Abstract

O cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte devido à sua metástases para órgãos distantes. Examinamos o efeito do honokiol, um componente bioativo do

Magnolia

planta, no cancro do pulmão de células não pequenas humano migração (NSCLC) celular e os mecanismos moleculares subjacentes a este efeito. Usando um

In vitro

ensaio de migração de células, observou-se que o tratamento de A549, células H1299, H460 e H226 com NSCLC honokiol resultou na inibição de migração destas células de um modo dependente da dose, o que foi associado com um redução nos níveis de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e prostaglandina e

2 (PGE

2). O celecoxib, um inibidor de COX-2, também inibiram a migração de células. Honokiol inibida PGE

2-aumentado de migração de células NSCLC, inibiram a activação de NF-kB /p65, um regulador a montante da COX-2, em células A549 e H1299, e o tratamento das células com éster de fenetilo ácido cafeico, um inibidor de NF-kB, também inibiram a migração de células NSCLC. PGE

2 foi mostrado para activar a sinalização β-catenina, o que contribui para a migração de células de cancro. Portanto, nós verificamos o efeito de honokiol sobre a sinalização β-catenina. Observou-se que o tratamento de células NSCLC com honokiol degradada citosólica β-catenina, reduzida acumulação nuclear de β-catenina e sub-regulada metaloproteinase de matriz (MMP) -2 e MMP-9, que são os alvos a jusante de β-catenina e desempenham um papel crucial na metástase de células de cancro. Honokiol melhorada: (i) os níveis de caseína quinase-1α, glicogénio sintase quinase-3β, e (ii) a fosforilação de β-catenina em resíduos críticos Ser

45, Ser

33/37 e Thr

41. Estes eventos desempenham papéis importantes na degradação ou inactivação de β-catenina. Tratamento de celecoxib também reduzida acumulação nuclear de β-catenina em células NSCLC. FH535, um inibidor da via Wnt /β-catenina, inibiu PGE

migração celular de A549 e células H1299-2 aumentada. Estes resultados indicam que honokiol inibe pulmão de não pequenas células células cancerosas migração, visando a ativação PGE

2 mediada por sinalização de β-catenina

Citação:. Singh T, Katiyar SK (2013) honokiol inibe Não- Pequeno Cell Migration Cell Lung Cancer alvejando PGE

2-Mediated Ativação de β-catenina Sinalização. PLoS ONE 8 (4): e60749. doi: 10.1371 /journal.pone.0060749

editor: Xianglin Shi, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de janeiro de 2013; Aceito: 02 de março de 2013; Publicação: 08 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Singh, Katiyar. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado financeiramente pela Administração de veteranos Mérito Prêmio Review (1I01BX001410-01, SKK). As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o cancro do pulmão é responsável por mais mortes em os EUA a cada ano do que mama, cólon e próstata combinados, e, portanto, tem um tremendo impacto sobre as despesas de saúde e de cuidados de saúde humanos [1]. Um em cada três mortes relacionadas com o cancro é atribuível ao câncer de pulmão, e não tem qualquer melhoria ao longo dos últimos 30 anos [2], [3]. cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) é responsável por aproximadamente 80% de todos os tipos de câncer de pulmão e inclui o adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células [4], [5]. A ciclo-oxigenase-2 (COX-2) é constitutivamente frequentemente regulados positivamente em diferentes malignidades humanas, incluindo cancros do pulmão [6] – [10]. Embora várias alterações genéticas são necessárias para o risco de cancro do pulmão e do seu desenvolvimento, COX-2 é considerado como um elemento central na orquestração da carcinogênese de pulmão. A COX-2 é uma enzima induzível e gera prostaglandinas (PGs) sobre a sua acção sobre o ácido araquidónico. Entre os PGs, PGE

2 é considerado o mais eficaz metabolito ou mediador inflamatório que é pensada para desempenhar um papel central no crescimento do cancro, progressão, metástase e invasão. Os estudos em cancro do cólon, onde a COX-2 é sobre-expressa de forma espontânea, revelou uma ligação entre a COX-2 /PGE

