Abstract

Fundo

glicosilação de proteínas é uma importante modificação pós-tradução mostrado para ser alterada em todos tumor tipos estudados até o momento. glicoproteínas de mucina foram estabelecidas como veículos importantes da

O-

glicanos ligados, mas outras glicoproteínas que exibem repertórios de glicosilação alterados ainda não foram identificados, mas oferecem um potencial como biomarcadores para o câncer metastático.

Metodologia

neste estudo foi utilizada uma abordagem glycoproteomic para identificar glicoproteínas que exibem alterações na glicosilação no cancro colorectal e avaliar as mudanças no

O-

glicosilação ligada no contexto do p53 e KRAS (códon 12/13 ) estado de mutação. purificação de afinidade com a proteína de ligação de hidratos de carbono a partir de

Helix pomatia

aglutinina (HPA) foi acoplado a eletroforese em gel de 2-dimensional com espectrometria de massa para permitir a identificação de baixa abundância

O-

glicoproteínas ligadas de humano espécimes de cancro colorrectal.

resultados

aberrante

O-

glicosilação ligada foi observado para ser um evento precoce que ocorreu independentemente da p53 e KRAS e correlacionando com câncer colorretal metastático . A purificação por afinidade utilizando o HPA lectina seguido por proteomic análise revelou anexina 4, 5 e anexina CLCA1 para ser aumentada em espécimes de cancro colorrectal metastático. Os resultados foram validados com mais um conjunto independente de espécimes e este mostrou uma associação significativa entre a pontuação coloração para anexina 4 e HPA eo tempo para a metástase; independentemente (A4 anexina: Chi quadrado 11,45, P = 0,0007; HPA: Chi quadrado 9,065, P = 0,0026) e em combinação (anexina 4 e HPA combinado: Chi quadrado 13,47; P = 0,0002)

Conclusão

As glicoproteínas que mostram mudanças no

O-

glicosilação ligada em câncer colorretal metastático foram identificados. As mudanças de glicosilação foram independentes da p53 e KRAS. Estas proteínas oferecem potencial para uma maior exploração como biomarcadores e alvos potenciais para o câncer colorretal metastático

Citation:. Peiris D, Ossondo M, Fry S, Loizidou M, Smith-Ravin J, Dwek MV (2015) Identificação de

o

-Conectado glicoproteínas de ligação à lectina

Helix pomatia

Agglutinin como marcadores de câncer colorretal metastático. PLoS ONE 10 (10): e0138345. doi: 10.1371 /journal.pone.0138345

editor: Lu-Gang Yu, da Universidade de Liverpool, Reino Unido

Recebido: 15 de junho de 2015; Aceito: 28 de agosto de 2015; Publicação: 23 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Peiris et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por contra câncer de mama, Registered Charity Número 1121258 (financiado DP e SF). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

a glicosilação é uma modificação importante pós-tradução que tem sido mostrado para ser alteradas em todos os tipos de cancro estudados até à data. Os genes que codificam para enzimas envolvidas em reacções de glicosilação são responsáveis ​​por cerca de 1% do genoma humano, explicando a miríade de alterações de glicosilação relatados no cancro. Metástase, a disseminação de células do tumor primário para órgãos distantes, é um problema grave que afeta pacientes diagnosticados com câncer colorretal (CRC) [1]. Consequentemente, o diagnóstico precoce de CRC metastático é um objectivo importante e novos marcadores de prognóstico são necessários para identificar doentes em maior risco de desenvolver metástases para permitir oncologistas para adaptar as estratégias de tratamento para grupos de risco elevado de patients.Alterations na glicosilação têm sido mostrados para ser associado com o comportamento metastático de células tumorais [2,3] e podem ser identificados utilizando proteínas de ligação a hidratos de carbono, lectinas, isolado a partir de uma grande variedade de organismos incluindo bactérias, plantas, invertebrados e vertebrados [4]. A lectina

