Sumário

A autofagia é um processo celular dependente de energia altamente regulado, onde proteínas, organelas e citoplasma são seqüestradas em autofagossomas e digerido para sustentar a homeostase celular. Colocámos a hipótese de que, durante a autofagia induzida em células cancerosas por i) inanição através de soro e de aminoácidos privação ou ii) o tratamento com PI-103, uma classe I PI3K /inibidor da mTOR, metabolismo glicolítico seria afectada, a redução de fluxo de lactato, e que esta efeito pode ser reversível. Nós sondado metabolismo durante a autofagia em HT29 colorectal e células knock-out HCT116 Bax usando hyperpolarized

13 C-magnética espectroscopia de ressonância (MRS) e steady-state

1H-MRS. 24 hr PI103-tratos ou de fome provocou redução significativa na constante de velocidade para a frente aparente (k

PL) de piruvato em troca de lactato em comparação com controles em HT29 (100 M PI-103: 82%, p = 0,05) e HCT116 Bax células -Ko (10 uM PI-103: 53%, p = 0,05; 20 uM PI-103: 42%, p 0,0001; inanição: 52%, p 0,001), associada com a excreção de lactato reduzida e lactato intracelular em todos casos e atividade inalterada lactato desidrogenase (LDH) e aumento da NAD + /NADH após o tratamento PI103 ou diminuição da atividade da LDH e inalterada proporção + /NADH NAD seguinte fome. Depois de 48 recuperação hr de tratamento PI103, k

PL manteve-se abaixo dos níveis de controle em células HT29 (74%, p = 0,02), e aumentou acima dos valores tratados, mas manteve-se abaixo dos níveis de controle tratados com veículo 24 hr em HCT116 Bax-ko As células (65%, p = 0,004), ambos foram acompanhadas por redução sustentada na excreção de lactato, a recuperação de NAD +, entre /NADH e lactato intracelular. Após a recuperação a partir de fome, k

PL foi significativamente maior do que os controlos 24 hr tratados com veículo (140%, p = 0,05), associada com o aumento da actividade de LDH e de NAD celular total (H). Mudanças no k

PL e lactato celular e excretada fornecida indicadores mensuráveis ​​dos principais processos metabólicos que acompanham a inanição e autofagia induzida por drogas. As mudanças são reversíveis, retornando em direção e excedendo os valores de controlo sobre a recuperação celular, o que potencialmente identifica resistência. k

PL (hyperpolarized

13 C-MRS) e lactato (

1H-MRS) fornecer biomarcadores úteis para o processo de autofagia, permitindo o acompanhamento não-invasivo do efeito Warburg

Citation.: Lin G, Andrejeva G, Wong Te Fong AC, Encosta DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) Redução Warburg efeito em células de câncer submetidos Autophagy: estacionário Estado

1H-MRS e Real-Time hyperpolarized

Estudos 13C-MRS. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10.1371 /journal.pone.0092645

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2014; Publicação: 25 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores reconhecer o apoio recebido da Cancer Research UK e EPSRC Cancer Centro de Imagem em associação com o MRC e do Departamento de Saúde (Inglaterra) conceder C1060 /A10334, também NHS financiamento para o Centro de Investigação NIHR biomédica, studentship MRC-financiada, também Chang Gung Medical Foundation (Taiwan) concede CMRPG370443 e CMRPG3B1922. MOL é um Investigador Sênior NIHR. Os autores também agradecer Alice Warley em College London Centre do Rei para ultra-Imagem (CUI) para assistência com microscopia eletrônica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A autofagia é um reversível resposta celular catabólico dependente do lisossoma ativado em fome ou estresse pelo qual as proteínas, organelas e citoplasma são sequestrados dentro autofagossomas dupla membrana e subsequentemente digerido e reciclada para manter o metabolismo celular [1]. Autophagy é essencial para manter a homeostase celular e é um processo altamente regulado que pode reabastecer as reservas de energia degradada durante a fome por remoção e degradação de componentes citoplasmáticos. No entanto, a activação prolongada de vias autofágicos pode conduzir à depleção de organelas e proteínas críticas que podem resultar na morte da célula [2], [3]. Autophagy tem sido investigada em muitos campos de investigação, incluindo o cancro [2] – [4], doenças cardiovasculares [5] e neurodegeneração [6], uma vez que, por um lado, proporciona um mecanismo de protecção biológica em resposta a tensões celulares mas, por outro ele pode também contribuir para os mecanismos de morte celular. Este processo pode, paradoxalmente, permitir que as células cancerosas para sobreviver em ambientes hostis e recuperação ajuda uma vez que a tensão é removida, proporcionando um mecanismo potencial de resistência à terapia [4]. Algumas terapias anti-cancro, tais como inibidores de PI3K /mTOR, são conhecidos por induzir autofagia em células [7] de cancro e pode também induzir a autofagia em tumores, potencialmente, prolongando a sobrevivência do tumor [4], [8]. Actualmente, autofagia é melhor avaliada por observação de vacúolos autofágicos dupla da membrana por microscopia electrónica (ME) e Western blotting da conversão de proteína ubiquitina-LC3I como a LC3II [9]. Atualmente não há métodos não-invasivos para monitorar a indução de autofagia ou subsequente recuperação da autofagia. Além disso, as alterações metabólicas que acompanham autofagia e recuperação a partir deste processo são mal compreendidas.

