Abstract

Fundo

A teoria de células-tronco do câncer a hipótese de que os cancros são perpetuados por células-tronco cancerosas (CSC) ou células tumorais iniciar (TIC) que possuem auto-renovação e outras cell–tronco como propriedades, enquanto não-tronco /células que iniciam diferenciados têm uma vida finita. Para investigar se a hipótese é aplicável ao câncer de pulmão, a identificação de pulmão CSC e demonstração dessas capacidades é essencial.

Metodologia /principal achado

Os perfis de expressão de marcadores de células-tronco de cinco (CD34, CD44, CD133, BMI1 e OCT4), foram testados por citometria de fluxo em linhas celulares de cancro de pulmão 10. CD44 foi investigado através de testes de

in vitro

e

in vivo

tumorigenecity. Formação de corpos esferóides e

in vivo

tumor capacidade de iniciação foram demonstrados em CD44

+ células de 4 linhas celulares. Serial

in vivo

tumor transplantability em ratinhos nus foi demonstrada usando linha de células H1299. Os xenoenxertos primárias iniciadas a partir CD44

+ células consistia de CD44 mista

+ e CD44

– células em proporção semelhante como a linha de células H1299 parental, apoiando

in vivo

diferenciação. Semi-quantitativa PCR em tempo real (RT-PCR) mostraram que ambos os CD44

+ e CD44

células recém-ordenado + derivadas de CD44

+ – tumores iniciados expressa os genes de pluripotência

OCT4 /POU5F1

,

NANOG

,

SOX2

. Estes marcadores stemness não foram expressas por CD44

– células. CD44

células Além disso, recém-ordenado + eram mais resistentes ao tratamento com cisplatina com menores níveis de apoptose do que CD44

– células. A análise imuno-histoquímica de 141 cancros do pulmão de células não-pequenas ressecados mostraram expressão de células de tumor de CD44 em 50,4% dos tumores, enquanto nenhuma expressão de CD34 e CD133 foi observada em células tumorais. expressão de CD44 foi associado com carcinoma de células escamosas, mas inesperadamente, foi observada uma maior sobrevida em adenocarcinomas que expressam CD44.

Conclusão /Significado

No geral, nossos resultados demonstraram que as propriedades da célula-como-tronco são enriquecidos no CD44 que expressa subpopulações de algumas linhas celulares de cancro do pulmão. Estudos complementares são necessários para esclarecer o papel do CD44 na renovação das células do tumor e propagação do câncer no ambiente

in vivo

Citation:. Leung EL-H, Fiscus RR, Tung JW, Tin VP -C, Cheng LC, Sihoe AD-L, et al. (2010) não-pequenas células cancro do pulmão células que expressam CD44 são enriquecidos para estaminais propriedades da célula-like. PLoS ONE 5 (11): e14062. doi: 10.1371 /journal.pone.0014062

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, China

Recebido: 05 de maio de 2010; Aceito: 26 de outubro de 2010; Publicação: 19 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Leung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Fundo Semente de pesquisa básica (HKU 10.400.863 para MP Wong), um pequeno subsídio projeto (HKU 200.907.176.141 para EL Leung) e uma subvenção de formação em investigação no exterior da China Conselho de Medicina da Universidade de Hong Kong, atribuído a EL Leung. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health Grants R01HL087948, National Cancer Institute Grant R21CA131522 (a Y. Ma). DOE financiamento DOE-FG02-08ER64608 no Instituto Nevada Cancer (a L. M. Fink), um financiamento de arranque do Nevada Cancer Institute e da Universidade de Southern Nevada (com R. R. Fiscus). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo. O prognóstico geral é pobre, com baixa sobrevivência cinco anos, devido à apresentação tardia, recidiva da doença ea falta de terapia sistêmica curativa. Recentemente, as células estaminais cancro teoria (CSC) propõe que os cancros são mantidas por subpopulações de células tumorais que possuem estaminais ou células progenitoras características. Estas células podem iniciar a formação de tumor, diferenciar ao longo das vias de multi-potentes e são relativamente resistentes à quimioterapia convencional [1]. CSC ter sido demonstrada em hematológica e alguns tumores sólidos, tais como cancros da mama, cérebro, cólon, pulmão e fígado [2], [3], [4], [5], [6]. Vários marcadores de células estaminais de tecidos normais foram utilizadas para a identificação e isolamento de CSC. Por exemplo, CD133 é o marcador mais frequentemente demonstrada em cancros do fígado, cérebro, cólon e pulmão, etc, [3], [4], [5], [6]. O CD44

