Sumário

fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um mitogénio angiogênico envolvidos na promoção da angiogênese do tumor dentro do corpo. O VEGF é uma proteína-chave necessária para a progressão do tumor de benigno para o fenótipo maligno. Neste estudo, investigou-se a afinidade de ligação de um 26-mer sequência de ADN aptâmero previamente seleccionada (SL

2-B) contra o domínio de ligação a heparina (HBD) do VEGF

165 proteína. O SL

2-B foi primeiro quimicamente modificados por introdução de ligações fosforotiolato (PS-relações). Subsequentemente, a ressonância plasmónica de superfície (SPR) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD) foram utilizados para determinar a afinidade de ligação, especificidade e deduzir a conformação de SL-PS modificado

Sequência 2-B. Finalmente, a actividade antiproliferativa do SL modificado

Sequência 2-B em células cancerosas Hep G2 foi investigada. Nossos resultados demonstram uma melhoria acentuada no bioestabilidade do SL

sequência 2-B após a modificação PS. O SL

sequência 2-B modificada também exibe reforçada atividade antiproliferativa contra células cancerosas Hep G2 em condições de hipoxia. Além disso, a modificação SL

Sequência 2-B inibe a expressão de uma Jagged-proteína, que é um dos ligandos ligados ao VEGF via de sinalização delta /irregular-entalhe

citação:. Kaur H, Li JJ, Bay BH, Yung L-YL (2013) Investigando a atividade antiproliferativa de alta afinidade DNA Aptamer sobre as células cancerosas. PLoS ONE 8 (1): e50964. doi: 10.1371 /journal.pone.0050964

Autor: Antonio Facchiano, IDI, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Itália |

Recebido: 02 de maio de 2012; Aceito: 29 de outubro de 2012; Publicação: 16 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kaur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da investigação do Ministério da Educação Fundo de investigação Académica Tier 2 concessão MOE2008-T2-1-046 Singapura e Tier 1 concessão R279000282112. Os autores também apreciado a bolsa de doutorado (para H.K.) da NUS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo e foi responsável por 7,6 milhões de mortes em 2008 [1], [2]. Nos Estados Unidos sozinho, cerca de 1 em cada 4 pessoas morrem devido ao câncer [3]. Actualmente, os anticorpos monoclonais são um dos agentes terapêuticos mais avançadas para o tratamento do cancro no mercado. Várias drogas aprovadas pela FDA monoclonais de anticorpos, tais como bevacizumab (nome comercial: Avastin) contra o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) no colo-rectal, do pulmão, e do tratamento do cancro do rim, trastuzumab (nome comercial: Herceptin) contra o receptor HER2 /neu no cancro da mama tratamento , e cetuximab (nome comercial: Erbitux) contra o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) em cancro colorectal, cabeça e pescoço metastáticos, têm sido desenvolvidos e são utilizados quer como um agente único ou em combinação com outras drogas e radiação para terapia do cancro [4 ] – [12]

em 1990, um

in vitro

processo de selecção chamada evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) foi desenvolvido para rastrear moléculas de ácido nucleico de cadeia simples de associação aleatória de. biblioteca contra o ligando-alvo [13], [14]. Estas classes de moléculas em cadeia simples são referidos como aptâmeros “”. Eles possuem elevada afinidade de ligação e especificidade que são comparáveis ​​aos anticorpos monoclonais. Além disso, o pequeno tamanho, não imunogenicidade e facilidade de alteração em comparação com o anticorpo monoclonal convencional faz aptâmeros atraentes para aplicação terapêutica [15]. Com base nos resultados promissores em estudos pré-clínicos, dois aptâmeros cancro de segmentação, o ACT-GRO-777 (ou AS1411) – um aptâmeros de ADN rico em G segmentação nucleolina para o tratamento de leucemia mielóide aguda (LMA) e de NOX-A12 L-ARN aptâmero segmentação CXCL12 para o tratamento de mieloma múltiplo e linfoma já estão em ensaios clínicos [16], [17].