2 e β-catenina de sinalização que contribui para o crescimento do cancro do cólon [11]. Smith et al [12] demonstraram que a radiação ultravioleta induzida por expressão da COX-2 e PGE

2 resultados de produção na activação aumentada de sinalização β-catenina. Existem relatórios que sugerem que a COX-2 /PGE

2 eixo /β-catenina ou ligação está associado com a metástase do cancro pulmonar [13]. β-catenina é um kD de proteína citosólica e actua como 90 um componente fundamental da via de Wnt. Na ausência de Wnt ligandos, β-catenina é recrutado para o complexo de fosforilação /destruição, que contém o supressor de tumor, polipose adenomatosa coli (APC) e Axin. O complexo de destruição facilita a fosforilação de β-catenina por glicogénio sintase quinase 3β e caseína quinase (CK1) que conduz à degradação de proteossómica β-catenina. Se β-catenina não é fosforilada em seguida, no terminal-N não-fosforilado β-catenina se acumula no citosol, que entra no núcleo e interage com os factores de transcrição, tais como o factor de células-T, para activar a transcrição de genes alvo, que estão associados com a sobrevivência da célula , proliferação e metástase [14] – [16]. Desde então, o câncer de pulmão é um câncer altamente maligno, com uma capacidade potente de metástase distante e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer, uma abordagem que reduz a sua capacidade metastática pode facilitar o desenvolvimento de uma estratégia eficaz para o seu tratamento e /ou prevenção.

fitoquímicos de valores terapêuticos oferecer opções promissoras para o desenvolvimento de estratégias eficazes para a prevenção da migração de células de tumor, invasão e metástase. Honokiol (C

18H

18O

2, Figura 1A) é um componente bioativo promissora da casca de

Magnolia

plantas que tem sido usado na medicina tradicional japonesa para o tratamento de algumas doenças devido à sua antitrombótico, anti-depressivo e as propriedades anti-bacterianas [17]. Os efeitos anti-cancerígenos dos honokiol foram investigadas em uma variedade de linhas de células de cancro, bem como em alguns modelos de tumor e exibem nenhuma toxicidade aparente

In vivo

[18] – [25]. Os nossos estudos também mostraram que honokiol exerce efeitos quimiopreventivos em cancro da pele induzida por ultravioleta radiação e que este efeito está relacionado com os seus mediadores inflamatórios, tais como a segmentação de COX-2 e PGE

2 [25]. No entanto, pouco se sabe a respeito de se alvos honokiol invasão ou potencial metastático de células de câncer de pulmão. Como o câncer de pulmão é altamente metastático, buscou-se determinar o efeito quimioterápico de honokiol na migração de células do cancro do pulmão ou de invasão usando várias linhas celulares de cancro do pulmão como um

in vitro

modelo. No presente comunicação, que exploraram os efeitos quimioterapêuticos de honokiol na migração potencial /invasivo de células NSCLC humanas e determinar se efeito inibitório de honokiol sobre a migração celular está associado com a inactivação da sinalização β-catenina e se PGE

2 tem qualquer papel neste processo. Para este fim, foram seleccionados quatro linhas celulares de NSCLC diferentes: A549, H1299, H460 e H226. brônquica linha celular epitelial humana normal (BEAS-2B) foi utilizada como um controlo. Aqui, apresentamos evidências de que honokiol inibe o potencial invasivo de linhas celulares de NSCLC, visando a ativação PGE

2 mediada por sinalização de β-catenina.

