Abstract

A patogênese da adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) permanece mal compreendido. S100 proteína de ligação ao cálcio A6 (S100A6) tem sido associado com PDAC; No entanto, o efeito sobre a migração de S100A6 PDAC e invasão não foi ainda explorado. Neste estudo, as células Panc-1 foram transfectadas com um plasmídeo de induzir a superexpressão de S100A6, e β-catenina foi derrubado usando um ARN curto gancho de cabelo específica (shRNA). A ferida-cura e ensaios Transwell demonstrou que S100A6 promoveu a migração de células PDAC e invasão. Além disso, β-catenina shRNA inibiu a migração e a invasão de células PDAC. Confirmámos que S100A6 induz a migração celular e invasão PDAC através da activação de β-catenina in vitro. Avaliação do ARNm e os níveis de proteína revelou que S100A6 induz um aumento da expressão de β-catenina, N-caderina e vimentina, e a diminuição da expressão de E-caderina nas células PDAC. β-catenina shRNA também alterou a expressão de transição epitelial-mesenquimal (EMT) relacionados com marcadores em células PDAC. Especificamente, a expressão de E-caderina foi aumentada, enquanto que a expressão de N-caderina e vimentina foi diminuída. Finalmente, foi demonstrado que S100A6 altera a expressão de marcadores relacionados-EMT através da activação β-catenina. Em conclusão, S100A6 induz EMT e promove a migração celular e invasão de um modo dependente-β-catenina. S100A6 podem, portanto, representar um novo alvo terapêutico potencial para o tratamento de câncer pancreático

Citation:. Chen X, Liu X, Lang H, Zhang S, Luo Y, Zhang J (2015) S100 ligante de cálcio Proteína A6 promove epitelial-mesenquimal Transição através de β-catenina em linha celular do cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10.1371 /journal.pone.0121319

Editor do Academic: Yue Wang, Instituto Nacional de Viral Controle e Prevenção de Doenças, CDC, China, CHINA

Recebido: 10 de dezembro de 2014; Aceito: 30 de janeiro de 2015; Publicação: 23 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação básica e Cooperação clínica da Capital Medical University No.13JL77 (China). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é um grave problema de saúde global. É a quarta causa mais comum de morte por câncer nos Estados Unidos, com uma taxa de sobrevida de 5 anos relativo global de 6% [1]. Na China, o tempo médio de sobrevivência de pacientes PDAC é de 7,8 meses, com 30,0% dos pacientes submetidos a operações intenção curativa, e apenas 9,8% dos pacientes que receberam tratamento abrangente [2]. Apesar dos avanços no tratamento, PDAC permanece extremamente resistente a regimes de radioterapia e quimioterapia actualmente disponíveis [3]. Um contribuinte para o mau prognóstico é a compreensão limitada da patogênese do câncer de pâncreas. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente para elucidar os mecanismos moleculares associadas com a ocorrência, e o desenvolvimento de metástases de esta doença letal.

S100A6 pertence à família S100, expressão do qual está ligada a tumorigénese e metástase [4] . Logsdon et al. [5] usou microarrays ao perfil de expressão gênica PDAC, a identificação de um total de 158 genes relacionados com o cancro do pâncreas, incluindo S100A6. O nosso grupo já havia realizado análise imuno-histoquímica da expressão S100A6 em tecidos pancreáticos, confirmando que a expressão S100A6 é elevada em amostras PDAC, em relação aos tecidos normais [6]. Ohuchida et ai. [7] demonstraram que a expressão de S100A6 é restrita principalmente para os núcleos de células de cancro do pâncreas, e os níveis elevados de expressão de proteínas nucleares S100A6 estão associadas com um mau prognóstico. O papel de S100A6 em relação à formação de tumor e a metástase é, no entanto, mal compreendida. Alguns estudos têm mostrado que S100A6 está envolvido na regulação da via de sinalização Wnt /β-catenina [8], o que leva à degradação da β-catenina.