Um problema principal que surge na aplicação terapêutica de aptâmeros é a sua instabilidade em

in vitro

e

in vivo

condições [18]. Eles são susceptíveis ao ataque por nucleases enzimática nos fluidos celulares e séricos. Para contornar este problema, várias estratégias de modificação química têm sido empregues para aumentar a sua resistência contra nucleases e para prolongar a sua meia-vida de circulação nos fluidos biológicos. Tais modificações químicas incluem a incorporação de ligações fosforotioato (PS-relações) ou ácidos nucleicos bloqueados (LNA), a adição de grupos funcionais, tais como amino (-NH

2), fluoro (-F),

O

metil (-OCH

3) na posição 2 ‘da ribose, e a conjugação de polietileno-glicol de massa molecular elevado (PEG) ou o colesterol [19] – [25]. Estudos demonstraram que, em comparação com a versão não modificada, os aptâmeros quimicamente modificadas exibem não só uma vida mais longa no meio biológico, mas a afinidade e especificidade de ligação, por vezes, também melhor aos seus alvos [21], [26].

VEGF é um mitogénio angiogénico fundamental sobre-expressos nas células tumorais e provoca a sua migração, proliferação excessiva, invasão e metabolismo no interior do corpo. O VEGF é considerada como sendo a proteína de marca para a angiogénese do tumor e tem sido associado com a transformação neoplásica de células no interior do corpo [27]. É geralmente pensado para ser secretada pelas células endoteliais para estimular a sua proliferação e a migração. Os anteriores relatórios, no entanto, indicam que diferentes linhas celulares de carcinoma e mesotelioma maligno também secretam esta proteína [28] – [31]. VEGF

165 é a isoforma pré-dominante do VEGF-A proteína, um dos membros da família VEGF, e em primeiro lugar liga-se os seus dois receptores de tirosina-quinase VEGFR-1 /Flt-1 e VEGFR-2 /KDR /Flk -1 com afinidade muito elevada e a Neuropilinas co-receptores específicos [27]. A sinalização mitogénica e a proliferação de células em células de tumor é induzida por expressão de VEGFR-2, [33] [32]. Em contraste, a activação de VEGFR-1 resulta na invasão celular e migração celular mas não a proliferação celular [34] – [36].

No nosso estudo anterior, um ADN aptâmero 26-mer contra o domínio de ligação a heparina (HBD ) de VEGF

proteína de 165 (referido como SL

2-B) foi obtido utilizando a estratégia do truncamento haste-laçada [37]. Em comparação com o aptâmero untruncated original, o SL

2-B aptâmero exibiram aumento de mais de 200 vezes na afinidade de ligação ao VEGF

165 proteína. Aqui, foi modificada a SL

aptâmero 2-B através da incorporação de ligações fosforotioato (PS), testaram a sua afinidade, especificidade, bioestabilidade, estrutura secundária de ligação e a viabilidade potencial do SL PS-modificado

2-B aptâmero quanto antagonista sobre a actividade de proliferação de células cancerosas. Demonstrou-se que, em comparação com não modificado SL

2-B aptâmero, o SL PS-modificado

2-B aptâmero é uma sequência de melhoria em termos de estabilidade no soro e a actividade antiproliferativa sem sacrificar a afinidade de ligação e especificidade para com o VEGF

165 proteínas.

Materiais e Métodos

Materiais

O oligonucleótido purificado HPLC (ambos não modificada e PS-modificado) foi adquirida da Sigma-Aldrich. O VEGF humano recombinante portador livre

165 (peso molecular de 38 kDa, pi = 8,25) e VEGF

121 (peso molecular de 28 kDa, pI = 6,4) as proteínas foram adquiridos a partir de R D systems. CM5 chips sensores foram adquiridos da GE Healthcare para imobilização de proteínas. [3-dimetilaminopropil] cloridrato (EDC), 1-etil-3-, N-hidroxissuccinimida (NHS), e etanolamina-HCl foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Acetato de sódio (anidro) foi adquirido da Fluka. Tween-20 foi adquirido a Corporação USB. A acrilamida /bis-acrilamida (30%) e Triton X-100 foram adquiridos de Bio-Rad. dodecilsulfato de sódio (SDS), tampão fosfato salino (PBS), e hidróxido de sódio (NaOH) foram adquiridos a partir de 1