+ /CD24

– /baixo perfil caracteriza CSC em cânceres de mama e próstata [7], [8]. Expressão dos genes-chave “stemness” da embrionárias (ES) e tronco induzida por pluripotentes células (IPS) OCT4 e BMI1 [9], [10] foram encontrados na CSC de cancros diferentes [11], [12].

O perfil de marcador de pulmão CSC continua a ser explorado. Estudos recentes, utilizando linhas celulares de NSCLC e tecidos tumorais pulmonares frescos sugerem CD133 como o pulmão CSC marcador [3], [11], [13], [14], [15], [16]. Estudos bioquímicos mostraram que a CD133 desempenha um papel funcional na regulação do ciclo celular e a proliferação mas não iniciação do tumor [17]. Estudos em câncer de cólon mostrou que CD133

+ células têm um teor de DNA superior [18] e se tornar CD133

– durante a metástase, mas ambos CD133

+ e CD133

– células iniciar tumor em ratinhos SCID [ ,,,0],19]. CD133

– populações de cancro do cólon e melanoma também foram encontrados para ser tumorigénico em ratinhos nus SCID /[19], [20]. Marcadores, tais como ESA, CXCR4, ALDH e ABCG2 têm sido utilizados com CD133 para isolar CSC de cancros do pulmão [13], [21], [22]. CD34 e Sca-1 são úteis para a identificação de células estaminais de murino do pulmão, mas Sca-1 não é expressa em tecidos humanos [23]. Para explorar ainda mais pulmonares marcadores CSC, nós temos uma tela de perfil de CD34, CD44, CD133, BMI1 e OCT4 expressão em linhas celulares de cancro do pulmão 10 por citometria de fluxo. Nós demonstramos que CD44

+ mas não CD44

– células de linhas celulares de cancro seletivo poderia ser expandido e em série propagada

in vitro

e

in vivo

. Propomos que as células que expressam CD44 são enriquecidas para as propriedades de células-tronco. Nosso estudo não mostra que todos os CD44

+ células são bona fide CSC, no entanto, propomos que CD44 pode ser um marcador de capacidade iniciação do tumor em algumas células de câncer de pulmão. O padrão de CD44 expressão foi também caracterizado por cancros do pulmão clínicos.

Resultados

Células-tronco marcador perfil de expressão de linhas de células NSCLC

Foram analisados ​​o perfil da superfície putativa expressão ( CD34, CD44, CD133) e marcadores nucleares (BMI1, OCT4) de células estaminais em linhas celulares de cancro de pulmão 10, utilizando citometria de fluxo (Tabela 1). Dos marcadores de superfície, CD34, CD44 e CD133 foram expressos em diferentes frequências. CD44 foi o principal marcador expresso por H1299 e H23. A549, H441 e H1648 não mostraram expressão dos marcadores de superfície estudados. CD133 foi expresso em apenas HCC1833. Não houve correlação da frequência expressão entre quaisquer 2 marcadores. Ambos os marcadores nucleares, e BMI1 OCT4, foram expressos na maioria das células cancerosas em todas as linhas celulares estudadas. diagramas representativos da citometria de fluxo análise de expressão de CD44 e CD133 foram mostrados na figura 1. Immunoblotting e imuno-histoquímica (IHQ) As análises também foram realizadas em linhas de células que continham CD44