Helix pomatia

aglutinina (HPA) reconhece

O-

estruturas ligadas glicano [5,6] e foi exibido pela primeira vez para se ligar preferencialmente ao câncer de mama de pacientes com mau prognóstico [2] [ ,,,0],7]. A utilidade do HPA para a detecção de cancro metastático tem sido desde mostrado para uma gama de tumores sólidos, incluindo os do trato gastrointestinal, por exemplo, colorectal, gástrico e tumores esofágicos [8-11]. As glicoproteínas reconhecidos por HPA foram investigadas em CRC linhas celulares derivadas e esta revelou que a utilidade do HPA reside na sua capacidade de se ligar simultaneamente a muitas glicoproteínas envolvidas numa variedade de funções pró-metastáticos, incluindo migração celular, anti-apoptose e sinalização celular [12]. HPA foi mostrado para ligar os mesmos glicoproteinas no cancro da mama como os detectados em células HT29 sugestivo que reconhece HPA alterações na glicosilação que são comuns em todos os tipos de tumores sólidos. HPA reconhece glicoproteínas modificadas pela ligação de

O-

ligada

N

-acetylgalactosamine (

O-

GalNAc) e

N

acetilglicosamina (

O-

GlcNAc) [13]. mudanças associadas câncer em

O-

glicosilação ligada foram reconhecidos por algum tempo, mas tem havido relativamente poucos estudos relacionados com o mapeamento das proteínas às quais os glicanos alterados são attached.In presente estudo, foi utilizado o HPA lectina para identificar

O-

glicoproteínas ligadas de tecidos CRC que foram metastático para os gânglios linfáticos. As proteínas foram previamente enriquecidos por cromatograf ia de afinidade de lectina e separadas por dois-dimensional gel de electroforese (2-DE), seguido de identificação utilizando espectrometria de massa (MS). Verificação das glicoproteínas identificadas foi realizada por imuno-histoquímica e Western blotting. A correlação entre a ligação HPA; P53 mutado em KRAS e o estado CEA das amostras de tecido foi avaliada com o objectivo de compreensão

O-

glicosilação ligado no contexto de outros marcadores para CRC. Um estudo de validação com mais uma coleção de espécimes CRC independente da coorte amostra inicial mostrou que as mudanças no

O-

glicosilação ligada reconhecido pelo HPA permanecer associado com má CRC prognóstico.

Materiais e Métodos

Chemicals foram obtidos da Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido, salvo indicação contrária.

As amostras dos pacientes

O estudo proteômica incluídos 27 pacientes com CRC primário, conhecido por ser livre de metástases hepáticas, os quais foram submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital Universitário, Martinica (S1 Tabela). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Martinica e do Comitê da Universidade de Ética em Pesquisa (UREC) da Universidade de Westminster. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito para as suas amostras a serem utilizados na pesquisa. As amostras foram congelados instantaneamente após amostras de cirurgia e equivalentes foram fixados em formol e incluídos em parafina para estudos histopatológicos. Para cada amostra de tecido de cancro, tecido normal foi recolhido a partir de áreas livres de tumores na mucosa vizinha dentro de um raio de 4 cm do tumor. Os pacientes foram classificados em dois grupos, com base no grau do envolvimento dos gânglios linfáticos regionais. Todos os tecidos utilizados na investigação foram examinadas e verificadas quanto à presença de células tumorais usando hematoxilina e eosina-lâminas coradas. O trabalho de validação foi realizada utilizando blocos de parafina-se embutidos de tecido CRC recolhidos na University College London Hospitals (anteriores a 2006) e utilizado de acordo com a Human Tissue Act (2008).