Wnt /β-catenina destino celular influências de sinalização, proliferação, polaridade, e da morte celular durante o desenvolvimento embrionário, bem como a homeostase do tecido em adultos [9]. regulação aberrante desta via é, portanto, associada a uma variedade de doenças, incluindo o cancro, fibrose e neurodegeneração [10]. A via Wnt é composta pelo receptor de ligando e de proteína da superfície celular de Wnt, em adição aos componentes citoplasmáticos e um complexo de transcrição nuclear específica [11]. Quando a proteína ligando da Wnt se liga a, um receptor da superfície celular frizzled, Wnt da via é activado. Citoplasmática β-catenina, em seguida, entra no núcleo da célula, onde se modula a transcrição, de forma a influenciar a proliferação de células de tumor e metástases. Neste processo, β-catenina é a molécula efectora chave [12]. Uma variedade de proteínas celulares, incluindo Wnt, pode influenciar a produção β-catenina e a acumulação no citoplasma. RNA sequenciamento de células tumorais pancreáticas circulante implica Wnt e β-catenina na metástase [13].

Há uma riqueza de pesquisas sobre os atributos de células tumorais circulantes que se relacionam com a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT refere-se a transdiferenciação de células epiteliais em células mesenquimais sob certas condições fisiológicas e patológicas, acompanhado pela morfologia celular e alterações de expressão de genes [16]. EMT ocorre numa variedade de processos, tais como o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, algumas doenças crónicas, e metástases de tumores fase inicial. Down-regulação da caderina-E, um marcador epitelial, é uma característica da EMT. A perda de E-caderina é acompanhada pela regulação positiva de marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina e vimentina. EMT é necessário para a maior parte das metástases tumorais, incluindo PDAC [17]. A via /β-catenina Wnt é uma das vias de sinalização mais importantes envolvidos na indução de EMT.

Neste relatório, nós investigamos a função e mecanismo associado de S100A6 em relação ao EMT indução, avaliando sua influência sobre Panc-1 migração e invasão celular.

Materiais e Métodos

linha celular

a linha de células de cancro pancreático humano, Panc-1, foi adquirido da American Type Culture Collection (EUA). As células foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (Invitrogen, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS, Invitrogen, EUA), 1% de penicilina e estreptomicina (Invitrogen, EUA) a 37 ° C com 5% de CO

2.

Plasmids e RNA Interferência

os DNAs complementares para S100A6 humana e do DNA de controlo negativo foram inseridos num vector plasmídeo GV146 comprado de Genechem (Xangai, China). Uma sequência de direccionamento shRNA β-catenina (5′-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 ‘) e uma sequência de controlo negativo foram sintetizados e ligados no vector pRFP-C-RS (OriGene Technologies, EUA). Os plasmídeos foram amplificados de acordo com as instruções do fabricante. A análise da sequência após a clonagem revelou 100% de homologia com sequências publicadas.

Transient transfecção e criação de linhas celulares estáveis ​​

O plasmídeo superexpressão S100A6 e o ​​plasmídeo de controlo foram transfectados em células Panc-1 utilizando opti- MEM forma reduzida de soro (Invitrogen, EUA) e Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

β-catenina e shRNA controlo shRNA foram transfectados em células Panc-1, tal como indicado acima. Após a transfecção transiente, as células Panc-1 foram seleccionados utilizando 1,0 ug /ml de puromicina, e mantidas em meio de crescimento suplementado com 1,0 ug /ml de puromicina. populações clonais de células foram isoladas por transferência de tufos individuais de células em poços individuais de uma placa de seis poços. As células foram então mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2.

Em seguida, S100A6 superexpressão e de controlo plasmídeos foram transfectados em β-catenina knockdown linhas celulares estáveis, tal como acima referido.

-cicatrização de feridas Ensaio

as células foram semeadas em placas de seis cavidades e foram transfectadas com o plasmídeo controlo ou a sobre-expressão S100A6, e β-catenina ou shRNA controlo shRNA. Após 36 horas, o meio completo foi substituído por DMEM com FBS livre, e após mais 6 h, as monocamadas de células foram feridas com uma ponta de plástico estéril de 200 mL. As culturas foram posteriormente mantidas em FBS-DMEM livre, e áreas das feridas foram observadas e fotografadas utilizando um microscópio invertido, a 0, 24 e 48 horas após o ferimento. A largura da ferida foi medida utilizando software de imagem J. taxa de cicatrização de feridas foi avaliada como se segue:

Transwell Ensaio

Transwell câmaras (Corning, EUA) com um poro de 8 mm foram utilizados para avaliar a migração em placas de 24 poços. Após a transfecção, um volume de 200 ul de células, a uma densidade de 1 x 10

5 /mL em DMEM com FBS livre, foi semeada para as câmaras superiores. As câmaras inferiores foram cheias com DMEM contendo 10% de FBS como um factor de estimulação. As câmaras foram incubadas numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C, 5% de CO

2 ambiente, durante 8 h. As células foram então fixadas com etanol a 95% durante 20 minutos, coradas por violeta cristal durante 30 minutos, e contadas utilizando um microscópio com uma objectiva de 40 x.

Para avaliar a invasão celular, BioCoat Matrigel (BD Biosciences) (300 ug /mL, 100 uL por câmara) foi aplicada para as câmaras de inserção superior 5 h antes de seguir o procedimento para o ensaio de migração descrito acima.

quantitativa PCR em Tempo real

o ARN total a partir de Panc -1 células foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). O ARN total foi utilizado como molde para sintetizar ADNc, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA). PCR em tempo real foi realizado utilizando um Sistema de Real-Time PCR 7500 (Applied Biosystems, EUA), com uma mistura reaccional consistindo de 5-uL 2 x de SYBR Verde Master Mix, 1-molde uL, 0,4-ul iniciador para a frente, 0,4- ul iniciador inverso e água de 3,2 mL RNA-free. As condições dos ciclos foram 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95C durante 15 s e 60 durante 1 min. Os níveis de expressão do gene foram normalizados em relação à de GAPDH. Todas as reacções foram realizadas em triplicado. níveis de mRNA relativos foram apresentados como 2

-ΔΔCt [18]. Os iniciadores utilizados estão detalhados na Tabela 1.

Western Blot

Depois de transfecção, as células foram recolhidas utilizando tampão de lise RIPA (Solarbio, Beijing, China) suplementado com inibidor de protease PMSF (Solarbio , Pequim, China). As concentrações de proteína das amostras foram determinados utilizando um kit de quantificação de proteínas (Keygen Biotech, Nanjing, China). As amostras (40-100 ug) foram então sujeitas a 10% de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas durante 2 h em 5% de leite em pó desnatado. As membranas foram incubadas com anticorpos específicos, a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos primários que se seguem foram utilizados neste estudo: anti-β-catenina (Cell Signaling Technology 8480, EUA), anti E-caderina (ab1416 Abcam, EUA), anti-N caderina (ab19348 Abcam, EUA), anti-vimentina ( ab8069 Abcam, EUA) e anti-β-actina (Tecnologia Cell Signaling 8457, EUA). As membranas foram depois incubadas com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes (Odyssey). Western blot foram quantificados utilizando Odyssey Infrared Imaging. os níveis de expressão da proteína foram normalizados em relação à de β-actina.

Análise estatística

Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas de forma independente, pelo menos, três vezes. Os dados estão apresentados como médias ± DP (desvio padrão). Estudante de

t

-test foi usada para análise estatística. Todos os dados foram analisados ​​utilizando o pacote de software SPSS 17.0 estatística e números foram gerados utilizando o software GraphPad Prism 5. Para todos os testes, p 0,05 foi considerado para indicar significância estatística.

Resultados

S100A6 promove a migração de células PDAC e invasão in vitro

Para avaliar se S100A6 promove a migração de células PDAC e invasão, Panc-1 As células foram transfectadas com um plasmídeo superexpressão S100A6 ou um plasmídeo de controlo. Em tempo real de RT-PCR foi utilizado para verificar que o plasmídeo superexpressão S100A6 aumentou os níveis de mRNA de células S100A6 em Panc-1. Detectamos um aumento significativo no nível de ARNm S100A6 em células que sobre-expressam S100A6, em comparação com células de controlo (p 0,001) (. A Fig S1). Em seguida, temos explorado o efeito da expressão S100A6 na invasão de células in vitro. Um ensaio de cicatrização de feridas revelaram um aumento significativo na taxa de cicatrização de feridas em células S100A6-sobre-expressam, em comparação com células de controlo, aos 24 e 48 h (p = 0,006 e p 0,001, respectivamente) (Fig. 1A e 1B). Um ensaio Transwell também revelou um aumento da migração e invasão de células S100A6 (p = 0,04 para o ensaio de migração, p = 0,006 para o ensaio de invasão) (Fig. 1C e 1D) que sobre-expressam. Estes dados sugerem que S100A6 promove a invasão de células PDAC.