+ e CD133

+ populações (Fig 2A). De imunotransferência mostrou a expressão da proteína CD44 em H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827 e H23. proteína CD133 só foi expressa em HCC1833 PLC8024 e que foi utilizado como uma linha de células de controlo positivo para a CD133 [4]. IHC também mostrou expressão CD133 em HCC1833 mas não H1299, e vice-versa para a expressão de CD44. Assim, os resultados de ambas as análises estavam em conformidade com citometria de fluxo de dados.

diagramas representativos de citometria de fluxo de CD44 (ITCF) e CD133 (PE) expressão em linhas celulares de cancro do pulmão HKULC2, HCC827, HKULC4, H23, HCC1833, H1299 e H1650. As células mortas, restos celulares e dobletes foram fechado para fora. Compensação por fluorescência de fundo foi realizada por medição de sinais alvo de controlos de cor individuais e controles negativos. Os dados foram apresentados em 2D diagramas traçando tanto sinais de PE ou FITC contra um canal ECD® irrelevante (também conhecido como o PE-vermelho do Texas). Os percentuais médios de 3 análises individuais foram apresentados na Tabela 1.

A. immunoblot representante do H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827, H23, HCC1833 e lisado de proteína total PLC8024 usando anticorpos contra CD44 e CD133. Actina foi utilizado como um controlo de carga. O blot foi representativos de três experiências individuais. B. Vista geral para mostrar a densidade de formação de SB CD44

+ e CD44

– H1299 células após a cultura em meio RPMI com EGF, FGF e suplemento de insulina durante 21 dias (painel superior), e morfologia do SB na semanal intervalos (painel do meio). As células da primeira geração SB foram desagregadas e analisadas por citometria de fluxo (painel inferior). O CD44

+ para CD44

– (81,58% a 9,68%) era relação semelhante ao das células H1299 parentais (81,3% para 18,7%, Tabela 1). SSC, Side Scatter Channel. campos C. representativos de formação de colónias de indiferenciados, CD44

+ e CD44

– H1299 células em soft-agar após cultura durante 21 dias. Inserções mostram vistas ampliadas de colónias representativas das respectivas células retiradas sob a mesma ampliação. CD44

– subgrupo mostraram significativamente menos colónias em comparação com tanto CD44

+ e subgrupos não triados. (**, P 0,01). Histogramas representados média de 3 observações independentes a partir de experimentos separados.

Spheroid capacidade formação de linhagens de células NSCLC

A seguir, avaliou corpo esferóide (SB) capacidade formação de FASC-fracionada células de acordo com a expressão de CD44 e CD133 em 7 linhagens celulares. 500 não classificado, marcador

+ e marcador

– células, respectivamente, foram cultivados em condições não-adesivas e livre de soro com EGF, bFGF e suplementos de insulina por 21 dias. A percentagem de formação de SB de cada linha de células foi contado por selecção aleatória campo no dia 21 e os resultados foram representados graficamente como histogramas (Figura Suplementar S1). células não separados a partir de todas as 7 linhas de células foram capazes de formar SB. SB também foram formados a partir de CD44

+ subpopulações de 6 linhas celulares nas quais foi expressa CD44, mas não a partir de células CD44

– subpopulações. Além disso, HKULC2, H1299 e H1650 que continha menores proporções iniciais de CD44

+ células deu origem a significativamente mais SB em comparação com células não triados (* P 0,05, ** p 0,01). Para HCC1833, CD133

+ mas não CD133

– células formado SB. O aumento do número de CD133 SB

+ em comparação com células não triados não foi estatisticamente significativa. Após 21 dias, todos os SB CD44 de H1299

+ células foram dissociadas em células isoladas e re-suspensas em meios de cultura. Até três passagens seriadas foram estabelecidos, indicando

in vitro

auto-renovação do CD44

+ células. Citometria de fluxo da primeira geração de células SB de H1299 mostrou 81,58% de CD44

+ células, que se assemelhava muito a 81,3% das células parentais, demonstrando que

in vitro

tumorigenecity de CD44

+ células resultou em uma descendência com o mesmo perfil de expressão de CD44 (Fig. 2B). ensaio clonogenicidade em agar mole também mostrou que recentemente isoladas H1299 CD44

+ células formadas significativamente mais colónias do que CD44

– células em 3 semanas (** P 0,01), apoio à capacidade de auto-renovação aumentada de células selecionado-CD44 (Fig. 2C).