(A) Estrutura molecular da honokiol, um fitoquímico bioativo do

Magnolia

planta. (B) O potencial de migração de células de várias linhas celulares de NSCLC foi determinada utilizando um ensaio de câmara de Boyden. Números iguais de células cancerosas foram carregados na câmara superior das câmaras de Boyden, incubou-se durante 24 h, e as células migratórias foram detectados na membrana após coloração com violeta de cristal. (C) As células foram contadas migradoras e os resultados são expressos como o número médio de células migratórias ± SD /campo microscópico seleccionado, n = 3, a ampliação:. × 10

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

honokiol purificada foi adquirida da Qualidade fitoquímicos, LLC (Edison, NJ). Boyden Chambers e membranas de policarbonato (tamanho de poro de 8 um) para os ensaios de migração de células foram obtidas a partir de Neuroprobe (Gaithersburg, MD). Os anticorpos específicos para β-catenina foram adquiridos a partir de R D Biosystems (Minneapolis, MN), o celecoxib, PGE

2 eram da Sigma Chemical Company, um kit de imunoensaio enzimático para a PGE

2 A análise foi obtido a partir de Cayman Chemicals ( Ann Arbor, MI), enquanto que os anticorpos para fosfo β-catenina, CK1α, a GSK-3β, da metaloproteinase de matriz (MMP) -2, MMP-9, a COX-2, NF-kB, IKKα, IκBα e β-actina foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticorpos secundários (coelho anti-cabra e cabra anti-coelho) conjugado com peroxidase de rábano foram adquiridos de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).

linhas celulares e Cultura celular

linhagens de células NSCLC , A549, H460, H226 e H1299, e a linha celular BEAS-2B foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas linhas de células foram mantidas e cultivadas tal como descrito anteriormente [26]. Honokiol foi dissolvido num pequeno volume de álcool etílico, o qual foi adicionado ao meio de cultura celular completo quando as células foram sub-confluentes (60-70% confluente). A concentração máxima de álcool etílico não era mais do que 0,02% (v /v) no meio de cultura. As células tratadas com álcool etílico (0,02%, v /v) apenas serviu como um controlo de veículo, tal como utilizado anteriormente [27].

invasão celular Ensaio

A capacidade de invasão de células NSCLC foi determinada

in vitro

usando Boyden Chambers (Gaithersburg, MD), como descrito anteriormente [26], [27]. As células que migram na superfície das membranas foram examinadas microscopicamente e invasão celular foi determinada por contagem das células migratórias /invasivos em, pelo menos, 4-5 campos seleccionados aleatoriamente, utilizando um microscópio Olympus BX41 e fotomicrografias foram obtidas usando um sistema de câmara digital Qcolor5 montado este microscópio. Cada experiência foi repetida duas ou três vezes e os dados a invasão de células resultantes são apresentados em termos do número médio de células que migram invasivos ou ± DP campo /microscópica (ampliação, x 10).

cicatrização de feridas ou arranhões Ensaio

ensaio de cicatrização de feridas foi realizada para examinar a capacidade de migração de células NSCLC, tal como descrito anteriormente [28]. Resumidamente, as células NSCLC foram cultivadas até à confluência completa em placas de seis poços e incubadas durante a noite em meio de inanição. monocamada celular foi riscada com uma ponta de pipeta estéril fino e lavou-se com meio para remover as células destacadas das placas. As células foram mantidas numa incubadora com ou sem tratamento com honokiol em meio de cultura completo durante 36 h. Após 36 h, o meio foi substituído com tampão de PBS. A lacuna ferida foi observado sob Olympus BX41 microscópio e as células foram fotografados usando uma câmera digital Qcolor5.

Viabilidade Celular Ensaio

O efeito da honokiol na capacidade proliferativa ou a viabilidade celular da brônquica humano normal células epiteliais e células NSCLC foi determinada utilizando o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito anteriormente [26].

a prostaglandina e

2 Immunoassay

Cayman PGE

2 ENZIMAIMUNOENSAIO Kit (Ann Arbor, MI) foi utilizado para medir os níveis de PGE

2 em homogeneizados de células seguindo as instruções do fabricante, como também descrito anteriormente [27] .