histoquímica

a imuno-histoquímica utilizada no sistema de detecção de peroxidase de rábano (HRP) (kit EnVision além ligação dupla complexo sistema-HRP, anti-ratinho /coelho-HRP, Dako, Carpinteria, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 4 mm de espessura a partir da parafina-cera fixado em formalina incorporado (FFPE) tecidos do cólon de arquivo (tumores e homólogos normais) foram de-parafinado em xileno e re-hidratadas através de uma série de álcoois graduados (70% – 100%). A recuperação antigênica foi realizada utilizando a Solução alvo de recuperação ou tampão citrato seguindo as instruções do fabricante. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação com a enzima endógena bloco duplo (Dako, Carpinteria, CA, EUA). As secções foram incubadas com o anticorpo primário correspondente: anticorpo monoclonal anti-p53 (DO1 clone; Immunotech, diluição 1:50) ou anticorpo policlonal de coelho contra a anexina 4 e 5 (diluição 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) . As condições utilizadas para cada anticorpo foram como descrito pelo fabricante. A coloração sem o anticorpo primário foi realizada como controlo negativo. O sistema Envision, HRP, foi utilizado anti-ratinho ou anti-coelho para a detecção dos anticorpos primários (Dako, Carpinteria, CA, EUA) e coloração de tecido foi visualizada com diaminobenzidina (DAB) de solução de cromogénio (Dako, Carpinteria, CA, EUA). Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina durante 5 min. As secções foram desidratadas através de uma série de álcoois graduados compensados ​​em xileno e montadas em ftalato de di-n-butilo em xileno (DPX) meio de montagem. Histoquímica para detectar HPA ligação utilizado lectina biotinilada de 10 ug /mL em salino tamponado com fosfato (PBS) com 5% w /v de albumina de soro bovino (BSA) aplicadas às lâminas durante 1 h, lavada em três mudas de PBS com 0,01% v /v de Tween-20 e incubadas com 5 ug /ml de estreptavidina-HRP durante 30 min. As secções foram lavadas novamente em mudanças de PBS com 0,01% v /v de Tween-20 e lectina de ligação foi revelada por incubação com 1% w /v DAB e 0,3% v /v de H

2O

2. As células foram contrastadas e montado como acima.

As lâminas foram avaliadas sob um microscópio de luz e foram marcados por dois indivíduos independentes de uma maneira cega. Em casos em que houve discordância inicial, um consenso foi obtido após discussão. P53 foi registada como positiva quando os núcleos das células tumorais foram coradas, independentemente da percentagem de células positivas. Determinou-se a pontuação total imunorreactiva (por P53) de acordo com o método utilizado anteriormente [6]. IRS é o valor acumulado da intensidade da imunocoloração (0 (-) sem coloração, 1 (+) para a coloração fraca; 2 (++) para a coloração moderada e 3 (+++) para a coloração forte) e a percentagem de células tumorais positivas para 5% = 0; 20% = 1; 20-50% = 2; 50-80% = 3 e 80% = 4. Para HPA e anexina 4, foram utilizados os mesmos critérios. Primeiro a percentagem de células cancerosas de coloração foi avaliado e este foi, em seguida, adicionado à pontuação intensidade para dar uma contagem final de entre 0 e 8. A fim de determinar o óptimo de corte, os resultados de todas as amostras foram analisadas em termos de sua pontuação de coloração. A pontuação que deu o maior discriminação entre os pacientes que desenvolveram doença metastática e aqueles que permaneceram livres da doença (5 anos de dados de sobrevivência) foi utilizado como valor de corte.

DNA extração

As amostras de tecido tumoral e tecido normal a partir de cada paciente foram usadas para a extracção do ADN. Secções de 1 mm

3 tecido foram cortadas e esmagado imediatamente em 200 ul de tampão de lise contendo Tris pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, 0,5% v /v de SDS, 100 ug /ml de Proteinase K. Fenol extracções foram realizadas e o DNA foi precipitado com etanol a -20 ° C. O precipitado resultante foi seco à temperatura ambiente e re-suspensas em tampão estéril de Tris-EDTA (TE), a uma concentração de aproximadamente 1 mg /ml. concentração de ADN foi determinada usando um Pro espectrofotômetro GeneQuant (GE Healthcare, Bucks, UK). As amostras foram armazenadas a + 4 ° C até à sua utilização.