r Base. linha de células humanas carcinoma hepatocelular (Hep G2) foi um presente do laboratório do Dr. Tong Yen Wah, que foi comprado de ATCC. adenocarcinoma da mama humano linha celular (MCF-7) e linha celular de carcinoma colorrectal humano (HCT-116) foram adquiridos em ATCC. A câmara de hipóxia foi comprado de Billups-Rothenberg. meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) meios de comunicação, e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos dos laboratórios Caisson. Tripsina-EDTA e 1% de penicilina mistura /estreptomicina foram comprados na biotecnologia PAN. Tiazolilo brometo de tetrazólio azul (MTT, 97,5%) de persulfato de amónio (APS), ureia e N, N, N ‘, N’-metileno-bis-acrilamida (TEMED, 99%), e tampão tris nadeoxycholate foram adquiridos da Sigma-Aldrich . anticorpo anti-humano Jagged-1 f luoresceina monoclonal foi adquirido a R D systems. anticorpo monoclonal de coelho Jagged-1 (28H8) foi adquirido a partir de sinalização celular. rato purificada de anticorpos anti-calnexin foi comprado de laboratórios de transdução de BD. O tampão de lise e extracção RIPA (Radio-imunoprecipitação de Ensaio) tampão para Western blotting foi preparado com os seguintes reagentes: tampão RIPA (50 ml), Tris 50 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) , 0,5% Nadeoxycholate, 1% de Triton X-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Um comprimido cocktail inibidor da proteína, mini-comprimido completo (Roche Applied Science, Suíça) foi dissolvida em 10 ml do tampão para completar a preparação de tampão de lise. Polyvinyllidene (PVDF) de membrana, substrato pico de quimiluminescência molhado e filme CL-exposição foram adquiridas da Thermo Scientific. O kit de detecção de apoptose FITC anexina V foi adquirido da BD Pharmingen, Alemanha. PMSF foi comprada a Calbiochem.

Superfície Plasmon Resonance (SPR) Espectroscopia

A afinidade de ligação e especificidade de sequência de aptâmero modificado foi investigada usando espectroscopia de ressonância de plasmon de superfície (SPR), em que o VEGF

165 e VEGF

121 agiu como ligantes e foram directamente imobilizada no chip sensor. Resumidamente, o grupo carboxílico no chip sensor foi activada através de um procedimento de acoplamento de amina usando padrão preparada de fresco de EDC /NHS. VEGF

165 ou VEGF

121 (25 ug /ml) em tampão de acetato (pH 6,0) foram então injectados no chip sensor a um caudal de 8 ul /minuto para atingir aproximadamente 200 RU nível de imobilização. A desactivação foi realizada por etanolamina-HCl para bloquear os grupos carboxilo que não reagiram. A análise de ligação foi efectuada com aptâmeros modificados em diferentes concentrações (0,2 a 100 nm) usando um instrumento BIAcore 2000 (GE Healthcare). A condição de execução foi fixado em taxa de 30 ul /min de fluxo, 25 ° C, tempo de associação de 3 min e o tempo de dissociação de 5 min. PBS e Tween-20 a solução mistura foi utilizada como tampão de corrida, e NaOH a 50 mM como tampão de regeneração. Todos os tampões foram filtrados e desgaseificada antes de cada experiência. superfícies em branco foram usadas para subtracção de fundo. Após a injecção dos aptâmeros, sensorgramas gravar o comportamento de associação /dissociação do complexo VEGF-aptâmero foram recolhidos. Variando a concentração de aptâmero, uma série de diagramas sensores (Figura 1) foram obtidos e analisados ​​subsequentemente com o modelo de Langmuir 01:01 fornecida no software BIAevaluation (versão 4.1) para calcular a constante de equilíbrio de dissociação K

d. Todas as medições de SPR foram realizadas em triplicado.

nM). O ponto A para B corresponde a fase de associação e o ponto B para C corresponde à dissociação de fase em todos os sensogramas. Mostrado aqui é-PS modificado SL

2-B aptâmero (K

d = 0,56 ± 0,44 nM).