In vivo

+ células propriedades do CD44-iniciando tumorais e aumento sequencial da eficiência transplante em ratos pelados

a capacidade do células-selecionados marcador para iniciar

in vivo

tumor foi investigada por transplante subcutânea em ratinhos nus. Para H1299, HKULC4, H1650 e HCC827, tão poucos como 10.000 CD44

+ células foram capazes de iniciar tumores em 30-68 dias (Tabela 2), mas nenhum tumor foi formado a partir do mesmo número de não triados ou CD44

– células após 90 dias. Para células não ordenados de H1299, iniciação do tumor poderia ser conseguido por 200.000 células (3/4 ratos), enquanto que CD44 + com células, os tumores foram iniciados por 10000 (04/01 ratinhos), 50000 (04/03 ratinhos) e 100.000 células (4 /4 ratinhos). Para CD44

– células, nenhum tumor foi formada mesmo usando 200.000 células (0/4 ratinhos) (Fig tumores 3A-representante, Tabela 2.). Temos dissecados os ratos e examinou todos os órgãos e não encontrou a formação de tumor metastático das células ordenados ou não ordenados sob o período observado. Para HKULC2 e H23, embora tenha sido observada a formação SB, nenhum tumor xenoenxerto foi formada utilizando 200.000 indiferenciados, CD44

+ ou CD44

– células. Da mesma forma, 200.000 não classificado, CD133

+ ou CD133

-. Células HCC1833 não formaram tumores

A. imagens representativas de tumores de xenoenxerto de primários. iniciação do tumor foi conseguida por 200.000 células não triados (3/4 ratos). De CD44

+ células, os tumores foram iniciados por 10000 (04/01 ratinhos), 50000 (04/03 ratinhos) e 100.000 células (4/4 ratos). Nenhum tumor foi formada com 200.000 CD44

– células (0/4 ratinhos). PBS, controle de injeção de solução salina. B. A citometria de fluxo análise de xenoenxertos primárias e secundárias desagregados mostrou semelhante CD44

+ para CD44

– rácios subgrupo como células H1299 parentais. Eixo X: expressão de CD44, o canal FITC; Eixo Y: células mortas coradas pelo canal PI, PE. C. Semi-quantitativa análise de RT-PCR de xenoenxertos primárias mostraram expressão da forma padrão CD44 (CD44s) e pluripotência genes (

POU5F1

,

NANOG

,

SOX2

) em CD44

+ mas não CD44

– subgrupos. D. Análise de IHC de xenoenxertos de gerações sequenciais de ratos receptores mostraram expressão de CD44 na distribuição da membrana celular. As células hospedeiras de origem do mouse presente no estroma tumoral não foram coradas. curvas de crescimento do tumor do primário, tumores de xenoenxerto secundárias e terciárias formados por células H1299 não triados e ordenados-CD44 foram plotados através da observação e medição tumor formação semanalmente por até 9 semanas, os ratos Afterwhich foram escarificadas para evitar o crescimento excessivo de tumores.

os próximos experimentos testados se a capacidade de iniciação do tumor poderia ser propagada

in vivo

. Desde H1299 + CD44 mostrou a menor latência de formação de tumor (Tabela 2), que dissociado H1299 tumor primário para demonstrar

In vivo

série tranplantability. Apenas as células tumorais viáveis ​​de xenotransplantes H1299 desagregados foram selecionados para o transplante do tumor em série em secundária e, posteriormente, ratos destinatário terciárias. Os tumores foram formados a partir de CD44

+ mas não de CD44

– células (Tabela 3). Notavelmente, embora as proporções de CD44 vivo

+ (células de 47,73% para o primário, secundário para 0,91%) (Fig 3B) foram reduzidas em transplante em série, a eficiência da iniciação do tumor aumentou em gerações sucessivas de tumor. A latência de formação de tumores de 5.000 CD44

+ células foi progressivamente reduzido de 30 dias da primeira geração, a 21 dias do segundo e 14 dias da geração terciário, respectivamente. O número de células necessárias para iniciar tumores terciárias também diminuiu para 1000 CD44

+ células.

