foi aprovado
Abstract
anticorpo monoclonal do receptor do factor de crescimento epidérmico para o tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático que transportam DNA tipo selvagem KRAS. No entanto, estudos recentes mostraram que os pacientes com a mutação KRAS G13D podem beneficiar de terapia com anticorpos de EGFR. Neste estudo, tentou explorar se a abundância de mutação KRAS pode afectar a eficácia da terapia de anticorpos EGFR. Temos primeiro estabeleceu um método PNA-PCR que poderia calcular a porcentagem de mutação KRAS no DNA total e provou sua capacidade em 47 amostras com câncer colorretal que carregam mutações no KRAS. Em seguida, foi analisada a correlação entre a abundância de mutações KRAS e eficácia da terapia de anticorpos EGFR em outros 35 pacientes com câncer colorretal metastático. Mostrámos que o ensaio de PCR-PNA pode calcular a abundância de mutação KRAS e a percentagem de ADN mutante em células tumorais variaram muito (10,8% ~98.3%) em 47 doentes com cancro colorectal. A eficácia do anticorpo EGFR correlacionada com a abundância de mutações KRAS: na mutação KRAS grupo inferior a 30%, a taxa de controlo da doença foi de 44,4% (09/04); a taxa de grupo 30~80% de controlo da doença foi de 5,6% (1/18) e a 80% do grupo foi de 12,5% (08/01) (P = 0,038). Em resumo, nosso estudo mostrou que o método PNA-PCR poderia facilmente detectar o percentual de mutação KRAS em células tumorais e pacientes com câncer colorretal com baixa abundância de mutação KRAS pode se beneficiar de terapia de anticorpos EGFR
Citation:. Yu S, Xiao X, Lu J, Qian X, Liu B, Feng J (2013) pacientes com câncer colorretal com baixa abundância de KRAS mutação pode beneficiar de EGFR terapia com anticorpos. PLoS ONE 8 (7): e68022. doi: 10.1371 /journal.pone.0068022
editor: Ramon Andrade de Mello, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal |
Recebido: 01 de fevereiro de 2013; Aceito: 24 de maio de 2013; Publicação: 09 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho foi apoiado por Wu Fundação médica Jieping (320.6700.09050), https://www.wjpmf.org/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução anticorpo monoclonal
receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) foi aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático, sem mutações KRAS. KRAS mutações são descritas ocorre em aproximadamente 40% do cancro colorrectal e a maioria (90%) ocorre no codão 12 e 13 [1], [2]. Vários fase II e III de ensaios clínicos revelaram uma falta de resposta a terapia anti-EGFR na presença de mutações KRAS [3], [4], [5]. Esses resultados levaram a Agência Europeia de Medicamentos e da Food and Drug Administration para limitar o tratamento anti-EGFR apenas para pacientes portadores de tumores KRAS do tipo selvagem em 2009 [6].
No entanto, estudos recentes mostraram que a mutação KRAS G13D e códon 12 mutações, na verdade, não são criados iguais em prever os resultados clínicos de terapia anti-EGFR em pacientes câncer colorretal metastático (mCRC) [7], [8]. Pacientes portadores de mutação KRAS G13D ainda podia beneficiar do tratamento com cetuximab [9]. Em uma análise multivariada, pacientes com tumores mutação G13D tratados com cetuximab tiveram maior sobrevida (média de 7,6 meses versus 5,7 meses) e maior sobrevida livre de progressão (mediana, 4,0 meses versus 1,9 meses) do que outros tumores KRAS mutante [10]. Várias meta-análise também obteve resultados semelhantes [7], [11]. Fora isso, a análise dos resultados dos três ensaios mostraram que a mutação específica no KRAS códon 12 também teve impacto diferente sobre a eficácia do tratamento em pacientes com câncer colorretal e de tumores que carregam uma mutação KRAS G12D mostrou uma forte tendência a um resultado mais favorável em comparação com outro códon 12 mutações [12]. Todos estes estudos nos mostrou que nem todos os tumores KRAS mutante foram resistentes à terapia anti-EGFR. Como as pesquisas continuaram, não foi suficiente para diferenciar cerca de pacientes com estado de mutação KRAS.