A amplificação de ADN

A reacção de amplificação do ADN extraído a partir de tecido normal e de tumor foram realizadas utilizando amostras de ADN 1 uL num volume total de reacção de 50 ul contendo Promega Mix master (Ref. M7502) e iniciadores gerados pelo Dr. E. Jullian de Cochin Hospital. A reacção de amplificação foi levada a cabo em duas fases, com 12:00 de cada iniciador. A primeira reacção de PCR (KRAS1) foi realizada com os seguintes iniciadores: KRN5 ‘(5′-TAAGGCCTGCTGAAAATGAC-3’) e KRN3 ‘(5′-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3’) com o seguinte ciclo de amplificação: 95 ° C durante 10 min, 55 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, depois 43 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 minuto, e uma extensão final a 95 ° C durante 30 seg , 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 10 min. A observação de uma banda fraca de baixa intensidade ou da falta da banda, depois de 1,5% w electroforese em gel /v de agarose levou a uma segunda reacção de amplificação. Esta segunda reacção de PCR (KRAS2) foi efectuada utilizando 2 a 10 ul da primeira KRAS1 reacção e os seguintes iniciadores: KRS5 ‘(5′-AACTTGTGGTAGTTGGAG -3’) e KRS3 ‘(5’ – GTTGGATCATATTCGTCC -3 ‘), com a seguinte ciclo de amplificação: 95 ° C durante 12 min, 52 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, depois 43 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 52 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min e um ciclo final a 95 ° C durante 30 seg, 52 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR de tecido do tumor foram sequenciados para e mutações nos códons 12 e 13 do gene KRAS foram identificados (Millegen, França).

Preparação de amostras para análise de proteínas

Antes da selecção de amostras para estudos de proteómica, 7 uM secções congeladas foram cortadas e a presença de células cancerosas foi confirmada por coloração com hematoxilina e eosina. Foram selecionadas as células cancerosas 60% e hemólise livre; amostras contendo LN negativo (n = 5) CRC (LN) e correspondentes tecidos saudáveis ​​(AdLN-). As características patológicas clínicas das amostras são mostrados na Tabela S1. As proteínas foram extraídas a partir de cada amostra de lavagem de 50 mg de tecido três vezes com refrigerados PBS, a homogeneização em tampão de lectina: 0,05 M TBS, CaCl 1 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, pH 7,6 usando uma mão homogeneizador durante 5 minutos com arrefecimento intermitente em gelo. O homogenato foi centrifugado a 15.000 x

g

para recolher o sobrenadante. quantificação da proteína foi realizada utilizando o sistema Qubit (Qiagen, R.U.). Os rendimentos de proteínas variou de 5% a 7% do peso húmido do tecido. Cada uma das piscinas composto 100 ug de cada uma das preparações de proteína de cancro /normais das amostras apropriadas.

de SDS-PAGE e Western Blotting

As proteínas foram separadas por 1-DE de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida electroforese em gel (SDS-PAGE), utilizando um gel de 12% a 120 V durante 1,5 horas [14] e corados com Coomassie coloidal Blue G-250 [15]. As amostras separadas por SDS-PAGE foram transferidas para nitrocelulose usando um sistema de blotting molhado durante 1,5 h a 110 V, em tampão de transferência: Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% v /v de metanol, bloqueado com 2% w /v de BSA em TBS Tween a 0,05% v /v durante a noite e incubadas com 5 ug /ml de HPA biotinilado durante 2 h seguido por 1 h de incubação com 2 ug /mL de estreptavidina-HRP e sondados com o DAB /H

2O

2. Para a análise dos níveis de CEA de um anticorpo monoclonal murino anti-CEA (SC-55547, Santa-Santa-Cruz, CA, EUA) foi utilizado a 5 ug /ml de anticorpo anti-ACE, durante 2 horas, incubado com 2? G /ml de peroxidase -conjugated anti-IgG de rato, durante 1 h e visualizada como acima. Para verificar os níveis de anexina 4 e 5 amostras de proteína foram separadas e transferidas como anteriormente e sondadas com anticorpos monoclonais de murino anti-anexina 4/5 anticorpos (SC-46693 /SC-74438, Santa Cruz, CA, EUA) a 5 ug /ml durante a noite, seguido por incubação com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho (1 mg /ml) e desenvolvida com o substrato de quimioluminescência aumentada (ECL). O sinal foi captado em filme de raios-X usando um tempo de exposição de 1 min.

