BSA) como padrão. O extracto de proteína foi armazenada a – 80 ° C até à sua utilização

A electroforese

Antes da electroforese, as amostras de proteína foram incubadas a 100 ° C durante 5 min.. Após 10% de SDS-PAGE, os géis foram corados com Coomassie ou transferidas para nitrocelulose membrana (Hybond, GE Healthcare). As membranas foram bloqueadas durante 1 h em 1X tampão salino Tris (TBS), com 0,1% de Tween-20 com 5% w /v de leite em pó magro e incubaram-se durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários diluídos em 1X TBS, 0,1% Tween -20 com 5% de BSA. Os anticorpos primários eram da Morte Receptor Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S), incluindo anti-TNFR1 (1:1000), anti-TNFR2 (1:1000), anti-FADD (1:1000), anti-RIP (1 :1000), anti-Fas /FasL (1:1000). Anti-ativa Cas-3 (1:1000) comprado de BioVision. O controlo positivo foi obtido, utilizando anticorpo anti-actina (1:500) (Sigma). Actina foi utilizado como um controlo para cada uma das proteínas analisadas. Aqui nós mostrar apenas um gel representante para a actina. Após a incubação, as membranas foram lavadas três vezes durante 5 min cada com 15 ml de TBS /Tween e depois incubadas com conjugado HRP-anticorpo secundio anti-coelho (1:2000, Cell Signaling Technology) com agitação suave durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as membranas foram lavadas três vezes durante 5 min cada com 15 ml de TBS /Tween. membranas apagados foram imunodetectado utilizando ECL reagente Prime western blot detecção (GE Healthcare). As proteínas foram visualizadas com Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). A análise densitométrica das bandas imunopositivas foi realizada usando o software Image J..

análise do ciclo celular

células A549 foram recolhidas a partir de placas utilizando 1 mL de Tripsina-EDTA (Lonza, Itália), fixado em 70% etanol e armazenadas a -20 ° C. As células foram então lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em PBS contendo 1 mg ml

-1 RNase A (Qiagen, Cat.19101), incubadas a 37 ° C durante 45 min e em seguida coradas com iodeto de propídio (PI, 10 ug ml

-1) por 15 min. A distribuição de ADN no interior das células foi então estimado utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EUA). A percentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular foi calculada utilizando ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EUA).

A análise estatística

As diferenças estatísticas entre as células tratadas e de controlo para a contagem de viabilidade celular foi determinada por ANOVA e teste de comparação múltipla de Dunn com valores de p significativos ≤0.05 usando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA).

dados de expressão gênica foram analisados ​​por dados de matriz PCR software on-line de análise (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Os histogramas mostram razões de expressão relativa dos genes analisados ​​com respeito aos controlos sem PUAs. Apenas expressão valores maiores do que uma diferença de 1,55 vezes em relação aos controlos foram considerados significativos.

a expressão da proteína de imunotransferência foi calculada como a percentagem da área integrante de cada banda de gel única no que diz respeito à área total pista de gel, representada como pixels. As diferenças estatísticas entre tratados e controles foram determinados por análise T-aluno com valores de p significativos ≤ 0,05. Os dados significativamente diferente dos controlos, com valores de p . 0,001 estão marcados com asteriscos 2 nas figuras

Resultados

Viabilidade de A549 e COLO 205 linhas de células de cancro, e normal de células BEAS-2B a linha após o tratamento com o decadienal PUA (DD)