Desde tumor teve grande heterogeneidade, diferentes tecidos tumorais podem também ter abundância variável de células de tumor mutante KRAS. Uma vez que cada método de rastreio teve a sua sensibilidade de detecção, quando o tumor proporção de KRAS mutação reduzido a um certo ponto, esta amostra de tumor pode ser reconhecido como KRAS tipo selvagem. À medida que mais e mais altamente sensíveis métodos de rastreio são estabelecidas, mais espécimes tumorais serão classificados como KRAS os mutantes [13], [14]. Nós ainda não sabemos se estas amostras serão resistentes à terapia EGFR-anticorpo. Neste estudo, a hipótese de a abundância de mutação KRAS pode também afectar a eficiência do tratamento com anti-EGFR. Na verdade, semelhante com a nossa hipótese, em 2011, Zhou et al descobriram que alta abundância de mutações EGFR teve maior resposta objetiva do que baixa abundância no cancro do pulmão de não-pequenas células tratados com gefitinib [15].
Em nossa ex estudo, foi estabelecido um método de PNA-PCR (nucleicos peptídicos ácidos-PCR), que podem suprimir a amplificação de ADN KRAS tipo selvagem. Neste estudo, nós primeira modificado este método PNA-PCR para se certificar de que ele poderia amplificação totalmente suprimir de KRAS DNA de tipo selvagem e confirmou a sua capacidade de supressão em 47 amostras de tumores que carregam mutações no KRAS. Em seguida, quantificada e calculada a percentagem de ADN mutante KRAS em tecidos tumorais e descobriram que a proporção variar muito. Por fim, comparou a relação entre KRAS abundância mutação ea eficácia do cetuximab em outros 35 pacientes com câncer colorretal metastático.
método PNA-PCR foi estabelecida antes em nosso laboratório [16], e neste estudo que fizemos menor ajustes, a fim de se certificar de que poderia quantificar e calcular a proporção de DNA mutante KRAS. Este método pode amplificar o ADN mutante KRAS e exclusivamente pode quantificar KRAS ADN mutante simultaneamente. Ao mesmo tempo, também poderia quantificar a quantidade de ADN total (tanto KRAS KRAS mutante e de tipo selvagem de ADN) por PCR quantitativa regulares (PCR sem PNA). Então poderíamos facilmente calcular a porcentagem de DNA mutante KRAS no DNA total.
Materiais e Métodos
linhas celulares e pacientes
linhas de células de carcinoma do cólon SW480 e SW116 (comprado de BIOK KM, China) foram utilizados neste estudo. linha celular SW480 contém uma KRAS homozigoto códon 12 mutação (GGT → GTT) e SW116 abriga gene KRAS do tipo selvagem. Um total de amostras FFPE 47 dos pacientes com câncer colorretal cujo estado de KRAS foi provado ser mutante em ambos KRAS códon 12 ou codão 13 foram obtidos a partir da Torre Hospital Tambor de novembro de 2008 a dezembro de 2010. Outros 35 pacientes com câncer colorretal com mutação KRAS foram recolhidos do Hospital de Câncer de Jiangsu de 2006 a 2010. diferente de pacientes acima, todos estes 35 doentes receberam tratamento com cetuximab. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes do início do tratamento. Todas as decisões de tratamento foram feitas pelos médicos que tratam antes da concepção do estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucionais dos hospitais (Comitê de Ética da Drum Tower Hospital e Comitê de Ética do Hospital de Câncer de Jiangsu), antes de este estudo foi realizado.
Extração de DNA a partir SW480, SW116 e FFPE tecidos
Depois de macrodissection manual dos tecidos FFPE, a hematoxilina e-eosina de tecido FFPE foram revisadas por três patologistas experientes para avaliar a abundância de células tumorais. O método de avaliação detalhado foi descrito anteriormente [17]. a percentagem de células de tumor da amostra é a média dos valores obtidos pelos três patologistas. O ADN genómico foi isolado a partir de amostras de FFPE, SW116 e SW480 com Recuperar Todos kit total de isolamento de ácido nucleico (catálogo n °. AM1975, Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Um controle negativo foi realizado para examinar a possibilidade de contaminação. As concentrações de ADN foram determinadas por UV (260 nm) espectrofotómetro.
PNA-PCR Além disso pirossequenciao
condições pyrosequencing PNA-PCR e foram descritos anteriormente excepto para PCR master mix [16]. Resumidamente, a mistura principal de PCR continha concentrações finais de reagentes da seguinte forma: uma mistura de Taq × SYBR Ex Premix (Takara, código DRR041A), 0,15 pmol /L para a frente e reverso iniciadores, 0,5 umol /L de ANP e certa quantidade de ADN. A sequência de ANP foi 5′-CCTACGCCACCAGCTCC-3 ‘. A sequência de iniciador de sentido directo era 5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3 ‘e o iniciador inverso foi 5′-biotina-CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC-3’. A termociclagem foi realizada em um tempo real de instruções de PCR Mx3000P (Stratagene) e as condições de ciclo foram as seguintes: 98 ° C durante 30 s e depois 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 72 ° C durante 10 s, 62 ° C durante 20 s e 72 ° C durante 20 s. Pirossequenciao foi realizada em pirossequenciao PSQ96 HS System (Biotage AB). A sequência de iniciador era pyrosequencing 5′-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 ‘. fim Nucleotide dispensação foi TACG cíclica de 5 ‘para 3’.