Enriquecimento de HPA glicoproteínas de ligação

cromatografia de afinidade HPA foi usada para enriquecer e purificar glicoproteínas de ligação HPA dos extratos de tecidos . Isto permitiu alterações qualitativas na glicosilação e mudanças quantitativas nos níveis de proteína a ser avaliado. Além disso, esta etapa removido proteínas alta abundância. Uma coluna de cromatografia de afinidade de 5 ml de HPA foi preparado por acoplamento de 10 mg de HPA a uma coluna HiTrap de Sepharose activada por NHS, (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. 2 mg de amostra de proteína reunida foi carregada na coluna e eluída com 0,25 M de GlcNAc preparada de fresco em tampão de lectina. As amostras foram dialisadas durante a noite contra TBS e liofilizado. As amostras liofilizadas foram reconstituídas em tampão de ureia de 100 uL: 7 M de ureia, 2 M tioureia, 2% v /v anfólitos 4-7 (GE Healthcare, Bucks, UK), 4% w /v de CHAPS e 1% w /v de DTT. quantificação da proteína foi realizada como antes. O rendimento de proteína purificada de afinidade variaram entre 1% e 2% do conjunto total de proteína.

electroforese bidimensional (2-DE)

glicoproteínas purificadas por afinidade foram separados por 2-DE. 50 ug de cada amostra de proteína reunida foi misturado com tampão de reidratação: 6 M de ureia, 2 M tioureia, 0,5% v /v de CHAPS, 0,4% v /v de DTT, 0,5% v /v de anfólitos de pH 4-7, para originar um volume final de 120 ul. A mistura foi carregada numa tira Immobiline gradiente de pH 11 cm, e o pH 4-7L (GE Healthcare, Bucks, Reino Unido) de acordo com o método descrito por [16]. Focagem isoeléctrica foi realizada utilizando um Multiphor II (GE Healthcare, Bucks, UK) 10.000 Vh (GE Healthcare, 2004). Depois de se concentrar, a tira de IPG foi armazenado a -80 ° C até à separação por SDS-PAGE como descrito acima. Três réplicas de cada uma das glicoproteínas purificadas por afinidade piscinas foram separados por 2-DE e visualizadas por coloração com Azul de Coomassie coloidal G-250 [15]. imagens gel foram captadas com uma GS-800 Densitometer (BioRad, UK).

Análise de 2-DE separações

As separações 2-DE foram analisadas para identificar glicoproteínas presentes em diferentes níveis no espécimes CRC de pacientes com doença positiva LN. ficheiros de imagens digitalizadas foram analisados ​​utilizando o software progênese PG240 SameSpots (Nonlinear Dynamics, R.U.), a quantidade relativa de proteína num determinado local é inferida a partir do valor de intensidade de pixel e convertidos para uma percentagem da intensidade total de todas as manchas de proteínas no gel. Glicoproteínas que mostram níveis alterados foram classificados de acordo com o valor-p (one way ANOVA) e os valores de dobra de mudança.

Matrix laser assistida espectrometria de massa de dessorção de ionização (MS) Análise

identificação de proteínas foi realizada por acordo comercial com o Dr. Kevin Bailey, da Escola de Ciências Biomédicas da Universidade de Nottingham. manchas de proteína foram excisadas a partir do 2-DE separados géis; dessalinizadas utilizando C18ZipTips fase inversa (Millipore, Reino Unido). 2 ul de amostra dessalinizada péptido foi manchado para um único alvo bem em uma matriz assistida por laser de ionização de dessorção (MALDI) da placa de aço inoxidável com 1 ul de ácido alfa-ciano-4-hydroxycinnaminic contendo padrão interno (hormona corticotrófico adeno, ACTH). O alvo era permitido para o ar seco e analisados ​​utilizando em um MALDI-MS (MicroMass M @ LDI, Waters Corp) Resolução operacional 10.000 largura à meia altura) no modo de reflexão. Os espectros foram adquiridos a 5 Hz usando um laser de nitrogênio (λ 337 nm) com 10 tiros somados por espectros. Os dados foram adquiridos por amostragem ao acaso a partir da placa-alvo e os ficheiros de lista de pico de péptido foram gerados tanto manualmente como automaticamente. Os fundos picos de tripsina e queratina foram excluídos e as listas de pico foram carregados no MASCOTE PMF (https://www.matrixscience.com/) motor de pesquisa de banco de dados com parâmetros definidos da seguinte forma: a tolerância peptídeo 0,2 Da; modificações durante o processo de digestão, tais como metionina oxidada e CAM foram contabilizados e perdeu clivagens foi definido para 1.