Estabilidade do SL

2-B Aptamer contra nucleases em soro contendo

médio

para testar a estabilidade do não modificado e modificado PS-SL

2-B aptâmero contra nucleases, 10 uM aptâmero foi incubada durante intervalos de tempo diferentes em meio DMEM suplementado com FBS a 10% a 37 ° C. 25 ul de amostra foi feita em diferentes pontos de tempo (0, 12, 24, 48, e 72 horas) e imediatamente armazenados a -80 ° C para minimizar a degradação desnecessária. As amostras foram então sujeitas a electroforese em gel de poliacrilamida a 12% desnaturante (PAGE). A densidade de banda foi medido quantitativamente por meio da densitometria gel e analisados ​​utilizando software ferramentas de genes de Syngene.

Dicroísmo Circular (CD) Espectroscopia

Para deduzir a estrutura do SL PS-modificado

2- B aptâmero, 10 uM de aptâmero foi dissolvido no tampão de PBS para análise de CD. O espectro de CD foi registado na gama de comprimentos de onda de 200-320 nm, a duas temperaturas diferentes de 25 ° C e 37 ° C e os dados foram a média de 10 varreduras. A análise do espectro de CD foi efectuada utilizando cuvete de comprimento de percurso de 1 cm num espectropolarímetro Jasco J-810. O tampão PBS foi usado como branco para ambas as temperaturas e os dados espectrais para o SL

2-B aptâmero foi corrigido em branco.

Ensaio de Actividade antiproliferativa

Hep G2 e células MCF-7 foram semeadas a uma densidade de 2000 células /ml e as células HCT-116 foram semeadas a uma densidade de 3000 células /ml em placas de 96 poços no dia 0 em meio DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina mistura /estreptomicina. SL

2-B aptâmero aptâmero (não modificado /PS-modificada) e mexidos foram incubadas com células em diferentes concentrações e incubadas durante 3 dias em condições de hipoxia (5% de CO

2, 1% de O

2, e 94% de N

2) no interior da câmara de hipóxia. O meio de células não foi alterada durante 3 dias. Foi adicionado n transfectar células ou agente permeabilizante. O efeito antiproliferativo do aptâmero nas células foi determinada através da medição da viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT colorimétrico. A leitura da densidade óptica foi gravado utilizando leitor de microplacas (Tecan, infinito M200) a 570 nm com subtracção de fundo a 620 nm. O experimento foi realizado em triplicado.

Microscopia imagem

O efeito antiproliferativo do SL PS-modificado

aptâmero 2-B em células Hep G2 foi avaliada usando imagens de microscopia óptica. Mesmas condições foram mantidas como para o ensaio de actividade antiproliferativa e as células foram fotografadas após 72 horas de tratamento aptâmero. Fotomicrografias foram tiradas em um T5000 Eclipse (Nikon, Japão) microscópio de luz com software de aquisição Tame2u.

Apoptosis Assay

ensaio de apoptose anexina V foi realizada para investigar o mecanismo de morte celular em células Hep G2 acordo o protocolo do fabricante. As células foram colhidas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS frio (1X) e subsequentemente corados com FITC anexina V e iodeto de propídio. A análise foi realizada na ADP Beckman-Couter Ciano ™ citômetro de fluxo através da contagem 15000 eventos.

Análise de citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi utilizado para estudar o efeito do SL PS-modificado

2 aptâmero -B na expressão da proteína Jagged-1 em células Hep G2. células Hep G2 foram semeadas a uma densidade de 80.000 células /ml em placas de 6 poços no dia 0 em meio DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina mistura /estreptomicina. Seguindo dias após a sementeira, as células foram tratadas com SL modificado

2-B aptâmero e mexidos sequência aptâmero a 15 concentração de aptâmero uM. mesmas condições de hipóxia foram mantidas como para o ensaio de actividade anti-proliferativa. Após 3 dias de tratamento aptâmero, as células foram tripsinizadas, incubadas com anticorpo Jagged-1 fluoresceína anti-humano durante 1 hora, re-suspenso em tampão PBS e analisadas imediatamente usando um Beckman-Couter ciano ADP citómetro de fluxo por análise de 15.000 eventos e relativa fluorescência foi determinada utilizando SUMMIT V 4.3.02 software.