Como se mostra na Fig. 1A-1B, o tratamento da A549 e as células COLO 205 com 2, 5 ou 10 uM de DD resultou em uma dose significativa e dependente do tempo de redução da viabilidade celular em comparação com os controlos (p 0,05). Após 24 h, a uma diminuição na percentagem de células A549 viáveis ​​foi observado com todas as doses testadas (70%, 50% e 18% de células viáveis ​​em concentrações DD 2, 5 e 10 uM, respectivamente). Resultados semelhantes foram obtidos com células COLO 205 (80%, 44% e 26% de células viáveis ​​em concentrações DD 2, 5 e 10 uM, respectivamente). Depois de 48 h de tratamento, observou-se uma redução suplementar, especialmente a concentrações mais elevadas de DD 5 e 10 uM para células A549; COLO 205 viabilidade diminuiu mais lentamente (67%, 43% e 23% de células viáveis ​​em concentrações DD 2, 5 e 10 uM, respectivamente). A 10 uM células A549 apresentaram alterações morfológicas evidentes, tais como a perda de aderência de contacto com outras células, bem como com o substrato de placa. Após 72 h, a viabilidade das células A549 diminuiu para 0% com DD 5 e 10 uM e a 26% com DD 2? M; a viabilidade das células COLO-205 foi 30%, 21% e 13% com 2, 5 e 10 uM DD, respectivamente.

(D) Efeito de DD na linha de células A549 na presença de um inibidor da caspase-3 ( 9,7 uM). Percentagem de células viáveis ​​para A549 e COLO 205 calculadas com o ensaio de viabilidade azul Trypan e para BEAS-2B com o ensaio de viabilidade MTT. Os valores são registados como média ± D.P. em comparação com os controlos (100% de viabilidade); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, 10 uM ♦.

O tratamento de células BEAS-2B, com 2, 5 ou 10 uM de DD não reduziu significativamente a viabilidade celular em comparação com os controlos (Fig. 1C). Após 24 h de tratamento DD viabilidade celular BEAS-2B diminuiu ligeiramente (74%, 65% e 85% de células viáveis ​​em 2, 5 e 10 concentrações uM DD, respectivamente), mas depois de 48 e 72 a viabilidade celular h recuperado e foi comparável com os controlos , indicando efeitos tóxicos leves depois de apenas 24 horas. Finalmente, para avaliar o efeito citotóxico específico registados para a linha de células A549, o experimento ensaio de MTT foi realizado na presença de um inibidor de caspase-3 para todos os tratamentos de aldeído. A Figura 1D mostra que a percentagem de viabilidade celular é comparável para as células tratadas com PUAs sem inibidor a 2 uM; aos 5 e 10 uM há um decréscimo mais lento na viabilidade celular em comparação com o tratamento sem inibidor da caspase-3 ao fim de 48 h (Fig.1A), mas após 72 horas, as mesmas concentrações induziu um aumento da morte celular.

viabilidade de A549 e COLO 205 linhas celulares de cancro e a linha celular BEAS-2B normal após o tratamento com PUA octadienal (OD)

o tratamento de células A549 com 2, 5 ou 10 uM de OD inibiu a proliferação de células com o tempo, especialmente a concentrações mais elevadas (10 uM) quando a viabilidade celular diminuiu para 35% após 72 h (Fig. 2a). Aos 2 uM concentrações, o efeito sobre a viabilidade das células após 24 h, não foi significativamente diferente, em comparação com os controlos, mas tornou-se assim depois de 72 h (p 0,05). Considerando COLO 205 viabilidade celular após 24 horas não diminuiu significativamente (Fig. 2B), os efeitos citotóxicos tornou-se mais forte depois de 72 h para todas as três OD concentrações (60%, 60% e 41% de células viáveis ​​em concentrações de OD 2, 5 e 10 uM , respectivamente, p . 0,05)

(D) Efeito de OD na linha de células A549 na presença de inibidor de caspase-3 (9,7 uM). Percentagem de células viáveis ​​para A549 e COLO 205 calculadas com o ensaio de viabilidade azul Trypan e para BEAS-2B com o ensaio de viabilidade MTT. Os valores são registados como média ± D.P. em comparação com os controlos (100% de viabilidade); ▴ 2 uM; ▪ 5 mM, ♦ 10? M.