Predição de modificações pós-traducionais (PTM)

análise bioinformática foi empreendido usando o NetNGlyc ; NetOGlyc; YinOYang; ferramentas NetPhos em https://www.cbs.dtu.dk/services para identificar potenciais ligados a N, O-GalNAc, O-GlcNAc e O-fosfato locais de modificação nas proteínas de ligação HPA identificados acima.

a análise estatística

as comparações entre os 2 grupos (linfonodo positivo /negativo CRC) foram feitos utilizando amostras de teste t independente de Student para dados contínuos e ANOVA para variáveis ​​categóricas. O coeficiente de Pearson foi também utilizado para determinar se os níveis de HPA ou anexina ligação foram associados com intervalo livre de doença. As curvas de sobrevida foram plotados de acordo com o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank; para todos os ensaios realizados, os valores de P 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA, IBM Company).

Resultados e Discussão

Análise proteômica da

O-

glicoproteínas ligadas em CRC

proteínas recolhidos de tecidos CRC foram fracionados por cromatografia de afinidade HPA, separados por 1-dE e 2-dE e identificados utilizando MS, em uma abordagem proteômica como objetivo caracterizar o

O-

glicanos ligados em elevada CRC metastático para os nodos linfáticos (Fig 1 e Fig S1). Sete glicoproteínas foram identificados utilizando esta abordagem (Tabela 1), incluindo as proteínas da membrana celular anexina 4, 5 e anexina o cálcio do canal de cloreto activado proteína 1 (CLCA1). Anexina 4 foi anteriormente identificada como uma glicoproteína de ligação de HPA na linha celular de cancro colorrectal HT29 [12]. Juntamente com o aumento dos níveis de

O-

glicosilação ligada, também foi identificado aumento dos níveis de CEA (S1 Fig) sugerem que

N-

glicosilação ligada também aumentar em câncer metastático CRC.

As proteínas reunidos a partir de LN + ve CRC amostras de tecido foram purificadas por afinidade com HPA e separado por focagem isoeléctrica sobre uma tira de IPG pH 4-7 e, em seguida, por SDS-PAGE (12%) e visualizados utilizando azul de Coomassie coloidal. Inserção: anexina 4/5 como indicado no LN + ve em comparação com LN-ve CRC conjuntos de proteínas de amostras de tecido. As proteínas identificadas na análise de MALDI-MS são indicados.

O número de acesso de proteína, descrição, pontuação MASCOTE, a cobertura sequência, a massa nominal e previu pI são indicados. Dobre a mudança é a relação entre o volume normalizado média do local separadas por 2-DE do LN + grupo ve eo grupo do LN-ve.

O-

glicosilação ligada , p53 e

KRAS

estado de mutação

uma abordagem histoquímica foi utilizada com HPA como um marcador de

O-

estado de glicosilação ligados. A maioria das amostras foram reactivos com a lectina (n = 24, de um total de N = 27 casos) e exibiram coloração da membrana celular intensa com menor número de casos que apresentam coloração citoplasmática granular, talvez representando a ligação da lectina de glicoconjugados em trânsito através do Golgi aparelho (Figura 2). O microscópio de luz não fornece resolução suficiente para permitir uma estreita interrogatório das organelas intracelulares dos tecidos que prendiam HPA. É possível que algumas das glicoproteínas identificadas no presente estudo são, por conseguinte, as proteínas em trânsito através da via secretora, incluindo o aparelho de Golgi, no entanto, a maior parte do HPA ligação observada usando imuno-histoquímica foi membrana celular associada. Não houve relação entre HPA intensidade de coloração e a idade do paciente, sexo, grau do tumor ou estado LN mas isto pode reflectir as relativamente poucas amostras nesta análise inicial (dados não mostrados). O anticorpo anti-p53 foi fortemente reativa em 13 dos 29 casos e fracamente reativa em mais 7 casos (Fig 2) e o