(A) O ensaio de cicatrização, as células que sobre-expressam S100A6 (esquerda), as células de controlo (direita). (B) A taxa de cicatrização foi significativamente maior em células que sobre-expressam S100A6, em relação às células de controlo, aos 24 e 48 h. (C) ensaio Transwell, “I” representa superexpressão S100A6 no ensaio de migração; “II” representa o grupo de controlo no ensaio de migração; “III” representa superexpressão S100A6 no ensaio de invasão; “IV” representa o grupo controle no ensaio de invasão. (D) de gráfico estatística representativas para o ensaio Transwell, que mostra um aumento significativo na migração (I) e invasão (II) por células que sobre-expressam S100A6, em relação às células de controlo. * P 0,05; ** P 0,01.

S100A6 altera a expressão da β-catenina e marcadores relacionados com a EMT em células PDAC

Ao investigar as possíveis mediadores a jusante da S100A6 responsáveis ​​pela promoção da migração celular PDAC e invasão , notou-se que a sobre-expressão de S100A6 resultou num aumento significativo nos níveis de ARNm β-catenina em células de Panc-1 (p = 0,006) (Fig. 2A). Dado que EMT desempenha um papel importante no processo de invasão de metástases, procedeu-se a avaliar a expressão de marcadores relacionados-EMT. A expressão do marcador de E-caderina epitelial foi reduzida ao nível do ARNm, enquanto que a expressão dos marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina foi aumentada (p 0,001, P = 0,002 e p 0,001, respectivamente) (Fig. 2B). Examinámos também os níveis de proteína de β-catenina e os marcadores EMT utilizando transferência de Western, e confirmado que a sobre-expressão de S100A6 aumentou a expressão de β-catenina (p = 0,024) (Fig. 2C e 2D), diminuiu a de E-caderina , e aumentou a expressão de N-caderina e vimentina (p = 0,009, p = 0,026, p = 0,044, respectivamente) (Fig. 2E e 2F). Juntos, estes resultados sugerem que eleva os níveis de S100A6 β-catenina e altera a expressão de marcadores relacionados-EMT em células PDAC.

(A) A sobre-expressão de S100A6 resultou num aumento significativo no nível de ARNm de β-catenina em células Panc-1. (B) PCR em tempo real revelou que a sobre-expressão S100A6 resultou numa diminuição da expressão de E-caderina, e o aumento da expressão de N-caderina e vimentina. (C) transferência de Western revelou que S100A6 upregulated β-catenina no nível da proteína. (D) de gráfico estatística representativa que mostra os níveis de proteína β-catenina aumentados, em comparação com o controlo. (E) transferência de Western revelou que a sobre-expressão S100A6 resultou na expressão alterada de marcadores relacionados-EMT. Especificamente, a expressão de proteínas de E-caderina foi reduzida, enquanto que a expressão de N-caderina e vimentina foi aumentada. (F) Os níveis relativos de proteína E-caderina, N-caderina e vimentina diferiram significativamente entre a condição S100A6 e que sobre-expressam o controlo. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

β-catenina shRNA migração alterada e invasão das células PDAC in vitro

Para explorar o efeito da β-catenina em matéria de migração e invasão de células PDAC, usamos β- catenina shRNA para gerar uma linha celular estável knockdown β-catenina Panc-1. células Panc-1 transfectadas com os não-alvo shRNA foram usadas como controlo. Knockdown de β-catenina foi confirmada por PCR em tempo real e Western blotting (p 0,001 e p = 0,001, respectivamente) (. A Fig S2). Um ensaio de ensaio Transwell e cicatrização de feridas foram realizados para avaliar o efeito de β-catenina em migração e invasão. O ensaio de cicatrização demonstrado que knockdown de β-catenina inibiu significativamente a migração de células PDAC em comparação com a condição de controlo em ambos os 24 e 48 horas (p = 0,013 e p = 0,002, respectivamente) (Fig. 3A e 3B). O ensaio Transwell revelou diminuição da migração e invasão nas células knockdown β-catenina, em comparação com o controlo (p = 0,009 para o teste de migração, p = 0,015 para o ensaio de invasão) (Fig. 3C e 3D). Estes dados indicam que a inibição da β-catenina reduz a migração e a invasão de células PDAC in vitro.