As células cancerosas glicólise aeróbica, muitas vezes apresentam uma melhor, também conhecido como o efeito de Warburg, com o aumento da regulação da transcrição de um certo número de enzimas glicolíticas, incluindo lactato desidrogenase -A (LDH-A). Aumento do efeito Warburg foi mostrado para conduzir tanto o crescimento tumoral e a disseminação de metástases e está associado a um mau prognóstico no cancro [10]. Autofagia envolve muitos processos metabólicos importantes, alguns dos quais são regulados por vias de sinalização oncogênicos. Há uma considerável interação entre pontos de controle autofágicos e nós principais em vias de sinalização oncogênicas, levando a pathway inibidores em alguns casos, afetando diretamente o processo de autofagia, ou indiretamente, modulando as mesmas vias metabólicas que são induzidos por autofagia [11], [12]. Por exemplo, a inibição da mTORC1 é um motor essencial da indução de autofagia em células de câncer [11], [12]. estresse celular decorrente de falta de aminoácidos ou inibição de PI3K direta poderia causar autofagia através da inibição da mTORC1 com ambos os processos que causam efeitos metabólicos, para além dos directamente resultantes de autofagia. Estas situações também podem ser encontrados durante o tratamento do câncer em pacientes.

Imagem por Ressonância Magnética (MRI) é amplamente utilizado para geração de imagens em medicina e MR espectroscopia (MRS) fornece uma análise química específica de concentrações dos metabólitos em extratos de células, células inteiras , biópsias de tecidos e

in vivo

[13]. Os recentes avanços na hyperpolarized

13 C-Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS) empregando dinâmico Polarização Nuclear (DNP) têm permitido melhoria significativa do

sinal de 13C-MRS intrínseca por várias ordens de magnitude em uma série de metabólitos e permitiu reais medições -time da cinética de uma série de reacções enzimáticas endógenas importantes, tanto

in vitro

em suspensões de células inteiras viáveis ​​e

in vivo

em tumores [14]. A taxa de câmbio constante aparente de hyperpolarized piruvato [1-

13 C] a lactato (k

PL) fornece um potencial biomarcador para o diagnóstico metabólico [15] e para avaliar a resposta ao tratamento [16] – [20]. K

PL Também foi demonstrado para diminuir a seguir a morte celular induzida por drogas, atribuída a apoptose com a activação de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e esgotamento dos cofactores nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD (H)) [14 ].

o ciclo do TCA deverá tornar-se mais activa durante autofagia, como os aminoácidos e os ácidos gordos gerados pelo processo autophagic são utilizados para manter a homeostase energética [21], que conduz a modulação da glicólise aeróbica em autophagic células. Colocámos a hipótese de que estas alterações levaria a uma redução no fluxo a partir do piruvato em lactato, o que poderia ser invertida se as células recuperadas a partir autofagia. Neste estudo, nós medimos a aparente [13C 1-