população de pacientes e Regimes de Tratamento
Foram analisados retrospectivamente 35 pacientes com diagnóstico histológico de mCRC com mutação KRAS de 2006 a 2010. Todos os tumores eram adenocarcinomas colorrectais. Os pacientes deram consentimento informado por escrito e foram tratados com cetuximab ou regimes baseados em ceruximab. Cetuximab foi administrado como agente único ou em combinação com regimes baseados em quimioterapia com a mesma dose até progressão da doença. Cetuximab foi administrado a uma dose de 250 mg /m
2 (dose inicial foi de 400 mg /m
2). Havia 28 pacientes que receberam cetuximab sozinho. Havia 4 pacientes que receberam tratamento com 5-FU acrescido de tratamento com cetuximab, após falha da terapia 5-FU. Outros 3 pacientes receberam terapia irinotecano, 5-FU e cetuximab depois de progresso da doença da terapia irinotecano mais 5-FU.
avaliação clínica e a resposta do tumor Critérios
A resposta clínica foi avaliada a cada 2 meses por tomografia computadorizada (TC) do tórax e abdómen e /ou verificação de resposta magnética (RM). Os critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) versão 1.0 foram adotados para avaliação clínica. De acordo com a versão 1.0 RECIST, resposta completa (RC) foi definida como o desaparecimento de todas as lesões alvo; resposta parcial (PR) foi, pelo menos, uma diminuição de 30% na soma dos diâmetros maiores (DLV) de lesões alvo tomando como referência a linha de base SLD; doença progressiva (PD) foi, pelo menos, um aumento de 20% no SLD de lesões alvo, tomando como referência o menor SLD registrado desde o início do tratamento; doença estável (SD) não foi nem diminuição suficiente em SLD para se qualificar para PR nem aumento suficiente na SLD para se qualificar para PD. Dois oncologistas e radiologistas verificada a resposta clínica para todos os pacientes de forma cega.
Análise Estatística
Os pacientes com CR, PR e SD foram definidos como pacientes com controle da doença e da taxa de controlo doente foi calculada como o número de doente de controlo da doença /o número de todos os pacientes. O teste do qui-quadrado foi realizado para comparar a taxa de controlo da doença de diferentes grupos nos 35 doentes com câncer colorretal. O Qui-quadrado foi realizado por SPSS 16.0. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
Validação de PNA-PCR Método em linhas celulares
Nós descobrimos que, quando adicionado 100 ng KRAS selvagem. ADN do tipo no ensaio de PCR-PNA, o PNA pode suprimir a amplificação do DNA de tipo selvagem. No entanto, esta supressão não foi completa e estável após testes repetidos (Fig. 1a). No entanto, quando se adicionou 100 ng KRAS do tipo selvagem do DNA e 0,01 ng KRAS ADN mutante no ensaio de PNA-PCR, o de tipo selvagem de ADN KRAS poderia ser completamente e de forma estável suprimida e apenas ADN KRAS mutante foi amplificado após a confirmação de pyrosequencing (Fig. 1B), o que indicou que mesmo o ADN mutante era rara comparação com o tipo selvagem, ensaio de PNA ainda amplificar o ADN mutante e exclusivamente esta amplificação pode ajudar a suprimir a amplificação de ADN de tipo selvagem completamente
.
(a) Não são produtos de PCR de tipo selvagem, quando a adição de 100 ng KRAS do tipo selvagem no ensaio de ADN PNA-PCR. (B) Há apenas KRAS produtos de PCR mutante quando a adição de 100 ng de ADN de tipo selvagem e 0,01 ng KRAS mutante DNA.
A fim de certificar-se da estabilidade do ensaio, que diminuiu a quantidade de de tipo selvagem, ADN a 10 ng adicionado no ensaio e verificou que o PNA pode completamente e de forma estável suprimir a amplificação de ADN de tipo selvagem, mesmo na ausência de ADN mutante KRAS (não há produtos de PCR, a confirmação por electroforese em gel e pyrosequencing, dados não mostrados ). Portanto, na seguinte experiência, controlámos o ADN adicionado no ensaio não mais do que 10 ng.