(A) O ensaio de cicatrização de feridas revelaram uma diminuição significativa na migração no grupo shRNA β-catenina (esquerda) , em relação ao grupo de controlo (direita). (B) A taxa de cicatrização de feridas era significativamente mais baixa em células que expressam S100A6, em comparação com o controlo, às 24 e 48 h. (C) O ensaio Transwell demonstrado que β-catenina shRNA diminuiu drasticamente o número de células e a migração (× 40) invadir. “I” representa β-catenina shRNA no ensaio de migração; “II” representa o grupo de controlo no ensaio de migração; “III” representa β-catenina shRNA no ensaio de invasão; “IV” representa o grupo controle no ensaio de invasão. (D) de gráfico estatística representativas para o ensaio Transwell, mostrando uma redução significativa na migração (I) e invasão (II) no grupo shRNA β-catenina, em comparação com o grupo de controlo. * P 0,05; ** P 0,01.

β-catenina shRNA altera a expressão de marcadores relacionados com a EMT em células PDAC in vitro

Para avaliar se β-catenina está envolvido na EMT, avaliamos a expressão de marcadores relacionados-EMT no ARNm e os níveis de proteína em β-catenina-knockdown células Panc-1. Knockdown de β-catenina resultou no aumento dos níveis de E-caderina de ARNm, e diminuição dos níveis de N-caderina e ARNm de vimentina (p = 0,002, p 0,001 e p 0,001, respectivamente) (Fig. 4A). resultados de transferência de Western respeitantes a expressão da proteína foram consistentes com os dados de RT-PCR em tempo real. Especificamente, a expressão de proteínas de E-caderina foi aumentada, enquanto que a expressão de N-caderina e vimentina foi reduzida (P = 0,004, P = 0,007 e P = 0,017, respectivamente), em células Panc-1-β-catenina knockdown (Fig . 4B e 4C). Estes dados sugerem que o nível de expressão β-catenina se correlaciona com a expressão de marcadores relacionados-EMT em células PDAC.

(A) β-catenina shRNA resultou num aumento significativo nos níveis de ARNm de caderina-E, e uma redução significativa nos níveis de N-caderina e ARNm vimentina. (B) Western blot revelaram que β-catenina shRNA resultou na expressão da proteína regulada positivamente de E-caderina e regulados negativamente a expressão da proteína de N-caderina e vimentina. (C) Os níveis de proteína de E-caderina, N-caderina e vimentina foram significativamente diferentes entre o grupo shRNA β-catenina e o grupo de controlo. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

S100A6 promove a migração de células PDAC e invasão através da activação β-catenina in vitro

Para explorar se S100A6 promove a migração de células PDAC e invasão através da regulação da β-catenina, nós transfectadas estável β-catenina-knockdown células Panc-1 com um plasmídeo superexpressão S100A6. Foi avaliada a expressão β-catenina utilizando em tempo real de RT-PCR e análises de Western blot. Não houve diferenças significativas no ARNm e os níveis de proteína entre os dois grupos (p = 0,354 e p = 0,765, respectivamente) (Fig S3.). Estes resultados sugerem que β-catenina foi de facto de forma estável batido para baixo, e que a sua expressão não foi influenciada pela sobreexpressão S100A6. A seguir, realizou ensaios de cicatrização de feridas e para avaliar Transwell migração e invasão destas células. O ensaio de cicatrização demonstrou que a migração não foi significativamente diferente entre os dois grupos, a 24 ou 48 h (p = 0,983 e p = 0,875, respectivamente) (Fig. 5A e 5B). Os resultados do ensaio Transwell foram consistentes com o ensaio de cicatrização da ferida, sem diferenças significativas entre os grupos para nenhum migração ou invasão (p = 0,803 para o teste de migração, p = 0,659 para o ensaio de invasão) (Fig. 5C e 5D ). Estes dados indicam que S100A6 não tem efeito sobre migração e invasão em células PDAC β-catenina knockdown-estáveis. Isto sugere que S100A6 promove a migração celular e invasão PDAC através da activação β-catenina in vitro.