] piruvato a lactato taxa de câmbio, k

PL, por DNP e

13 C-MRS, a fim de desenvolver um biomarcador não invasivo da droga induzida autofagia e subsequente recuperação da autofagia, e para obter mais insights sobre as alterações metabólicas que acompanham a autofagia induzida por drogas. Nós investigamos as alterações metabólicas longitudinais associadas a autofagia induzida por drogas e sua recuperação e comparou-os com as alterações metabólicas associadas com o modelo estabelecido de autofagia, a indução por inanição. Foram utilizadas duas linhas de células HT29, e carcinoma do cólon HCT116 Bax-deficiente (HCT116 Bax-Ko) [22], nestes estudos. células HCT116 Bax-ko ter prejudicado vias de apoptose que permitem a avaliação das alterações metabólicas associadas à autofagia induzida por drogas, na ausência de apoptose. Autophagy foi induzida em células quer por estes soro e fome aminoácido com solução salina equilibrada de Hanks meios (HBSS), ou por tratamento com PI-103, um inibidor de PI3K de classe I /mTOR [7].

O nosso estudo confirmou nossas hipóteses, mostrando que as células submetidos a autofagia tinha reduzido k

PL medida com DNP e

13 C-MRS, em conjunto com a redução de lactato intracelular e excreção de lactato medido pelo

1H-MRS, refletindo um efeito Warburg reduzida durante processos celulares autofágicos inanição e induzida por drogas. Estes efeitos metabólicos importantes são invertidos quando as células recuperar de inanição e autofagia induzida por drogas, proporcionando um potencial meio de identificação de resistência. Os resultados mostram que as medições de k

PL por hiperpolarizado

13C-MRS, bem como lactato por

1H-MRS proporcionar biomarcadores sensíveis dos efeitos metabólicos associados com autofagia inanição e induzida por drogas, juntamente com sua recuperação, fornecendo informações críticas em um aspecto importante do metabolismo da célula cancerosa.

Materiais e Métodos

cultura celular

Todos os meios e reagentes para a cultura de células foram adquiridos da Life Technologies . células HT29 (a partir de American Type Culture Collection, ATCC) foram cultivadas em meio de McCoy 5A com glutamina e HEPES. células HCT116 Bax-ko (a simpática oferta do Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Medical Center, EUA; via Dr. Paul Clarke, ICR, Sutton, Reino Unido [23]) foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Medium com glutamina, e não aminoácidos essenciais. 10% de FCS inactivado por calor com 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina foram adicionados a todo o meio. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera e meios de crescimento reabastecidos cada 48 horas. células HT29 foram tratadas com 100 uM de PI-103 durante 24 h. células HCT116 Bax-KO foram tratadas com meio de HBSS durante 6 ou 24 horas e com 10 pM ou 20 pM de PI-103 durante 24 h.

Para a análise celular e metabólica das células recuperadas a partir autofagia, HBSS 24 hr ou 20 uM de PI-103-tratados células HCT116 Bax-ko e células HT29 100 um PI-103-tratadas foram mantidas durante mais 48 h em meio DMEM normal (com glutamina, aminoácidos não essenciais, 10% de soro fetal de vitela e penicilina adicionada) ou meio de McCoy 5A (com glutamina e HEPES) meios de cultura sob condições padrão, respectivamente.

a análise do ciclo celular

2 × 10

6 células foram fixadas com 70% de etanol durante 30 min a 4 ° C, incubou-se com 100 ug /ml de ARNase e 40 ug /ml de PI em solução salina tamponada com fosfato durante 301min a 37 ° C. histogramas de ADN foram gerados por análise de FACS.

análise

Anexina V /PI

5 × 10

5 as células foram ressuspensas em tampão de ligação, incubadas a 25 ° C durante 5 min no escuro com 5 mL de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -annexin-V e 5 mL de PI (BioVision), e analisados ​​por meio de fluorescência de células activadas (FACS, citometria de fluxo BD LSRII) para determinar a ligação de anexina e exclusão de PI.

Western blotting

Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por transferência de western tal como descrito previamente [22]. proteína celular lisado foi transferido para membranas Immobilon-P (Millipore; Bedford MA, USA). As membranas foram bloqueadas em leite magro a 5% ou 5% de albumina bovina e depois incubaram-se com anticorpo primário para pS6RP (Cell Signaling), S6RP (Cell Signaling), p4E-BP1 (Cell Signaling), total de 4E-BP1 (Cell Signaling) , pAkt (Cell Signaling), Akt total (Cell Signaling), PARP clivada (Cell Signaling), caspase 3 (Cell Signaling), LC3 (Cell Signaling), MCT-1 (Millipore) ou MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). As membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho (GE Healthcare). Western blot para α-tubulina (Cell Signaling), desde um controle de carga. interações de ligação específica de proteína anticorpo-alvo foram detectadas utilizando quimioluminescência aumentada além de reagentes (Amersham Biosciences, Buckingham-shire, Reino Unido) e exposição a qualquer Hyperfilm ECL (Amersham) ou XOMAT Kodak (Rochester NY, EUA), filme de auto-radiografia.