NF-kB /p65 Ensaio de actividade

a atividade /p65 NF-kB foi determinada utilizando o NF-kB Trans

AM Activity Assay Kit (Ativo Motif, Carlsbad, CA) seguindo o protocolo do fabricante, e também descrito anteriormente [27]. Os resultados sobre a actividade /p65 de NF-kB em células são expressos como a percentagem da densidade óptica do grupo de controlo não-tratadas com honokiol.

COX-2 pequeno ARN interferente (siRNA) Transfecção de células NSCLC

linhas de células A549 e H1299 foram transfectadas com ARNsi de COX-2 específicos de humano utilizando o Kit de siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc .; Santa Cruz, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 2 × 10

5 células /poço foram semeadas numa placa de 6 poços e deixou-se crescer até 70% de confluência. A mistura de COX-2 de siRNA com reagentes de transfecção foi revestida sobre as células durante cerca de 6 h numa câmara de incubação e transferidos para meio 2 × crescimento durante cerca de 20 h. Às 24 h pós-transfecção, foi adicionado meio fresco e as células foram incubadas durante um período adicional de 48 h tal como descrito anteriormente [29]. Em seguida, as células foram colhidos e sujeitos ao ensaio de migração celular. O knockdown de COX-2 em células A549 e H1299 após transfecção foi verificada como descrito anteriormente [29].

Análise Western Blot

células NSCLC foram tratados com ou sem honokiol ou outros agentes de interesse para o período de tempo desejado, depois as células foram colhidas e lisadas com tampão de lise arrefecido em gelo suplementado com inibidores de protease, como descrito anteriormente [26], [30]. As proteínas foram resolvidas por electroforese em geles de 8-10% de Tris-glicina e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos, a membrana foi incubada com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. As membranas foram lavadas e depois incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase e as bandas de proteínas específicas foram detectadas usando os reagentes de quimioluminescência aumentada. Para verificar o carregamento igual de proteínas nos geles, a membrana foi despida e sondado com anticorpo anti-histona H3, quer anti-actina ou β.

Análise estatística

Para os ensaios de migração celular, os dados no grupo de controle foram comparados com honokiol-, PGE

2 ou grupos celecoxib-tratamento separadamente usando one-way análise de variância (ANOVA), utilizando GraphPad Prism versão 4.00 para o software do Windows (GraphPad software, San Diego, Califórnia. www. graphpad.com.). Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± DP. Em cada caso,

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Análise Comparativa do potencial invasivo de células NSCLC humano

Em primeiro lugar, determinado o potencial invasivo comparativo de diferentes linhas celulares de NSCLC, tais como A549, H1299, H460 e H226, utilizando um ensaio de câmara de Boyden. A incubação das células NSCLC durante 24 horas em câmara de Boyden resultou num maior número de migração de células, que reflecte a sua capacidade de invasão. fotomicrografias representativas de células coradas com violeta de cristal são apresentadas na Figura 1B. células migratórias ou invasivos foram contados sob o microscópio, e os dados resultantes são apresentados em termos do número médio de células invasivas ± DP campo /microscópica (ampliação, x 10) (Figura 1C). Como mostrado na Figura 1C, a capacidade de invasão de células foi quase idêntico, excepto que o potencial invasivo de células H226 foi relativamente mais baixa do que outras linhas celulares. Sob condições idênticas, o potencial de migração de células epiteliais brônquicas humanas normais foi significativamente menor do que as células NSCLS (dados não mostrados).