Análise Western Blot

O efeito específico sequência de SL

aptâmero 2-B PS-modificada na expressão de proteínas Jagged-1 em Hep células G2 foi analisado utilizando transferência de western. mesmas condições experimentais foram mantidas como para a citometria de fluxo. Após 3 dias de tratamento aptâmero, o meio celular foi removido e as células foram lavadas uma vez em PBS frio 1 ×. 500 ul de tampão de lise completa foi adicionada a cada um de 6 poços e as células foram desfeitos com um raspador de células e recolhidas em tubos de microcentrífuga. As proteínas extraídas foram resolvidas num gel de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana PVDF por transferência húmida. As membranas foram bloqueadas em leite magro a 5% e lavou-se em solução salina tamponada com Tris com Tween a 1%. Subsequentemente, as membranas foram incubadas com anticorpo primário (monoclonal Jagged-1 de coelho e o anticorpo anti-calnexina rato purificada) e, em seguida, com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho e o anticorpo anti-IgG de ratinho secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP)) com 3 correspondentes etapas de lavagem no meio. As bandas de proteínas foram desenvolvidas com substrato pico de quimiluminescência oeste e visualizados no filme blue ray XPress CL. As densidades ópticas de bandas foram medidos num densitómetro GS800 e intensidades das bandas foram analisados ​​com o software Quantity One análise de imagens (Biorad, EUA).

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± DP. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo usando t de Student

Resultados e Discussão

Encadernação Análise do SL PS-modificado

2-B Aptamer e Complexo VEGF por. superfície Plasmon Resonance (SPR)

Como relatado anteriormente em nosso estudo, o SL não modificada

2-B aptâmero exibiu um K

d = 0,5 nM à heparina domínio de ligação (HBD) de VEGF

165 proteína determinada por meio de técnica SPR (Tabela 1) [37]. O aptâmero não modificado, no entanto, exibiram baixa estabilidade estrutural nas condições celulares. Isto é devido à presença de exonucleases e endonucleases em fluidos biológicos, que degradam os aptâmeros por hidrólise da ligação éster de fosfato na cadeia principal [19]. Para aliviar este problema, neste estudo, o SL

2-B aptâmero foi quimicamente modificado com fosforotioato (PS) de articulações em 5 ‘e 3’-terminal (Tabela 1) para proteger o SL

2-B aptâmero de digestão exonucleolítica. O PS-a modificação envolve a substituição de oxigénio fosforilo sem ponte na ligação fosfodiéster por um átomo de enxofre. Uma vez que o excesso de incorporação do PS-relações leva a ligação não específica e pode perturbar a conformação aptâmero e sua interação com o alvo, a modificação foi introduzida apenas em aptâmero terminais [38].

O K

valor d para SL-PS modificado

2-B aptâmero foi determinada utilizando a técnica SPR a diferentes concentrações de aptâmeros (Figura 1 e Tabela 1). O K

valor d para o SL-PS modificado

2-B verificou-se ser 0,56 nM, o que é semelhante ao K

não modificada para d SL

2-B. Apresentando-PS modificação não parece afectar a afinidade de ligação do SL

2-B aptâmero. Além disso, a afinidade do PS-modificado SL

2-B é semelhante ao o FDA aprovou humanizado anti-VEGF do anticorpo monoclonal “Bevacizumab” (K

d ~ 0,5 nM) utilizada para o tratamento do cancro [4].

Especificidade de SL-PS modificado

2-B Aptâmero Sequência

VEGF

165, bem como outras isoformas de VEGF, tais como VEGF

189 e VEGF

206, são gerados a partir de splicing de um único gene VEGF que partilha um domínio de ligação a heparina carboxi-terminal (HBD) de 50-resíduos e se liga à heparina com diferentes afinidades de ligação [27], [39], [40]. HBD é responsável por aumentar a interacção do VEGF com os seus receptores (VEGFR-1 /Flt-1 e VEGFR-2 /KDR /Flk-1) e o Neuropilinas co-receptores específicos para provocar a resposta angiogénica em células malignas [41].