lactato desidrogenase enzimática ensaio

total de atividades de LDH celular foram medidos usando métodos espectro-fotométrica padrão [24]. As células foram recolhidas por tratamento trysin padrão, lisadas em gelo em tampão de extracção (Trietanolamina /HCl a 50 mM, EDTA mM, MgCl

2 2 mM, mercaptoetanol 26 mM, 1) e centrifugou-se a 16000 g durante 10 min para dar as concentrações totais de proteínas nos sobrenadantes de cerca de 5 mg /ml. As reacções foram iniciadas por adição de soluções de ensaio (Trietanolamina /HCL 60 mM, NADH 0,17 mM, piruvato de sódio 0,4 mM, Triton a 0,05%), e as actividades de enzimas de LDH foi medida espectrofotometricamente a 340 nm, com actividades enzimáticas medidos em nmol /min por milhões de células.

NAD + /NADH medição

total de rácios de NAD + /NADH celulares foram medidos usando um kit de NAD + /NADH quantificação (BioVision, mountain View, CA, EUA), de acordo com o protocolo fornecida.

a microscopia electrónica

As células foram cultivadas em placas de 13 mm e fixada durante 4 horas em 2,5% de fixador de glutaraldeído em tampão fosfato a 4 ° C. Após a fixação, as monocamadas de células foram colocadas em solução de lavagem e, em seguida, glutaraldeído pós-fixadas em tetróxido de ósmio Millonigs fixador durante 15-30 minutos. As culturas foram desidratadas através de uma série gradual de 10% a 100% de etanol, infiltraram, e, em seguida, incorporado em meio TAAB Pré-mistura de resina. Secções ultrafinas foram recolhidos em grades de cobre e coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo. Os cortes foram visualizados usando um microscópio electrónico de transmissão Hitachi H7600.

DNP

estudos 13C-MRS

[1-

13 C] ácido pirúvico contendo radical OX63 15 mM livre foi polarizados para 1 h num polarizador HyperSense DNP (Oxford Instruments Molecular Biotools Ltd, Abingdon, Reino Unido) em 1,4 3.35T e K como descrito anteriormente [25]. A amostra polarizada foi dissolvido em uma solução tamponada com fosfato contendo 50 mM de lactato não marcado, EDTA e NaOH para atingir um pH final de 7. 100 uL desta mistura foi adicionada a uma suspensão de 500 ul de células (~40-80 milhões de células) em um tubo de RMN de 5 mm. A concentração final de piruvato polarizado foi 8 mM, após o que série

13C-MRS espectros foram adquiridos numa sonda BBO cada 2 segundos com um pulso de 10 ° de rádio-frequência num sistema de 500 MHz Bruker RMN (Bruker Biospin, Coventry, REINO UNIDO). As células foram mantidas a 37 ° C durante toda. Os espectros foram Serial fase de linha de base e corrigido, e integrados utilizando software de Topspin (Bruker Biospin, Coventry, RU). Os integrais de pico integradas nas experiências de piruvato /lactato foram representados graficamente como uma função do tempo e mínimos quadrados-montagem foi realizada em Matlab (The Mathworks Inc., Natick, MA, EUA). As constantes de velocidade aparente foram obtidos por montagem simultaneamente piruvato e lactato integrais das equações de Bloch modificados usando um modelo de troca de dois locais incorporando correcção flip-ângulo, como previamente descrito [25]. As constantes de velocidade aparentes (k

PL) para a reação direta da conversão de piruvato em lactato são normalizados para número de celular.