Para analisar a capacidade de diferenciação de CD44

+ células, os tumores colhidos foram desagregadas e submetido a A análise de citometria de fluxo. O CD44

+ :CD44

– razão entre o tumor primário foi 80.72:17.0, e do tumor secundário foi 85.4:12.53. Estes eram na mesma gama que as células parentais (81.3: 18,7), demonstrando a expressão de CD44 hierarquia semelhante de gerações sequenciais de xenoenxertos (Fig. 3B). Uma análise mais aprofundada do tumor primário por RT-PCR revelou a expressão dos marcadores de pluripotência

POU5F1

,

NANOG

e

SOX2

em CD44

+ mas não CD44

-. subpopulações (Fig. 3C)

Fig. 3D mostra a coloração IHC representativo para CD44 e crescimento do tumor curvas dos xenotransplantes primárias e serialmente transplantados. Como mostrado pela curva de crescimento do tumor, os tumores primários e serialmente transplantados iniciada a partir de 50.000 CD44

+ células cresceu mais rápido do que 200.000 células indiferenciados.

CD44

+ células expressa pluripotência e epitelial-mesenquimal-Transição (EMT) marcadores e possuía potencialidades de diferenciação

foram mostrados a expressão de genes de pluripotência e aquisição de características mesenquimais para indicar um fenótipo de células-tronco. Nós demonstramos co-expressão das proteínas embrionárias OCT4, NANOG e SOX2 por estudos se On SB de CD44

+ H1299 células. Semi-quantitativo de RT-PCR foi também realizada em recém classificados CD44

+ e CD44

– células H1299. Expressão de

OCT4

,

NANOG

,

SOX2

e os marcadores mesenquimais

SNAI1

,

CDH2

e

VIM

foram mostrados em CD44

+ células, mas foram inferiores ou indetectável no CD44

– células. Desde expressão diferencial da norma (

s

) e formas variantes (

v3

,

v5

,

v6

e

v10

) de CD44 tem sido demonstrada em haste ou células diferenciadas, nós investigamos o padrão de

CD44

splicing de ARNm por RT-PCR. Ambos os formulários-tipo e variantes foram encontrados em CD44

+ mas não CD44

– células, sugerindo retenção de

CD44

mRNA potenciais splicing diferenciais em CD44

+ em comparação com CD44

– subpopulação (Fig. 4A B).

A. Caracterização de imunofluorescência de SB de CD44

+ subpopulação, mostrando co-expressão de OCT4, NANOG e SOX2. DAPI, controle; Verde, OCT4-FITC; Vermelho, SOX2-Texas Red; Azul, pseudo de NANOG pelo anticorpo conjugado com PE. B. análise semi-quantitativa RT-PCR mostrou genes pluripotência,

SNAI1

,

CDH2

,

VIM

,

CD44s

e

v3 CD44 , 5,6,10

expressão em CD44

+ células. CD44

– H1299 células não têm esses expressão exceto para

CDH2

e

VIM

. C. CD44

+ células eram mais resistentes aos efeitos apoptóticos de cisplatina 5 uM em comparação com CD44

– em células H1299 e H1650 após incubação de 24 h. Histogramas representados média de três experiências individuais de indiferenciados, células CD44 + e CD44- antes e após o tratamento com cisplatina.

CD44

+ células foram cisplatina-resistente

recentemente classificadas CD44

+, CD44

– e células não ordenados de H1299 e H1650 foram cultivadas em meio RPMI isento de soro e submetido a tratamento com cisplatina 5