Validação do Método PNA-PCR em tecidos tumorais do cancro dos pacientes
Um total de 47 colorrectal pacientes com câncer foram confirmados para transportar mutação KRAS por COLD-PCR /seqüenciamento Sanger [17]. No total, houve 15 G12D, 13 G12V, 13 G13D, 2 G12S, 2G12A, 2G13R e 1G12C KRAS mutações (um paciente carregando dois tipos de mutações KRAS). A percentagem de células de tumor em amostras FFPE foi listada na Tabela 1. Não mais do que 10 ng de ADN de amostra FFPE foi adicionado ao ensaio de PNA-PCR e os produtos de PCR foram sequenciados por pirossequenciao. Como esperávamos, o ensaio PNA-PCR amplificado KRAS mutante DNA exclusivamente. A Figura 2 mostra que nenhum ADN do tipo selvagem foi amplificado no ensaio de PCR-PNA.
num tecido tumoral contém uma mutação GCT GGT →. tecido B Tumor contém uma mutação GGT → GAT. tecido C Tumor contém uma mutação GGC → GAC.
Detectar e calcular a percentagem de KRAS DNA mutante
Antes de detectar o percentual de DNA mutante do tecido tumoral, foram analisados a curva padrão do ensaio de PNA-PCR e encontrado a linha de regressão foi linear (coeficiente angular = -3,25; r = 0,977) na gama de 0,02 a 10 ng de ADN mutante KRAS (Fig. 3), o que significa que este ensaio pode quantificar KRAS mutante DNA.
quantidades variáveis de KRAS mutante DNA foram plotados contra os valores Ct (ciclo limite). Declive, o valor R e a linha de regressão são apresentados.
n mais do que 10 ng de ADN a partir de tecido FFPE (2 ul) foi adicionado para ensaio de PNA-PCR e PCR normal (sem PNA), respectivamente (todas reações foram realizadas em triplicado). DNA total a própria amostra e DNA mutante KRAS poderia ser lido por curva padrão. A quantidade de ADN no ensaio normal de PCR foi o DNA total, como todos os tipos de DNA podem ser igualmente amplificados e a quantidade de ADN no ensaio de PNA-DNA de PCR foi KRAS mutante como o de tipo selvagem não amplificou um neste ensaio. A percentagem de ADN KRAS mutante foi calculada como a quantidade de ADN KRAS /mutante quantidade de ADN total. A percentagem de ADN mutante KRAS em células de tumor foi calculada como a percentagem de ADN mutante KRAS em ADN /percentagem total de células tumorais em tecido tumoral. A percentagem de ADN mutante em células tumorais variaram de 10,8% para 98,3% (Tabela 1). No total, havia 10 amostras contendo DNA mutante menos de 30%, 27 amostras de 30% para 80% e 10 amostras de mais de 80%.
Percentagem de KRAS mutação nas células tumorais e Correlação de Resposta
características do paciente e percentual de mutação KRAS em células tumorais foram listados na tabela 2. A taxa de resposta parcial foi de 2,9% (1/35), doença estável de 14,3% (5/35) e doença progressiva 82,9% ( 29/35). A correlação entre a percentagem de mutação KRAS em células tumorais e o controle da doença foi listada na tabela 3. No total, na mutação KRAS menos do que 30% do grupo de taxa de controle da doença foi de 44,4%; a taxa de grupo 30~80% de controlo da doença foi de 5,6% e a 80% do grupo foi de 12,5% (P = 0,038). Era digno de nota que na grupo 80% o paciente que teve a doença estabilizada contém uma mutação G13D. Neste estudo, a taxa de resposta foi de 18,5% (27/05) para KRAS 12 mutações de codões e 12,5% (08/01) para mutação KRAS G13D (Tabela 4). Não observamos que os pacientes com mutação KRAS G13D melhor taxa de resposta (Tabela 4).
Discussão
O presente estudo demonstrou que PNA-PCR método pode quantificar e calcular a abundância da mutação KRAS de células tumorais. Tanto quanto sabemos, em primeiro lugar, mostrou que a baixa abundância de mutação KRAS ( 30%) pode também beneficiar de um tratamento anti-EGFR em pacientes com câncer colorretal metastático. Uma vez que estudos anteriores única focado em saber se a mutação foi positivo, o nosso estudo revelou um novo conceito de terapia de anticorpos EGFR pesquisa.