1H-MRS ° extratos médios e células f cultura

As células foram extraídas por meio de procedimentos de extracção em fase dupla, como descrito anteriormente [26]. extractos solúveis em água foram e reconstituído em 700 ul liofilizado água deuterada (D

2O, Sigma Aldrich) e os extractos (500 uL) colocadas em tubos de 5 mm de RMN. 50 mL de 0,75% de sódio de 3-trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) em D

2O (Sigma Aldrich) foi adicionado às amostras para a calibração de desvio químico e quantificação. amostras de meios de cultura de células seguintes vários regimes de tratamento foram também analisadas por

1H-MRS, coletadas antes células foram colhidas para extrações celulares. 500 ul de amostra e meios 50 ul de D

2O foram colocados no tubo de RMN com 50 mL de 0,75% em TSP D

2O para a calibração de desvio químico e quantificação. atribuições espectrais foram baseados em valores da literatura [27].

espectros de 1H foram adquiridos com um espectrómetro Bruker 500 MHz (Alemanha) com 7500 Hz largura espectral, 16384 pontos no domínio do tempo, 128 scans, 298K temperatura, tempo de aquisição de aproximadamente 5 minutos. A ressonância da água foi suprimida por irradiação fechado centrada na frequência da água. processamento espectral foi realizada utilizando o pacote de software Topspin-2 (Bruker Biospin, Coventry, RU), e as concentrações do metabolito foram quantificadas e normalizadas para o número de células.

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média. Para a comparação dos fluxos metabólicos, as concentrações do metabolito e os rácios, o teste t de Student não emparelhado foi utilizado com um valor P de ≤0.05 considerado como sendo estatisticamente significativo. Todos os testes estatísticos foram bilaterais.

Resultados

PI-103-tratos e fome provoca a autofagia reversível em células HT29 e HCT116 Bax-ko

foi observado indução de autofagia em células HT29 HCT116 Bax-ko e tratada com PI-103, tal como confirmado pela sobre-expressão de LC3II em transferências de western (Figura 1a e b). A indução de autofagia e sobre-expressão de LC3II também foi encontrado em células HCT116 Bax-ko após 6 e 24 horas de inanição em células HCT116 Bax-ko (Figura 1a). Um maior nível de expressão LC3I e LC3II foi observada após 24 horas de fome, quando comparado com fome 6 horas. A seguir à remoção da PI-103 ou o tratamento de reabastecimento de meio de crescimento normal após 24 horas de tratamento PI-103 ou inanição, respectivamente, a sobre-expressão de LC3II retornou aos níveis basais após 48 horas de recuperação (Figura 1b-d). Assim, o ponto de tempo de 48 horas a seguir inanição 24 h ou com um tratamento PI-103 foi escolhido para o DNP e

1H-MRS medidas de recuperação. Não houve qualquer indicação de apoptose, como mostrado pela falta de PARP clivada ou mudança de caspase 3 em células expressões PI-103-tratados ou em jejum (Figura 1A-D). A fim de se obter um controlo positivo para a apoptose, a apoptose foi induzida em células HCT116 de tipo selvagem (WT), por tratamento de TRAIL, como TRAIL tem sido relatado para induzir a apoptose em células HCT116 WT [22]. Como esperado, observou-se a presença de PARP clivada e redução do nível de caspase 3 em células HCT116 WT tratados com TRAIL, quando comparado com controlos tratados com veículo (Figura 1B e C).

(a) Western blot de LC3, PARP clivada, caspase 3 e α-tubulina no controle de células HCT116 Bax-ko e em 10 mM ou 20 mM PI-103-tratados ou células HCT116 Bax-ko tratados com HBSS 6 horas e 24 horas. (B) As transferências de Western de LC3, clivados PARP, caspase 3 e α-tubulina em células HT29 de controle e em 24 hr 100 células HT29 uM PI-103-tratada e às 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas da sua recuperação. células HCT116 WT tratados com TRAIL são utilizadas como controlo positivo para a apoptose, como TRAIL tem sido relatado para induzir a apoptose em células HCT116 WT [22]. Como esperado, a presença de PARP clivada e altamente reduzidas caspase 3 expressões foram observadas em células HCT116 WT tratados com TRAIL 24 hr, quando comparado com controlos tratados com veículo. (C) As transferências de Western de LC3, clivados PARP, caspase 3 e α-tubulina no controle células HCT116 Bax-ko e em 24 horas 20 células HCT116 Bax-Ko-tratados PI-103? M e às 24 horas e 48 horas da sua recuperação . células HCT116 WT tratados com TRAIL são utilizadas como controlo positivo para a apoptose. (D) As transferências de Western de LC3, clivado da PARP, caspase 3 e α-tubulina em células HCT116 de controlo Bax-ko e em 24 h de células HCT116 Bax-KO tratados com HBSS e às 24 e 48 horas da sua recuperação.

a presença de vacúolos autofágicos foi confirmada por microscopia electrónica realizada em faminto (como autofagossomas dupla de membrana) ou PI-103-tratada (predominantemente como estruturas autolysosomal fase posterior) células HCT116 Bax-ko, indicando a indução de autofagia (Figura 2). vacúolos autofágica estavam ausentes nas células de controlo.