O-

estado de glicosilação ligada não se correlacionou com a coloração P53. Todos os casos positivos P53 (n = 15) ligado HPA, bem como alguns dos casos P53 negativo (n = 8). O

KRAS

estado de mutação foi avaliada usando uma abordagem baseada em PCR e 8 das 25 amostras avaliáveis ​​apresentaram mutado

KRAS

em qualquer códon 12 ou 13 (26% dos casos), este compara favoravelmente com a sua prevalência na CRC de entre 30-40% [17]. De 8 amostras com mutação

KRAS

, quatro eram simultaneamente positiva para a coloração HPA e todos eles foram P53 positivo. Em conjunto, estes resultados são sugestivos de que

O-

alterações de glicosilação ligados ocorrer no início da etiologia da CRC

À esquerda:. Imagens de microscopia de luz de cortes de tecido colorretal (5 um) incubadas com HPA (10 ug /ml) e estreptavidina-HRP (5 ug /ml) ou incubadas com o anticorpo anti-p53 (1: 200) e de coelho cavalo biotinilado anti-IgG de ratinho (1: 1000), conforme indicado. A coloração marrom indica que a reacção da peroxidase com DAB /H

2O

2, os núcleos foram contrastadas com hematoxilina (azul). Ampliação X400. Direita: Tabela mostrando resultados para HPA, P53 e

KRAS

análise

A validação dos resultados da análise proteômica

anexina 4 e anexina 5 níveis foram examinados. utilizando Western blotting, a FIG 3. Após a normalização para os níveis de p-actina, um aumento significativo no nível de anexina 4 (mas não anexina 5) foi observado nas amostras de tecido de CRC que tinha metastizado para os nódulos linfáticos no momento do diagnóstico (teste t de Student, P = 0,05). Da mesma forma, Western blots foram sondados com HPA e um aumento nas glicoproteínas de ligação de HPA foi observada em amostras de pacientes com nódulos linfáticos positivos (dados não mostrados). Isto é consistente com os resultados de outros estudos que relatam um aumento no

O-

glicosilação ligada em mau prognóstico metastático câncer de CRC. Para determinar se anexina 4 e HPA ligação correlacionada com mau prognóstico CRC uma série adicional de 35 amostras de CRC com o acompanhamento do paciente dados foram avaliados através de imuno-histoquímica. Quando a percentagem de células marcadas (0-100%) ea pontuação coloração agregado (escala 0-7) foram considerados, ambos foram significativamente inversamente correlacionada com a sobrevida do paciente, Fig 4. Por exemplo, quando o placar coloração agregado para HPA foi tomada como ≥5 a sobrevida média foi de 13 meses, em comparação com 68 meses para uma cortada ≤5 (teste do qui-quadrado 9,065, valor P = 0,0026); para anexina 4: quando um corte para a pontuação coloração agregado de ≥5 foi levado a sobrevida média foi de 17 meses; em contraste uma pontuação de ≤5 foi associada com uma sobrevida mediana de 59,6 meses (teste do qui-quadrado 11,45, valor P = 0,0007). Quando os resultados, tanto para anexina 4 e HPA foram combinados estes permaneceram significativamente inversamente associado com a sobrevivência após CRC, Fig 4. Para anexina 4: tomar um corte de ≥60% de células marcadas, a sobrevida média foi de 11 meses, em comparação com 58 meses para ≤ 60% de células de coloração (teste do qui-quadrado 7,466, valor P = 0,0063) ;. Para HPA: ≥50 coloração celular% resultou em uma sobrevida mediana de 11,5 meses; mas quando coloração celular ≤50% foi tomada sobrevida mediana foi de 60 meses (qui quadrado 11,74, valor P = 0,0006), dados não mostrados. Estes resultados ilustram que a ligação de HPA e anti-anexina 4 anticorpos para secções de tecido de CRC são indicadores de mau prognóstico. Tanto o