(A) O ensaio de cicatrização da ferida, não revelaram alteração na migração de células β-catenina-shRNA sobreexpressam S100A6 (esquerda) em comparação com o grupo β-catenina-shRNA controlo (direita). (B) Não houve diferença significativa na taxa de cicatrização entre os dois grupos. (C), não houve diferença significativa nos resultados do ensaio Transwell entre os dois grupos, no que diz respeito tanto a migração e invasão (x 40). “I” representa β-catenina-shRNA + S100A6 sobreexpressão no ensaio de migração; “II” representa-catenina-β shRNA + S100A6-controle no ensaio de migração; “III” representa β-catenina-shRNA + S100A6 sobreexpressão no ensaio de invasão; “IV” representa β-catenina-shRNA + S100A6-controle no ensaio de invasão. (D) gráfico estatístico Representante para o ensaio transpoço, não apresentando diferença significativa na migração (I) ou a invasão (ii) ensaios entre os dois grupos.

S100A6 promove EMT através da ativação de β-catenina

para investigar o potencial relação mecânica entre S100A6 e β-catenina em relação ao EMT em câncer pancreático, nós células transfectadas estáveis ​​β-catenina-knockdown Panc-1 com um plasmídeo superexpressão S100A6 ou um plasmídeo de controlo, e avaliados a expressão de marcadores relacionados-EMT. Em tempo real de RT-PCR não demonstrou diferenças significativas nos níveis de ARNm de caderina-E, N-caderina e vimentina entre os dois grupos (p = 0,227, P = 0,228 e P = 0,067, respectivamente) (Fig. 6A). Nós confirmamos que os níveis de proteína de E-caderina, N-caderina e vimentina também não diferiram entre os dois grupos (p = 0,267, p = 0,638 e p = 0,940, respectivamente) (Fig. 6b e 6c). Estes resultados sugerem que S100A6 não tem efeito sobre os marcadores relacionados-EMT em células PDAC-β-catenina knockdown estáveis, indicando que S100A6 altera a expressão de marcadores relacionados-EMT através da activação de β-catenina.

(A) Não houve diferenças significativas na expressão de marcadores relacionados-EMT entre células β-catenina-shRNA sobreexpressam S100A6 e células de controlo β-catenina-shRNA. (B) Western blotting revelaram alterações semelhantes na expressão de marcadores relacionados-EMT nos dois grupos. (C) Não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos no que diz respeito à expressão de E-caderina, N-caderina e proteína vimentina.

Discussão

Neste estudo, nós demonstraram que a sobre-expressão S100A6 promove, e β-catenina shRNA inibe a migração celular e invasão PDAC. Nós estabelecemos que S100A6 promove a migração de células PDAC e invasão através da activação β-catenina in vitro. Nós também confirmou que a expressão S100A6 correlaciona-se com a de β-catenina e que a expressão de marcadores relacionados-EMT em células PDAC é modificada por sobreexpressão tanto S100A6 e β-catenina knockdown.

S100A6 é referido como sendo regulada positivamente em um certo número de cancros, incluindo pulmão, colo-rectal, da pele, gástrico, adenocarcinoma ductal pancreático e outros cancros epiteliais [19]. Relata-se que a expressão aumentada de S100A6 pode promover a proliferação e migração celular em carcinoma hepatocelular humano [20]. Além disso, os níveis séricos S100A6 pode servir como um biomarcador potencial de prognóstico no cancro gástrico, e a inibição da S100A6 diminui o potencial metastático de células de cancro gástrico [21]. Em carcinogénese pancreática, ensaios de imuno-histoquímica têm sido utilizados para demonstrar que as células pancreáticas intraepiteliais 1a não expressam S100A6, e que a proporção de células coradas positivamente aumenta proporcionalmente com o grau PanIN, com os níveis de ARNm S100A6 também aumentar de uma forma gradual [22,23] .