Electron imagens de microscopia de vacúolos autofágicos no controle, 10 mM ou 20 mM PI-103-tratadas ou células HCT116 Bax-ko tratados com HBSS 6 horas e 24 horas. As setas vermelhas ilustram alguns dos vacúolos autofágicos em diferentes fases do processo de autofagia.

Os níveis de necrose e apoptose em células HT29 e HCT116-Bax ko sob jejum e tratamento PI-103 foram avaliadas em células aderentes por anexina V /análise PI (Figura 3a), demonstrando uma maioria de células viáveis ​​com uma pequena percentagem de necrótica (HT29 tratados com DMSO (veículo de controlo): 6,5 ± 2,2%; 100 uM PI-103: 10,7 ± 2,7% (p = 0,29); HCT116 Bax-ko DMSO-tratados (veículo de controlo): 1,5 ± 0,1%; 6 h fome: 1,9 ± 0,2% (p = 0,06) e 24 h fome: 3,0 ± 0,4% (p = 0,01); 10 uM PI-103: 4,6 ± 0,4% (p = 0,02) e 20 uM de PI-103: 6,6 ± 0,4% (p = 0,79)) ou células apoptóticas (HT29 DMSO-tratados: 1,0 ± 0,7%; 100 uM PI- 103: 2,0 ± 1,4% (p = 0,54); HCT116 Bax-Ko veículo de controlo: 6,6 ± 0,5%; 6 h fome: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) e 24 h fome: 13,8 ± 0,8% (p = 0,003); 10 uM PI-103: 4,0 ± 0,1% (p = 0,26) e 20 uM de PI-103: 4,1 ± 0,2% (p = 0,30)) em grupos de controlo e tratados. Sem as células flutuantes foram observados em qualquer um dos grupos tratados.

(a) Anexina V e iodeto de propídio coloração (PI) ensaio para medir a percentagem de células que sofrem apoptose e necrose em células HT29 seguinte de 24 horas de 100 uM PI -103 tratamento e HCT116 Bax-ko células seguintes 24 horas de 10 mM ou 20 mM tratamento PI-103, ou 6 horas ou 24 horas de inanição. Os dados são expressos como médias de percentagem ± S.E.M. (Mínimo

n

= 3 em cada grupo). Estatisticamente mudanças significativas são indicadas (* p 0,05). (B) número de células em comparação com os controlos tratados com DMSO 24 h em células HT29 após a recuperação tratados com DMSO 24 h, 24 h de 100 M tratamento PI-103 e seus controles tratados com o veículo 48 recuperação horas e 24 horas em HCT116 Bax-ko células seguintes 24 horas de 10 mM ou 20 mM tratamento PI-103, ou 6 horas ou 24 horas de fome e sua recuperação a partir de 24 hr de 20 mM tratamento PI-103 ou inanição. Os dados são expressos como médias de percentagem ± S.E.M. (Mínimo

n

= 3 em cada grupo). Estatisticamente mudanças significativas são indicadas (* p 0,05). (c) Análise do ciclo celular. Os dados são médias de porcentagem ± S.E.M. células HT29 24 hr de controlo tratados com DMSO, controle recuperou-DMSO 24 h, 24 h PI-103-tratados 100 M, 24 hr PI-103-recuperado, 48 horas PI-103-recuperado, (

n

= 3, em cada grupo); HCT116 Bax-ko células de controlo tratadas com DMSO 24 h, controle recuperou-DMSO 24 h, 24 h PI-103-tratados 20 mM, 24 horas PI-103-recuperado, 48 horas PI-103-recuperado, (

n

= 3, em cada grupo); células HCT116 Bax-ko 6 hr de controle de mídia completo, 6 horas de fome (HBSS), 24 hr de controle de mídia completo, 24 horas de fome (HBSS), 48 hr-recuperado HBSS (