Migração de Células Honokiol Inibe de Células NSCLC humano

O efeito de honokiol estava determinada na migração celular ou o potencial invasivo de A549, H1299, H460 e H226 linhas celulares de NSCLC humana utilizando ensaios de migração de células de câmara de Boyden. Inicialmente, numa experiência de rastreio foi realizado para determinar os efeitos de concentrações mais baixas de honokiol (mM). Como mostrado na Figura 2A, em relação ao não-honokiol-tratadas células de controlo, o tratamento de células com honokiol em concentrações de 0, 5, 10 e 20 uM, durante 24 h reduziu o potencial invasivo destas células cancerosas de uma maneira dependente da concentração. A densidade das células que migram na membrana após coloração com violeta de cristal é mostrado na Figura 2A, e os números de migração de células /campo microscópico estão resumidos na Figura 2B. A migração das células foi inibido em 38 a 66% (

P

0,01-0,001) em células A549, por 37-62% (

P

0,01-0,001) em células H1299 , 12-58% (

P

0,05-0,001) em células H460 e 32-69% (

P

0,05-0,001) em células H226 em uma maneira dependente da concentração após tratamento com honokiol (Figura 2B). Observou-se comparativamente maior efeito inibidor da honokiol sobre a migração celular no ponto de tempo de 48 horas (dados não mostrados)

.

(A) O tratamento de células NSCLC com honokiol (0, 5, 10 e 20 uM) durante 24 h inibe a migração de células de uma forma dependente da dose. (B) As células que migram foram contadas em cada grupo de tratamento e os resultados são apresentados como o número médio de células migratórias ± SD /campo, n = 3. inibição significativa na migração de células

relação

-tratadas não-honokiol grupo controle, *

P Art 0,001,

†

P

0,01;

¶

P Art 0,05. (C) a cicatrização de feridas ou zero ensaio foi realizado para avaliar o efeito de honokiol sobre a capacidade de migração de células NSCLC. As células foram incubadas com ou sem honokiol durante 36 h. Honokiol inibe a migração de células de uma forma dependente da dose, em comparação com células de controlo (tratados com não-honokiol). Control (0 h) painel indica o espaço original entre as camadas de células imediatas depois de fazer um arranhão ou ferimento. O espaço entre as linhas brancas quebradas indica o espaço em grande parte desocupado pelas células de câncer de pulmão. As fotomicrografias representativas são mostradas a partir de três experiências independentes. (D) O espaço vazio desocupada pelas células entre as camadas de células foi medido utilizando escala micro-grelha ao microscópio, e os dados são apresentados como um espaço vazio em termos de? M ± DP para cada linha celular. inibição significativa na migração de células em comparação com controlos tratados com não-honokiol, *

P

. 0,001

O efeito inibitório do honokiol na migração de células NSCLC foi ainda verificada usando uma cicatrização de feridas ensaio, como descrito no material e Métodos. Para o ensaio de cicatrização da ferida, foi determinado o efeito de honokiol sobre a migração celular em 36 h após o seu tratamento, enquanto no ensaio de câmara de Boyden foi determinado o efeito de honokiol após 24 h. Foi devido ao fato de que no ensaio de cicatrização da ferida primeiras células ligadas às placas, em seguida, iniciar a proliferar e depois iniciar a migração ou iniciar a cura das feridas. Assim, demora mais tempo. Tal como mostrado na Figura 2C, em relação às células de controlo não tratadas com honokiol, o tratamento de células com honokiol (0, 10 e 20 uM) durante 36 h reduziu a capacidade de migração de todas as linhas de células (A549, H1299, H460 e H226) utilizados neste estudo de um modo dependente da dose. A maior lacuna ou espaço entre as camadas de células ferindo depois de fazer uma ferida estava coberta pelas células NSCLC migratórias que não foram tratados com honokiol. No entanto, o espaço vazio entre as camadas de células foi menos cobertas pelas células que migram tratados com honokiol e este efeito foi dependente da dose. O ferimento ou espaço vazio entre as camadas de células é realçada por linhas quebradas (Figura 2C). Estes dados sugerem ainda que o honokiol inibiu a eficiência migratório das células NSCLC. O espaço entre as linhas brancas quebradas foi medida microscopicamente em cada grupo de tratamento. Tal como resumido na Figura 2D, o espaço vazio entre as camadas de células foi significativamente maior nas células tratadas com honokiol (