VEGF

121, no entanto, não partilha o HBD como outras isoformas de VEGF e pode ser usado como um controlo para a especificidade de ligação HBD estudo. O sensorgrama SPR na Figura 2 mostra que, em comparação com o VEGF

165 de proteína na mesma concentração de aptâmero (80 nM), o sinal de resposta de SL PS-modificado

2-B de ligação ao VEGF

121 proteína era fraco e exibido um alto K valor

d de 17? M. Isto indica que a modificação PS não reduzir a especificidade de ligação de SL aptâmero

2-B em direcção a HBD significativamente (K

d = 17 uM para SL PS-modificado

2-B em direcção a VEGF

121, K

d = 10 uM para não modificado SL

2-B em direcção a VEGF

121). Em comparação com o anticorpo monoclonal “bevacizumab” que se liga a todas as isoformas de VEGF, o SL-PS modificado

2-B é específico para HBD do VEGF

165 proteína [4]. Uma vez que o VEGF-A está envolvida em processos fisiológicos normais, tais como a formação de novos vasos sanguíneos e do processo de cicatrização de feridas, a inibição completa da proteína VEGF pode afectar a manutenção do sistema vascular normal no interior do corpo [42], [43]. Por conseguinte, a inibição da proteína de VEGF específico (por exemplo, VEGF

165 neste caso) pode ser uma melhor abordagem terapêutica.

O ponto A para B corresponde a fase de associação e o ponto B para C corresponde à dissociação fase em ambos os diagramas sensores. Mostrado aqui é-PS modificado SL

2-B de ligação com VEGF aptamer

proteína 165 (K

D = 0,56 ± 0,44 nm) e VEGF

proteína 121 (K

d = 17 ± 1,24 mM) a 80 concentração de aptâmero nM.

Estabilidade do SL

2-B aptamer contra nucleases em meio contendo soro

Para testar a bioestabilidade da modificado e PS- SL modificado

2-B aptâmero contra nucleases presentes nos fluidos biológicos, ambos os aptâmeros foram incubadas com FBS a 10% para diferentes períodos de tempo. Com base nos resultados, o SL não modificada

2-B degradada em 50% dentro de 24 horas de incubação em soro (Figura 3). Por outro lado, o SL-PS modificado

2-B mostrou boa estabilidade, com mais de 90% aptâmero intacto depois de 72 horas de incubação no soro. Os dados demonstram a importância de PS-ligações na SL

2-B Termini sequência, que protege a sequência de aptâmero de ataque da exonuclease.

aptâmeros foram incubadas com FBS a 10% dissolvido em meio DMEM a 37 ° C durante diferentes pontos de tempo e percentagem de aptâmero intacta foi determinada medindo a densidade da banda após a execução PAGE desnaturante. colunas cheias são PS-modificado SL

2-B, enquanto colunas abertas são não modificada SL

2-B.

Análise Estrutural por Dicroísmo Circular (CD) Espectroscopia

estudos estruturais demonstraram o impacto da conformação na afinidade de ligação e especificidade do aptâmero para o seu alvo [44]. Se as mudanças de conformação com a temperatura, em seguida, os resultados obtidos a partir de afinidade de ligação a espectroscopia SPR (conduzida a 25 ° C) não pode ser representativo em

in vitro (ensaios de

realizadas a 37 ° C). Assim, a conformação secundária do SL

2-B PS-aptâmero modificado foi investigada. picos máximos positivas foram observadas a 260 nm e 220 nm, bem como um pico negativo mínimos a 240 nm e ombros pequeno pico adicional a 290 nm (Figura 4). Com base nos relatórios anteriores, esses espectros refletem uma típica hairpin haste-laço conformação [45]. Uma vez que não foi observada alteração no espectro de entre 25 ° C e 37 ° C, isto confirma a preservação da conformação secundária nas condições SPR (25 ° C), onde o K

foi determinada d do aptâmero e em condições fisiológicas (37 ° C). No entanto, a espectroscopia de CD não fornece a informação completa e validada na estrutura. As técnicas avançadas, tais como ressonância magnética nuclear (RMN) e cristalografia de raios-X são necessários para a análise estrutural mais aprofundada.