n

= 3 em cada grupo) . * P . 0,01

A redução do número de células aderentes foi encontrada em todos os grupos de tratamento após 24 h de 100 tratamento M em células HT29 (78 ± 2%, p 0,01), 6 horas e 24 horas de inanição (46 ± 0.1% e 36 ± 0.4%, respectivamente, p 0,01) ou 24 h de 10 uM e 20 uM PI-103 tratamento (65 ± 0.1% e 58 ± 0.1%, respectivamente, p 0,01 ) em células HCT116 Bax-ko, quando comparados com os controles (Figura 3b). Induzida por PI-103 Um aumento no número de células aderentes acima dos níveis de controlo tratados com veículo 24 h foi observada em (170 ± 8%, p 0,05 (HCT116 Bax-Ko); 303 ± 16%, p 0,01 ( HT29)) e induzida por inanição (117 ± 7%, p 0,05 células) e autofágicos seguinte de 48 horas de recuperação (Figura 3b), o que indica que a população de células aumentou acima dos níveis de controle a seguir a recuperação de autofagia. As células tratadas com veículo 24 horas foram utilizados como controlos para ambos os grupos de tratamento e de recuperação, tal como as células de controle seria muito confluentes por 48 horas de recuperação.

análise do ciclo celular por citometria de fluxo foi realizada em cada grupo de tratamento , e após 24 h e 48 h de recuperação (Figura 3c). Um ponto de tempo de recuperação de 24 h para os controlos tratados com DMSO, também foi incluída para cada experiência PI-103 como o número de células destes grupos são semelhantes aos números de células de células tratadas com PI-103 seguinte de 48 horas de recuperação. paragem em G1 foi observada em células HT29 e HCT116-Bax ko após o tratamento com PI-103, voltando ao nível tratado com DMSO 24 h por 48 horas de recuperação (Figura 3c). Aumento da fase G1 também foi encontrado em 24 horas recuperou HT29 tratados com DMSO (9 ± 3%, p = 0,01) e HCT116 Bax-ko células (11 ± 1%, p = 0,004), quando comparado com células tratadas com DMSO 24 h. As percentagens de 24 horas recuperou células tratadas com DMSO a cada fase do ciclo celular são muito semelhantes ao PI 48 horas recuperou-103-tratada ponto de tempo, tanto as células HCT116 Bax-ko (Figura 3C) e HT29. Isto pode ser devido ao controle recuperado (DMSO-tratado) e células tratadas com PI-103 sendo mais confluente nestes pontos de tempo, o que é consistente com os seus números de células comparáveis.

Nenhuma alteração no ciclo celular perfil de células HCT116 Bax-ko foi observada após 6 ou 24 horas de jejum (Figura 3C). Uma diminuição em G1 (12 ± 4%, p = 0,04) e um aumento na fase G2 (5 ± 1%, p = 0,003) foram encontrados em 48 horas recuperou células HCT116 Bax-ko, quando comparado com o controle tratado com meios 24 hr as células e os números de células são semelhantes entre os dois grupos (Figura 3C). Nenhuma mudança significativa no tamanho das células foi observada em nenhum dos grupos de tratamento quando comparado com os controles.

tratamento PI-103 reduz a AKT e mTOR ativação em células HT29 e HCT116 Bax-ko e este processo é reversível

os efeitos do tratamento com PI-103 sobre a AKT e vias mTORC foram examinados em células HT29 e HCT116 Bax-KO durante o tratamento e durante 24 e 48 horas de recuperação. Redução da expressão de pAkt e p4E-BP1 foi visto em células HT29 e HCT116-Bax ko seguinte 24 h de tratamento PI-103, com a expressão destas proteínas que retornam aos níveis pré-tratamento depois de 48 horas de recuperação (Figura 4a e b). PS6 expressão reduzida também foi encontrado em células HCT116 Bax-KO tratados com PI-103 e o seu nível recuperado a partir de 24 horas de recuperação (Figura 4b). Tomados em conjunto, estes dados indicam que o tratamento com PI-103 inibe a via do AKT e mTOR em ambas as linhas de células e este processo é reversível, quando a droga é removida e as células são deixadas a recuperar.