P

0,001), em comparação com células de controlo não-tratadas-honokiol. Isto mostra que o honokiol inibiu o processo de migração de células de cancro. Para verificar que a inibição da migração de células de cancro por honokiol era um efeito directo na capacidade de migração, e que não era devida a uma redução da viabilidade de células, um ensaio de MTT foi realizado utilizando células que foram tratadas de forma idêntica aos utilizados nos ensaios de migração. O tratamento de células epiteliais brônquicas humanas normais (células BEAS-2B) e com NSCLC honokiol nas concentrações de 0, 5, 10 e 20 uM teve nenhum efeito inibitório significativo sobre a viabilidade celular, como mostrado na Figura 3A.

(a) o efeito dependente da dose comparativa de honokiol sobre o potencial de proliferação de células BEAS-2B e linhas celulares de NSCLC, tal como analisado por ensaio MTT. (B) As células foram tratadas com várias concentrações de honokiol durante 24 h, e os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot para avaliar os níveis de COX-2. (C) O tratamento da A549 e as células H1299 com celecoxib, um inibidor de COX-2, durante 24 h inibe o potencial de migração de células de uma forma dependente da dose. (D) O número de células que migram foi contado na membrana e os resultados são expressos como o número médio de células migratórias ± SD /campo a partir de três experiências separadas. inibição significativa pela honokiol contra células de controlo tratadas com não-honokiol, *

P Art 0,001,

†

P Art 0,01,

¶

P

0,05. (E) Efeito do celecoxib sobre os níveis de expressão de COX-2 em células A549 e H1299. As células foram tratadas com várias concentrações de celecoxib durante 24 h, em seguida, colhidas e os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot para a medição dos níveis de COX-2. A densidade relativa das bandas de proteína em manchas foi medido utilizando um programa ImageJ desenvolvido no National Institutes of Health (https://rsb.info.nih.gov/ij) e normalizado com as bandas de p-actina. Em cada caso, grupo de controle foi atribuída uma unidade arbitrária 1.0. (F) Transfecção de células A549 e H1299 com a COX-2 de siRNA diminui significativamente a migração celular. redução significativa da migração de células versus células tratadas com siRNA controle, *

P

. 0,001

O Efeito Inibidor de Honokiol na migração celular de células NSCLC está associada à redução endógena de COX-2 expressão

Para examinar se honokiol inibe a migração de células NSCLC, visando a expressão endógena de COX-2, foram determinados os níveis de COX-2 em lisados ​​de células tratadas com e sem honokiol utilizando western blot análise. Tal como mostrado na Figura 3B, o tratamento de A549, células H1299, H460 e H226 com honokiol reduziu os níveis de expressão de COX-2 de um modo dependente da concentração, em comparação com a expressão de COX-2 em controlos não tratados. Estes resultados sugerem que a inibição da migração de células de cancro por honokiol pode estar associada com a inibição de COX-2 em células cancerosas.

O celecoxib, um selectivo de COX-2 inibidor, inibe a migração celular NSCLC

para determinar se o efeito inibidor de honokiol sobre a migração de células NSCLC é mediada através do seu efeito inibitório sobre a COX-2, um número igual de A549 e células H1299 foram submetidos ao ensaio de migração de células após o tratamento com várias concentrações de celecoxib (0, 5 , 10, 20 uM) durante 24 h. Como mostrado na Figura 3C, o tratamento das células com o celecoxib resultou numa redução dependente da dose na capacidade de migração celular destas células em comparação com os controlos não-tratados com celecoxib. Os dados sobre a migração celular estão resumidos na Figura 3D, o que sugere que o tratamento de células com o celecoxib significativamente inibida (