uma vasta gama de modelos experimentais sugerem um papel importante para β-catenina na metástase do câncer de pâncreas [24]. Nowotny et ai. [25,26] sugeriram que S100A6 pode ter um efeito sobre a proteína de ligação calcyclin (CacyBP) /Siah-1 interagindo proteína (SIP) e um supressor de alelo G2 de Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP foi identificado como uma proteína de ligação S100A6 que está envolvido na ubiquitinação e degradação de β-catenina [27]. A seqüência de Sgt1 compartilha 20% de identidade com a de CacyBP /SIP. Além disso, Sgt1 e CacyBP /SIP foram encontrados para ligar Skp1 e ativar a proteína Skp1p-cullin-F-box (SCF) ubiquitina ligase. Este ligase é descrita em células de mamífero como um complexo que regula a ubiquitinação e degradação de β-catenina fosforilada [28]. Um outro estudo [29] confirmou que CacyBP /SIP não é detectada em tecidos normais do pâncreas, mas é detectada no cancro pancreático. Por conseguinte, S100A6 especular que afecta a degradação de β-catenina através Cacy BP /SIP e Sgt1 em PDAC. Neste estudo, S100A6 expressão induzida β-catenina em ambos os níveis de mRNA e proteína. Além disso, tanto um ensaio de cicatrização de feridas e um ensaio Transwell demonstraram que a sobre-expressão S100A6 promove a migração celular e invasão PDAC.

em numerosos modelos, incluindo linhas de células epiteliais e de carcinoma mamário, a via /β-catenina Wnt é pensado para induzir EMT. β-catenina é normalmente ligada a E-caderina, que é importante para as ligações célula-célula e o citoesqueleto de caderina. Além disso, o transporte β-catenina para o núcleo pode promover a expressão de genes relacionados EMT [30]. Alguns estudos [31-34] confirmaram que alguns fatores podem controlar plasticidade epitelial e alterar a metástase através da regulação β-catenina-dependente no PDAC, câncer colorretal, carcinoma hepatocelular e câncer de mama. Este estudo também demonstrou que β-catenina knockdown pode induzir a sobre-regulação de E-caderina e a regulação negativa de N-caderina e vimentina.

Um estudo recente relatou que S100A4, um membro da família S100, poderia ser um factor fundamental na promoção do processo EMT no PDAC [35]. Neste estudo, nós exploramos as relações entre S100A6, β-catenina, EMT e invasão celular PDAC. Confirmámos que S100A6 pode induzir EMT de um modo dependente-β-catenina, demonstrando que S100A6 podem promover migração celular e invasão através β-catenina in vitro. O papel exato da família S100 e proteínas relacionadas com relação ao câncer de pâncreas é uma questão importante que merece um estudo mais aprofundado.

Conclusão

S100A6 pode induzir EMT e promover a migração e invasão celular em um β forma -catenina-dependente. S100A6 podem, portanto, representar um novo alvo terapêutico potencial para PDAC.

Informações de Apoio

S1 Fig. A transfecção com a sobre-expressão S100A6 resultou num aumento significativo no nível de ARNm S100A6

*** p 0,001

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s001

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S2 Fig. β-catenina foi batido com sucesso em células de baixo PDAC.

(A) em tempo real de RT-PCR revelou uma diminuição significativa no nível de ARNm β-catenina em células shRNA β-catenina Panc-1. (B) Western blot revelou uma diminuição significativa da proteína β-catenina no grupo shRNA β-catenina, em relação ao controlo. (C) O nível de proteína β-catenina foi significativamente diferente entre os dois grupos. ** P 0,01; *** P 0,001

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121319.s002

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S3 Fig. β-catenina expressão não foi regulada por S100A6 nas células estáveis-β-catenina knockdown.

(A) Não houve diferenças significativas nos níveis de β-catenina mRNA entre as células β-catenina knockdown-estáveis ​​com superexpressão S100A6 e estável p-catenina de células que expressam o knockdown plasmídeo de controlo. (B) Western blotting revelaram alterações semelhantes em β-catenina entre os dois grupos. (C) Não houve diferenças significativas entre os níveis de proteína β-catenina entre os dois grupos.

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doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003

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