uM PS-modificado SL

aptâmero 2-B em solução salina de tampão fosfato (PBS) tampão, pH 7,2. Os espectros foram medidos a 25 ° C (linha sólida) e 37 ° C (linha pontilhada).

antiproliferativa Ensaio de Actividade

A propriedade antiproliferativa de SL

2-B aptâmero foi estudada utilizando células cancerosas Hep G2 em condições de hipoxia. Estudos anteriores demonstraram que a expressão da proteína de VEGF é potenciada em células Hep G2 em condições de hipoxia [46]. Uma vez que nenhum efeito significativo na proliferação de células foi observada às 24 e 48 horas, tanto a SL não modificado e PS-modificado

aptâmeros 2-B foram testadas durante 72 horas de duração. Como mostrado na Figura 5, a proliferação celular foi inferior observada a 15? M modificados SL

2-B concentração após 72 horas de tratamento aptâmero (52 ± 2,1%). No entanto, nenhum decréscimo na proliferação celular foi observada na concentração de aptâmero aumentando ainda mais a 20 uM. Uma possível explicação para o decréscimo na proliferação celular poderia ser que, ou a ligação excesso de modificada SL

Sequência 2-B para o VEGF

165 proteínas, em última análise previne a interacção da proteína para o VEGFR-2 (ou KDR /Flk -1) do receptor, o que afecta a proliferação celular. Ou aptâmero após a ligação com a proteína de VEGF se liga com VEGFR-2, é submetido a internalização celular e interfere com a jusante de VEGF ligado vias de sinalização intracelulares. O resultado também indica que a proteína VEGF pode estar envolvida na proliferação de células cancerosas Hep G2, em condições de hipóxia. Pelo contrário, o SL

sequência aptâmero 2-B não modificado não exibiam actividade inibidora significativa da proliferação celular. Isto pode ser devido à degradação da sequência não modificada por enzimas de nucleases no suporte antes pronunciando o seu efeito sobre as células cancerosas.

A especificidade da sequência foi determinada utilizando uma sequência mexidos para SL-PS modificado

2- B para cada ponto de dados na mesma concentração para o SL modificado

2-B. linha sólida é PS-modificado SL

2-B, linha tracejada não foi modificado SL

2-B e linha pontilhada está embaralhada sequência.

Para demonstrar que o efeito antiproliferativo do PS -Modified SL

2-B é aptâmero sequência específica, de uma sequência mexidos foi adicionado às células Hep G2 na mesma concentração que o PS-SL modificado

2-B (Figura 5). Os resultados mostraram diminuição mínimo sobre a proliferação de células com a sequência mexidos, confirmando que o efeito inibidor sobre a actividade da proteína de VEGF

165 por SL-PS modificado

2-B foi de sequência específica em células Hep G2. A inibição específica de sequência também foi confirmada pela contagem das células e as diferenças morfológicas nas fotomicrografias apresentadas (Figura 6). Como mostrado na Figura 6A e 6B, as células tratadas com sequência modificada tem visivelmente menor número de células em comparação com a sequência mexidos, onde parece haver mais células por visualização e embalado estreitamente um ao outro. Além disso, sob a mesma ampliação, a morfologia das células tratadas com a sequência modificada parece ser mais longo e mais fina com muitas projecções laterais, em comparação com a sequência codificada, que são mais e mais angular definida de forma (Figura 6C e 6D). Estes resultados indicam o potencial da SL-PS modificado

sequência aptâmero 2-B na inibição da Hep G2 proliferação células cancerosas fortemente e especificamente.

Baixo, ampliação de (A) o tratamento sequência modificada, (B ) mexidos tratamento sequência em células Hep G2, após 72 horas sob condições de hipóxia. Barra de escala = 200 pm. Feche acima da vista de (C) tratamento sequência modificada, (D) mexidos tratamento sequência em células Hep G2, após 72 horas sob condição de hipóxia. morfologia celular difere sobre os diferentes tratamentos; tratamento sequência modificada produz células que são mais finos com saliências mais celular enquanto que o tratamento sequência mexidos mostra células que aparecem mais perto às células Hep G2 não tratados. Barra de escala = 50 uM.