O tratamento de células BEAS-2B com 2 e 5? M de OD não reduziu significativamente a viabilidade celular em relação aos controles após 24, 48 e 72 h (Fig. 2C ), enquanto que a 10? M OD, a viabilidade das células BEAS-2B diminuiu ligeiramente após 72 h (75% de células viáveis). O tratamento de células A549 com OD na presença de inibidor de caspase-3 não resultou em diferenças significativas na percentagem de viabilidade celular (Fig. 2D).

viabilidade de A549 e COLO linhas celulares de cancro e normal 205 BEAS-2B a linha de células após o tratamento com PUA heptadienal (HD)

Como se mostra na Fig. 3A, o tratamento com 2, 5 e 10 uM de HD em células A549 proliferação celular ligeiramente inibido ao fim de 24 h, mas o efeito foi ainda significativamente diferentes no que diz respeito aos controlos (p 0,05). O efeito foi mais evidente com o tempo. Em particular, a 10 uM, apenas 10% das células eram viáveis ​​ao fim de 48 h e 0% após 72 h. tratamento HD em células COLO 205 também causou uma redução da viabilidade celular, mas o efeito não foi tão forte como com células A549. Após 48 e 72 h (Fig. 3B), foi observado um efeito significativamente tóxicos em concentrações elevadas (HD 40% e a viabilidade celular de 28% a 10 uM HD).

(D) Efeito de HD em células A549 linha na presença de inibidor de caspase-3 (9,7 uM). Percentagem de células viáveis ​​para A549 e COLO 205 calculadas com o ensaio de viabilidade azul Trypan e para BEAS-2B com o ensaio de viabilidade MTT. Os valores são registados como média ± D.P. em comparação com os controlos (100% de viabilidade); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, 10 uM ♦.

Tal como no caso de DD e OD, o tratamento de células BEAS-2B com HD não induz toxicidade (Fig. 3C). O tratamento de células A549 com HD na presença de inibidor de caspase-3 não resultou em diferenças na percentagem de células viáveis ​​em concentrações mais elevadas HD (5 e 10 mM) (Fig. 3D). Às 2 uM, houve um aumento significativo da mortalidade celular na presença de caspase-3 inibidor após 72 h (Fig.3D).

efeitos morfológicos da diatomácea PUAs DD, OD e HD na linha celular A549

para observar as alterações morfológicas nas células tratadas com DD, OD e HD e verificar se uma redução da viabilidade após o tratamento foi correlacionada com a indução de apoptose, nós dobro de células marcadas com os corantes fluorescentes para ácidos nucleicos, laranja de acridina (aO) e brometo de etídio (eO) após 48 h de tratamento. As células viáveis ​​foram identificados por núcleos verdes brilhantes em células intactas (AO). No início células em apoptose foram identificadas por núcleos verdes irregularmente estruturados com cromatina condensada e laranja ou manchas vermelhas leves. células final apoptóticos continha corou positivamente núcleos com ambos os corantes (EB e AO), aparecem a vermelho laranja ou luz juntamente com corpos apoptóticos. Núcleos de células necróticas teve cromatina intacta e apareceu vermelho. Todos os núcleos de controle apareceu verde com uma estrutura esférica regular e organização da cromatina com exceção de algumas células senescentes em um estágio necrótica que mostraram núcleos fluorescente vermelha (Fig. 4A). Aos 10 mM DD, todas as células estavam em fase de apoptose tardia e foram caracterizados por dupla marcação amarelo-laranja (AO /EB), devido a condensação da cromatina e perda da integridade da membrana (Fig. 4B). A 10 uM OD, dano celular foi menos evidente com alterações distintas na morfologia e a presença de coloração vermelha em algumas células, indicando a progressão da apoptose celular (setas na Fig. 4C). A 10 uM de HD, a morfologia das células foi substancialmente alteradas com cromatina dispersa nos núcleos que apareceram alargada. Marcas de final de apoptose, tais como a fragmentação nuclear também foram visíveis (setas na Fig. 4D).