Neste estudo, houve 7 pacientes tratados por ambos cetuximab e quimioterapia. No entanto, todos estes 7 pacientes receberam cetuximab após falha de quimioterapia inicial. Por isso, tendem a acreditar que a resposta dos pacientes à terapia contribuiu principalmente para cetuximab. Embora houvesse estudos comprovaram que os pacientes com mutação KRAS G13D mostrou uma forte tendência a um resultado mais favorável em comparação com códon 12 mutações, não conseguimos observar isso no nosso estudo, potencialmente, por causa dos pacientes número limitado deste estudo.
os nossos resultados indicam que a percentagem de ADN mutante KRAS em células tumorais variaram de 10,8% para 98,3% e esta distribuição era contínuo. Como esperávamos, os pacientes tendo baixa abundância ( 30%) de mutação KRAS tinha maior taxa de controle da doença para cetuximab do que outros grupos (44,4% para grupo 30% vs 5,6% para o grupo 30~80% e 12,5% para grupo 80%, P = 0,038). Se excluíssemos um paciente controle da doença que carregava uma mutação G13D em . 80% do grupo, a tendência que baixa abundância apresentaram maior taxa de controle da doença foi mais evidente
Apesar de sequenciamento Sanger direta foi considerada como um método clássico para triagem mutações KRAS, mais e mais altos métodos de sensibilidade, como COLD-PCR, braços, PCR mutante enriquecido, amplificação competitiva de amplicons de fusão diferencialmente (CADMA) [18], [19], [20], [21] foram aplicadas a mutações KRAS tela. Estes métodos ajudaram-nos a encontrar mais KRAS amostras mutantes. No entanto, se estas amostras poderiam beneficiar de terapia anti-EGFR permanece desconhecida. Nosso estudo mostrou que essas amostras com baixa abundância de mutações KRAS pode se beneficiar de terapia de anticorpos EGFR.
Por que tumor com baixa abundância de mutação KRAS tendem a resposta à terapia com anticorpos EGFR? Uma possível explicação era que as células tumorais teve grande heterogeneidade. Quando as células tumorais KRAS mutante foram minoria, a maioria das células tumorais de tipo selvagem KRAS poderia também ser mortos por tratamento com anticorpos EGFR e em doentes com cancro este processo pode mostrar um relativamente longo tempo de estabilização da doença ou mesmo resposta parcial. No entanto, como a terapia continua, mais e mais KRAS do tipo selvagem tumor são eliminados, a abundância de mutação KRAS torna-se maior e os pacientes tendem a ter uma progressão da doença e tornar-se resistente à terapia com anticorpos EGFR.
Estes poderiam também explicar por que o tratamento com anticorpo EGFR é inicialmente eficaz para a maioria dos doentes com cancro do tipo selvagem KRAS e, em seguida, losts sua eficiência como terapia continua. Um artigo recente publicado no
Nature, achou que 60% dos pacientes que desenvolveram resistência ao tratamento com o anticorpo EGFR mostrou aquisição de mutações KRAS secundárias [22]. Nós tendemos a acreditar que esta mutação KRAS “secundário” realmente existe em tecidos tumorais primárias. Como as células tumorais contendo esta mutação eram em número reduzido, não foi possível detectá-los antes da terapia. No entanto, como a terapêutica continuada, a proporção de células tumorais sob a pressão ajustada terapia. Nesta situação, a terapia anti-EGFR perderam a sua eficiência e as mutações KRAS “secundários” pode também ser facilmente detectada.
Mais importante, Misale et ai também descobriram que KRAS alelos mutantes podiam ser detectados no sangue de anti- pacientes de tratamento EGFR tão cedo quanto 10 meses antes documentação radiográfica de progressão da doença [22]. Em outras palavras, mesmo o KRAS existem alelos mutantes, os pacientes podem ainda têm um longo tempo relativo (10 meses) de doença estável. O resultado deste artigo coincide com as nossas descobertas e mostra que a existência de mutações KRAS não significa uma resistência completa
.
Embora alguns pesquisadores tinha pago atenções para distinguir baixa e alta abundância de mutação EGFR recentemente [15], a nossa vantagem foi mais evidente como o nosso método pode facilmente e com precisão calcular a percentagem exacta de KRAS alelos mutantes. Este cálculo preciso pode refletir o percentual de mutação KRAS mais objetiva e ajudar outro laboratório verificar a nossa conclusão mais facilmente
Em resumo., Nosso estudo demonstrou que o método PNA-PCR poderia facilmente detectar o percentual de mutação KRAS em células tumorais . pacientes com câncer colorretal com baixa abundância de mutação KRAS pode se beneficiar de terapia de anticorpo EGFR e é necessária mais investigação sobre um paciente número maior.