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glicosilação ligada, como medido por HPA-coloração e os níveis de anexina 4 são marcadores de prognóstico pobre CRC. A complexidade do proteoma torna tumor marcador trabalho de descoberta desafiador; No entanto, existe uma necessidade para a identificação de biomarcadores e alvos novos para o tratamento de CRC. Das muitas modificações pós translacionais para ocorrer em proteínas, glicosilação é o mais abundante e diversificada [18] e aberrações na glicosilação de proteínas relatados no câncer [19] oferecem potencial para identificação de alterações específicas do câncer. proteínas de ligação de hidratos de carbono, as lectinas, foram anteriormente descritos para a captura de up-front de glicoproteínas associadas a cancro [20, 21]. Tem havido um interesse considerável nas glicoproteínas reconhecidos pelo HPA lectina como o envolvimento dos epitopos de ligação de HPA para o processo metastático foi estabelecido usando linhas celulares de cancro derivadas de tecidos tumorais humanos [22]. Integrina α5 e α6 e anexina 2 e 4 foram previamente identificados como os principais parceiros de ligação HPA na linha de células de câncer colorretal metastático HT29 [12]. Neste estudo proteínas a partir de amostras de tecido de CRC foram pré-fraccionado utilizando cromatograf ia de afinidade, permitindo assim o HPA proteínas de baixa abundância de ser isolados e identificados. Diferenças no HPA glicoproteínas de ligação em espécimes que tinha metastizado para os gânglios linfáticos no momento do diagnóstico foram aparentes quando as glicoproteínas foram separados por 1-DE e transferidas para nitrocelulose-indicando um aumento global no

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ligados glicosilação; susceptível de ser associada com a expressão de antigénio Tn e sialil-Tn em cancro [23]. Quando HPA foi utilizado para sondar Western blots de as preparações de proteína do cancro, o número de bandas e a sua intensidade variou em comparação com quando as proteínas tinham sido pré-fraccionado por cromatografia de afinidade com lectinas (Fig S1). Isso pode refletir diferenças sutis em ligação quando HPA foi covalentemente imobilizada a uma matriz de afinidade em comparação com quando a lectina estava em solução livre. A identificação das glicoproteínas de ligação de HPA CRC foi um objectivo significativo do presente trabalho, estes foram comparados com os níveis de CEA a partir das mesmas amostras de tecido e confirmado para ser independente dos níveis de CEA (S1 FIG). Enquanto o estudo de mucinas foi para além do âmbito do presente trabalho, claramente os níveis de MUC1 e MUC2 e as suas propriedades de ligação HPA é uma questão de algum interesse. Do mesmo modo, a localização intracelular das proteínas de ligação de HPA é de interesse. Não é tecnicamente viável para fraccionar organelos celulares quando as amostras de tecido de cancro congelados são usados ​​como material de partida e por isso não fomos capazes de determinar se as glicoproteínas do aparelho de Golgi foram purificados utilizando o passo de cromatograf ia de afinidade. O principal objectivo foi o de identificar proteínas que se ligam ao HPA lectina e que são alteradas no metastáticos e não metastáticos de CRC. À medida que o tecido-coloração usando HPA mostraram coloração da membrana, tanto intracelulares e intensa, que a hipótese de que as glicoproteínas de ligação de HPA identificados neste estudo são susceptíveis de ser derivado da membrana celular, o citosol e, potencialmente, a partir do aparelho de Golgi. proteomic análise de proteínas de ligação de afinidade purificados HPA revelou sete glicoproteinas incluindo anexina 4 e 5 e CLCA1 que foram aumentadas nas preparações a partir dos tecidos de cancro metastáticas. Anexina 4 já foi demonstrado num estudo separado para ser reconhecido por HPA na linha de células HT29 CRC [12]. Todas estas três proteínas foram anteriormente descritos em relação ao CRC mas as proteínas não tenham sido previamente identificado por meio de pré-enriquecimento através

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moeities glicano ligadas. Anexinas constituem uma família de fosfolípido regulado pelo cálcio e de hidratos de carbono de ligação com proteínas diversos papéis intra- e extracelulares na gama de processos celulares, incluindo a sinalização, o transporte de iões, a divisão celular e apoptose [24].