Controle e células tratadas duplamente coradas com laranja de acridina e brometo de etídio após 48 mM DD, OD e HD observados ao microscópio confocal . Os números indicam (1) células normais; (2) células apoptóticas precoce; (3) células apoptóticas tarde; (4) células necróticas (ver materiais e métodos para detalhes). As setas indicam células com núcleos fragmentados.

analisa Immunoblot de receptores de morte (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) e atuadores (caspase-3) na linha de células A549 tratadas com PUAs (DD, OD e HD )

Depois de 24 h de tratamento, DD induziu um aumento dependente da dose, na expressão de receptor de factor de Necrose tumoral 2 (TNFR2) especialmente a 5 e 10 | iM, em comparação com controlos, tal como revelado pela análise densitométrica do folha fotográfica (fig. 5A) da membrana de imunotransferência. Pelo contrário, os factores associados do receptor TNF (TRAF1 e TRAF2) não foram activadas, indicando a ausência de um percurso de sobrevivência. Além disso, DD induzida uma activação de TNFR1 em células tratadas com 5 e 10 uM concentrações (Fig. 5a). Os jusante FAS-proteína associada com o domínio de morte (FADD) também foi fortemente activado a 10 uM concentrações, enquanto que os níveis da proteína-receptor que interage (PIR) diminuiu dramaticamente em todas as três concentrações DD (Fig. 5a). Redução da expressão de RIP representa uma morte precoce via de sinalização, como indicado pela ausência de proteínas adaptadoras tais como necrose tumoral tipo de receptor do factor de proteína de 1-Associated DOMÍNIO DE MORTE (TRADD) ou TNF receptor associado Factores de TRAF1 e TRAF2 (dados não mostrados). DD também activada a caspase-3, confirmando a morte celular por meio de apoptose depois de 24 h (Fig. 5a). Outros receptores de morte implicados na via apoptótica extrínseca (Fas, DR3, DR4, DR5), bem como alguns factores activados em vias apoptóticas intrínsecas (Akt1, Akt2, PARP, Apaf1) não estavam envolvidos na resposta das células a DD (dados não mostrados ).

a análise de imunotransferência mostra que PUAs induzir sinalização de TNF após 24 (DD e HD) e 48 h (dO) de tratamento com a actina. Asterisco indica aumento significativo nos níveis de proteína medidos. ** P ≤ 0,05 versus controlo; barras de erro representam SD ±.

Foi observado o mesmo caminho após o tratamento OD mas só depois de 48 h. expressão TNFR2 ligeiro aumento em relação aos controles, mas a diferença não foi significativa. TNFR1 e FADD mostraram uma resposta significativa nas concentrações mais elevadas (5 e 10 mm) (Fig. 5B). Em contraste com DD, células tratadas com OD mostrou uma expressão forte e persistente de PIR, indicando a coexistência de uma sobrevivência e morte de sinalização de resposta (Fig. 5B). Caspase-3 foi também activada como com DD (Fig. 5B).

HD não aumentou significativamente a expressão de TNFR2 (Fig. 5C) e não provocou qualquer resposta em TNFR1 após 24 h e 48 h. Após 24 h de HD aumentou fortemente a expressão do receptor Fas (Fas /FasL-Ligando de sistema) de um modo dependente da dose. Observou-se um efeito máximo de HD em Fas aos 5 e 10 uM concentrações (Fig. 5C). HD também o aumento da expressão FADD e caspase-3 activado (Fig. 5C). Em contraste, os níveis de PIR diminuiu dramaticamente após 24 h (Fig. 5C). Além disso, Apaf1 não foi revelada após o tratamento HD às 24 e às 48 horas (dados não mostrados).

Análise da expressão de genes que codificam para receptores de morte (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) e efectores (caspase-3, AIFM1) na linha de células A549 tratadas com PUAs (DD, OD e HD)

para entender melhor os efeitos tóxicos a nível molecular, as células A549 foram analisados ​​após 2 h de tratamento PUAs porque todas as proteínas para DD e HD já foram expressas e activadas após 24 h. Nós escolhemos usar 5 concentração? M desde a efeitos maiores concentrações eram muito graves.

genes de controle para tempo real qPCR foram actina-beta (ACTB), Beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforribosil (HPRT1