P

0,01-0,001) a migração de células A549 H1299 e de uma forma dependente da dose. Estes dados sugerem que a inibição de níveis constitutivos endógenos de COX-2 está associado com a inibição da migração de células NSCLC. Além disso, os níveis de COX-2 foram verificadas nos lisados ​​de células tratadas ou não tratadas com o celecoxib utilizando análise de Western blot. dados de Western blot revelou que o tratamento de células A549 e H1299 com o celecoxib durante 24 h resultou numa redução da expressão de COX-2 nestas células, como mostrado na Figura 3E.

selectivo de Cox-2 knockdown Usando siRNA leva à redução cancro da migração de células

o papel da COX-2 na migração de células foi ainda verificado utilizando siRNA knock-down da COX-2 nas células NSCLC e analisou se que conduziria à inibição da migração de células no cancro células. A transfecção das células A549 e H1299 com a COX-2 de siRNA resultou numa redução significativa da migração celular em A549 (79%,

P

0,001) e H1299 (75%,

P . 0,001) de células após 24 horas, em comparação com o controlo da migração de A549 transfectadas com ARNsi e células H1299 (Figura 3F)

Honokiol inibe a produção de PGE

2 e PGE

2-enhanced a migração celular em células de NSCLC

Como o efeito quimiopreventivo de honokiol na capacidade de migração celular de 4 linhas de células NSCLC diferentes era quase idêntico, nós selecionamos 2 linhas celulares (A549 e H1299) para estudos mais detalhados e mecanicistas. Como PGE

2 é um metabolito principal de COX-2 e tem sido implicada em COX-2 mediada por efeitos adversos, incluindo a invasão e metástases de células cancerosas; determinamos os níveis de PGE

2 nas células tratadas com honokiol usando PGE

2 kit de imunoensaio. Os nossos resultados mostraram que o tratamento de células com honokiol durante 24 h resultou numa redução significativa na produção de PGE

2 em ambos A549 (20-64%,

P

0,01-0,001) e H1299 ( 13-65%,

P

0.01-0.001), as células de uma forma (Figura 4A dose-dependente), o que sugere que a redução induzida por honokiol em PGE

2 de produção pode ser associado com um efeito inibidor do honokiol na migração celular nestas células.

(a) o tratamento de células H1299 e A549 com honokiol reduziu os níveis de PGE

2 de um modo dependente da dose. Os níveis de PGE

2 foram medidos em lisados ​​celulares usando PGE

2 kit de imunoensaio e os resultados são expressos em termos de proteína pg /mg ± DP, n = 3. Redução significativa contra as células de controlo, *

P Art 0,001,

†

P Art 0,01. (B) Tratamento de A549 e células H1299 com honokiol inibe PGE capacidade migração de células

2-reforçada. Os dados sobre a capacidade de migração de células de células estão resumidos a um número significativo de células migratórias ± SD /campo microscópico, n = 2. inibição significativa contra PGE

2 sozinho tratamento; *

P Art 0,001,

†

P

. 0,01

Em seguida, examinamos se PGE

2 aumentou a migração de células NSCLC e se honokiol inibe PGE

2 induzida pela migração de células em células NSCLC humanas. Para este fim, as células A549 e H1299 foram tratados com PGE

2 (10? M) com e sem honokiol durante 24 h e a migração de células determinadas. O

in vitro

dose de tratamento de PGE

2 foi selecionado com base em estudos anteriores [29], [31]. Verificou-se que o tratamento de células NSCLC com PGE

2 resultou num aumento significativo na migração de células (

P

0,05) em comparação com as células que não foram tratados com PGE

2 ( A Figura 4B). O tratamento de células A549 e H1299 com honokiol (10 e 20 fiM) resultou em inibição significativa (

P

0,01-,001) de PGE

2 (10 uM) a migração de células induzida por (Figura 4B) .

honokiol Inibe a NF-kB /p65 Atividade em células NSCLC: NF-kB é um importante regulador da Cancer Cell invasão /migração