Para determinar o mecanismo de morte celular em células Hep G2, ensaio de apoptose anexina V foi realizada e analisada por citometria de fluxo. Na Figura 7A, as células quadrante R9 e R11 em conjunto disperso de citometria de fluxo foram contadas e expressas como percentagem de células em fase de apoptose tardia e precoce, respectivamente. No início células em apoptose incluem população de células que é anexina V positiva somente (R11), e células apoptóticas tardias incluem população de células que é tanto anexina V e PI positivo (R9). O ensaio de apoptose mostraram aumento da percentagem de morte celular com a sequência modificada em comparação com a sequência de tratamento mexidos em fase de apoptose tardia (Figura 7B, p-valor 0,05). No entanto, a percentagem de células que sofrem apoptose tarde não era muito alta e não se observou qualquer diferença significativa na contagem celular entre sequência modificada e mexidos em fase de apoptose precoce (Figura 7C). Este resultado indica que, para além da apoptose, outro mecanismo de morte de células não apoptóticas tais como senescência podem estar envolvidos na indução de morte celular nas células Hep G2.

(A) O gráfico de dispersão que descreve a distribuição de células com anexina V coloração ao longo do eixo-X e os corados com iodeto de propídio (PI) ao longo do eixo y. Região R10 denota a população viável (negativo duplo para anexina V e PI), R9 as células não viáveis ​​(double positivo para anexina V e PI), R11 mostra a anexina V positiva (PI negativo) população, enquanto R8 são as células danificadas ( PI positivo, mas anexina-V negativo). (B)% histograma dos dados de quadrante R9. A análise das amostras em triplicado para mostrou uma significativamente maior quantidade de células mortas (p-valor 0,05) no tratamento sequência modificada em comparação com o controlo de sequência mexidos. (C)% do histograma dos dados de quadrante R11. Os resultados não mostram nenhuma diferença significativa de apoptose precoce. As barras de erro = SEM.

Para confirmar a capacidade antiproliferativa do SL PS-modificado

2-B aptâmero, investigamos ainda mais o efeito com células MCF-7 e HCT-116 células, uma vez existente literatura demonstrou que eles também sobre-expressar a proteína de VEGF em condições de hipoxia [47], [48]. A 15 uM modificado SL concentração

2-B foi utilizado neste estudo, mas os nossos resultados mostraram que ambas as células MCF-7 e HCT-116 de cancro exibida apenas 23 ± 3.2% e 9 ± 1,8% de diminuição na proliferação de células foi observada respectivamente . Com base nestes resultados de proliferação de células, o efeito de SL-PS modificado é acreditado

Sequência 2-B sobre a proliferação celular como sendo do tipo de célula específico. Desde efeito anti-proliferativa em células MCF-7 e células cancerosas HCT-116 não eram muito substancial, eles não foram utilizados para estudos posteriores abaixo. estudos antiproliferativa adicionais em vários tipos de células de câncer devem ser realizados para descobrir os potenciais alvos terapêuticos e identificar os fatores responsáveis ​​pela atividade antiproliferativa específica de células deste aptâmero.

Citometria de Fluxo e Western Blot Análise de Jagged-1 Expressão de Proteína

sinalização Notch é uma via de sinalização conservada evolutiva que afeta muitos processos celulares como a determinação de células-destino, a diferenciação, proliferação e sobrevivência. Cinco ligantes Notch (Jagged-1, Jagged-2, Delta-1, Delta-3, e Delta-4) e quatro receptores Notch foram bem estabelecida em mamíferos [49], [50]. As evidências indicam a ligação bioquímica entre VEGF e delta /irregular-notch vias de ativação e, juntos, ambos estão envolvidos na promoção da progressão do tumor [51], [52]. Nesta ligação, o VEGF via é essencial para a iniciação da angiogénese tumoral e actua como o estímulo de activação a montante, enquanto que a sinalização entalhe que actua sobre a jusante da via VEGF, ajuda a responder a activação de estímulo e moldar a activação pela tomada de decisões destino celular [ ,,,0],49].