Western blots de PS6 proteína ribossômica, proteína ribsomal total de S6, p4E-BP1, o total de 4E-BP1, pAkt, Akt total e α-tubulina (carregamento de controle) na PI-103-tratada e sua recuperação em células HT29 e HCT116 Bax-ko.

em tempo real aparente

13 C-piruvato em taxas de câmbio lactato são reduzidos em PI-103 e fome induzida por autofagia, permanecendo reduzida após a recuperação da PI-103, mas aumentando com recuperação de fome

hyperpolarized [1-

13 C] piruvato em troca de lactato foi monitorado em tempo real por

13 C-MRS para medir a cinética de troca em células autofágicos. Figura 5a mostra médio

13 C-MR espectros calculados para cada grupo pela soma ao longo de toda a série temporal dinâmico para suspensões de células HCT116 Bax-ko após a adição de hyperpolarized piruvato [1-

13 C] no controle, 24 hr inanição e 48 horas de recuperação da autofagia. A Figura 5b mostra a série temporal correspondente do integral do pico normalizado do sinal de lactato nos mesmos grupos. taxa de câmbio aparente constante k

PL foram medidos por mínimos quadrados não lineares ajustadas aos dados dinâmicos em cada grupo e os dados são apresentados como razões (tratados de controle do veículo /24 hr) na Figura 5-C.

(a) hyperpolarized

13 C espectro de um ensaio de células HCT116 Bax-ko mostrando a soma ao longo de toda a série temporal dinâmico a partir de um experimento de célula de controlo, na sequência de inanição 6 horas, 24 inanição hr com a mídia HBSS e depois a fome de 24 horas seguidas por 48 hr a recuperação das células. O espectro mostra picos de piruvato (Pir), lactato (Lac) e piruvato hidratado (Pyr H). (B) Lote do pico de lactato integral como uma função do tempo, normalizada para o pico piruvato integrante no tempo t = 0 s e normalizada por milhão de células adquiridas para as células de controlo HCT116 Bax-ko, inanição 24 h com meio HBSS e fome 24 hr seguido de 48 horas de recuperação. (C) As razões médias (tratado veículo de controlo /24 h) da velocidade de reacção para a frente aparente de piruvato em lactato troca de k

PL (derivado de ajuste dos dados experimentais e normalizado ao número de células) (± SEM) durante 24 horas de recuperação tratados com DMSO, 100 uM PI-103 tratadas e de recuperação de 48 h a seguir 100 uM tratamento PI-103 em células HT29; para 10 ^ M PI-103 tratado, 20 uM PI-103 tratadas e de recuperação de 48 horas após o tratamento com 20 uM de PI-103 em células HCT 116 Bax-ko; e durante 6 horas HBSS fome, 24 hr HBSS fome e inanição 24 horas seguido por 48 recuperação hr em células HCT116 Bax-ko. Mínimo

n

= 3 em cada grupo. Estatisticamente mudanças significativas são indicadas (* p≤0,05)

Diminuição k

PL foram observadas em células HT29 tratados com PI-103. (82 ± 7% do controle; p = 0,05) ( Figura 5c). Não houve diferença significativa em K

PL foi encontrada entre o grupo tratado com 24 hr veículo de DMSO e a 24 h recuperado DMSO-veículo grupo tratado (Figura 5C) em células HT29, apesar do número de células e a população de células em fase G1 sendo superior a 24 horas em recuperado grupo tratado com DMSO (Figura 3B e C). Assim, K

PL nos grupos de recuperação foi comparada com os seus respectivos controlos tratados com veículo 24 hr. k

PL permaneceu menor em células HT29 seguinte 48 horas de recuperação do tratamento PI-103 (74 ± 4% do controle; p = 0,02)., quando comparado com os controlos tratados com DMSO 24 h (Figura 5C)

Redução K

PL foram encontrados em células HCT116 Bax-KO tratados com 10? M (52,5 ± 9,4% do controlo; p = 0,05) e 20 uM de PI-103 (41,1 ± 5,3% do controlo; p 0,0001 ), quando comparados com os controles DMSO-de veículos (Figura 5c). Na sequência de 48 horas de recuperação constante de velocidade aparente foi elevada em comparação com as taxas de tratamento, mas não retornou às taxas de controlo tratados com veículo 24 h (65 ± 7% do controle; p = 0,004). (Figura 5c)