NF-kB é um regulador up-stream de COX 2; Por conseguinte, verificou-se se o honokiol afecta a actividade, bem como os níveis de proteínas da família NF-kB em células NSCLC. Para este fim, novamente A549 H1299 e as células foram tratadas com honokiol (0, 5, 10 e 20 uM) durante 24 h, e em seguida as células foram colhidas e os lisados ​​nucleares e os lisados ​​celulares totais foram preparados para análise de transferência de Western. A análise por Western blot revelou que o tratamento de células com honokiol reduz a acumulação nuclear de NF-kB /p65 de um modo (Figura 5A), dependente da dose. A actividade de NF-kB /p65 também foi significativamente reduzida (

P

0,05 e

P

0,001) após o tratamento de células com honokiol (Figura 5B). Os nossos dados também revelou que o tratamento de honokiol resultou na supressão de IKKα, uma enzima responsável pela activação do NF-kB, e impediu a degradação de IκBα (Figura 5A). Para verificar ainda se NF-kB desempenha um papel na migração de células NSCLC, A549 e células H1299 foram tratados com um potente inibidor de NF-kB, foi determinado o éster do ácido cafeico fenetilo (CAPE), e a migração celular. Como mostrado na Figura 5C e 5D, o tratamento de células com cabo durante 24 h resultou numa redução dependente da dose da migração celular de A549 (42-78%,

P

0,05-0,001) e H1299 ( 41-76%,

P

0.05-0.001) células em relação a células de controlo tratadas com não-honokiol, e este efeito de Cabo foi semelhante à observada no tratamento das células com honokiol (Figuras 2A, 2B). Além disso, nós também verificado o efeito do CAPE sobre as proteínas da família NF-kB em A549 e células H1299 usando análise de western blot. Como mostrado na Figura 5E, o tratamento de células com Cabo resultou na supressão dos níveis de NF-kB /p65 e IKKα em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose.

(A) células A549 e H1299 foram tratados com concentrações variáveis ​​de honokiol durante 24 h, as células foram colhidas e as fracções citosólicas e nucleares foram sujeitos a análise de western blot. actividade /p65 de NF-kB 3. (B) A actividade de NF-kB /p65 nas fracções nucleares de células foram medidos utilizando um estojo de ensaio de actividade de NF-kB /específicas do p65, n = é expressa em termos de percentagem de não- As células de controlo tratadas com honokiol. inibição significativa

contra

controle, *

P Art 0,001,

¶

P Art 0,05. (C) O tratamento de células com capa, um inibidor de NF-kB, durante 24 h inibe a migração de células de uma forma dependente da dose. (D) Os dados sobre a migração celular estão resumidos como o número médio de migração de células ± desvio padrão por campo microscópico /grupo. inibição significativa

contra

grupo controle, *

P Art 0,001,

¶

P Art 0,05. (E) O tratamento de células com Cabo para 24 h inibe os níveis de NF-kB e IKKα como determinado usando análise de western blot.

Honokiol inibe Nuclear Acumulação de β-catenina

PGE

2 foi mostrado para activar a via de sinalização β-catenina, que tem sido implicado no crescimento de células de cancro, invasão e metástase [12], [13]. Como se descobriu que o tratamento de células NSCLC com honokiol inibe os níveis de PGE

2 e inibe a PGE

migração de células de cancro do pulmão 2-aumentada, que tem além disso, determinado se a inibição da migração de células NSCLC por honokiol também está associada com a supressão de sinalização β-catenina. Para este fim, as células A549 e H1299 foram tratados com honokiol durante 24 h, e fracções nucleares e citosólicos de lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de proteínas de sinalização β-catenina. A análise por Western blot revelou que o tratamento de células A549 e H1299 com honokiol resultou em redução dos níveis de β-catenina nuclear (Figuras 6A e 6B) de um modo dependente da dose. Desde então, a acumulação nuclear de β-catenina é inversamente correlacionada com a fosforilação em determinados resíduos chave de β-catenina (Ser

45, Ser

33, Ser

37 e Thr

41), verificamos a efeito de honokiol sobre os níveis de fosforilação β-catenina nesses locais.