Abstract

proteína caixa de forkhead O1 (FOXO1), um membro chave da família FOXO de fatores de transcrição, atua como um supressor tumoral e tem sido associado com várias funções celulares essenciais, incluindo o crescimento celular, diferenciação, apoptose e angiogese. Portanto, é intrigante porque a expressão da proteína FOXO é regulada negativamente em células cancerosas. MicroRNAs, não-codificante de nucleótidos 20~22 ARN de cadeia simples, resultam na repressão translacional ou degradação e silenciamento de genes dos seus genes-alvo, e contribuem significativamente para a regulação da expressão do gene. No estudo actual, que relatam que a expressão de miR-370 foi significativamente regulada positivamente em linhas celulares de cancro da próstata cinco, em comparação com as células normais epiteliais da próstata PrEC (). A expressão ectópica de miR-370 induziu a proliferação e aumentou o crescimento e a formação de colónias capacidade independente de ancoragem de células de cancro da próstata LNCaP e DU145, enquanto que a inibição de miR-370 reduziu a proliferação, o crescimento e a formação de colónias capacidade independente de ancoragem. Além disso, a regulação positiva de miR-370 promoveu a entrada de células de cancro da próstata DU145 e LNCaP na transição /ciclo celular G1 S, que foi associada com a regulação negativa da cinase dependente da ciclina (CDK), inibidores de

p27

KIP1 Comprar e

p21

Cip1

e regulação positiva do ciclo celular regulador de ciclina D1 mRNA. Além disso, demonstramos que miR-370 pode regular negativamente a expressão de FOXO1, visando diretamente o

FOXO1 e região 3 ‘não traduzida. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que miR-370 desempenha um papel importante na proliferação de células cancerosas humanas da próstata, suprimindo diretamente o FOXO1 supressor de tumor

Citation:. Wu Z, Sun H, Zeng W, Ele J , Mao X (2012) regulação positiva de MircoRNA-370 induz a proliferação de células cancerosas da próstata humana por downregulating o Fator de Transcrição FOXO1. PLoS ONE 7 (9): e45825. doi: 10.1371 /journal.pone.0045825

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de maio de 2012; Aceito: 24 de agosto de 2012; Publicação: 18 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Weixia Zeng é empregado por uma empresa comercial Laura Biotech Co, Ltd. Esta não altera a nossa adesão a todas as PLoS ONE políticas sobre dados e materiais de compartilhamento. Os outros autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

O câncer de próstata é a segunda malignidade comum no sexo masculino, com mais de 0,78 milhões de novos casos que ocorrem em todo o mundo a cada ano [1]. Cerca de 190.000 homens são diagnosticados com câncer de próstata e mais de 27.360 pacientes com câncer de próstata morrem a cada ano nos EUA [2]. O câncer de próstata representa um importante problema de saúde pública e está associada com custos significativos de saúde. antígeno (PSA) de triagem específico da próstata no soro é útil para o diagnóstico precoce do câncer de próstata; No entanto, o teste de PSA tem muitos problemas, por exemplo, os níveis de PSA são muitas vezes elevados em homens que sofrem inflamação da próstata benigna. As estratégias de tratamento atualmente disponíveis para o câncer de próstata, incluindo a castração cirúrgica e quimioterapia, são geralmente mal sucedidos [3]. É bem sabido que lesões do cancro da próstata são heterogéneos e muitas vezes respondem bem à terapia de privação de androgénio inicial (ADT) [4]. Actualmente, a maioria dos pacientes com câncer de próstata escolheu um hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) agonista /antagonista em vez de castração cirúrgica, e ADT é aplicado principalmente como terapia sistêmica em pacientes com metástases. No entanto, muitos pacientes de cancro da próstata, eventualmente experimentam a recorrência e o androgénio independência, o que leva à progressão da doença acelerada e morte [4], [5]. Assim, novos alvos para estratégias de tratamento do câncer de próstata eficazes precisam urgentemente de ser identificado.

Embora ambos os fatores genéticos e ambientais são considerados os principais fatores, os mecanismos moleculares de desenvolvimento de câncer de próstata e progressão permanecem largamente desconhecidos. Os tumores malignos são caracterizados pela actividade desregulada nas vias reguladoras que controlam a proliferação e /ou apoptose. A capacidade de inibir um ou mais alvos-chave dentro destas vias de sinalização pode fornecer novos avanços no tratamento do câncer. Diversas vias de regulação, tais como o receptor de androgénio (AR) e via de sinalização de Akt /proteína quinase B (PKB) via de sinalização de desempenhar um papel-chave na regulação de apoptose e a proliferação de células cancerosas da próstata 6-10. Por isso, é de grande importância para compreender essas vias, como a descoberta dos principais reguladores podem não só gerar informações de prognóstico preciso, mas também pode fornecer novas estratégias de tratamento para câncer de próstata.

A Akt /PKB via promove a sobrevivência de células regulando uma série de fatores de transcrição, incluindo o fator forkhead transcrição superfamília [11], tal como a proteína caixa de forkhead O1 (FoxO1, também conhecido como cabeça de forquilha na rhabdomyosarcomas [FKHR]), FOXO3a (FKHRL1), FoxO4 (AFX) e FoxO6 . Uma vez que o isolamento do gene forkhead em

Drosophila melanogaster

, mais do que 100 forkhead factores de transcrição estruturalmente relacionados, foram identificados [12]. Os membros da subfamília FOXO são activadores transcricionais conservados evolutivamente, caracterizadas por um domínio altamente conservado forkhead contendo um motivo de ligação de ADN [13]. FOXO1 foi identificado durante o estudo do t (2,13) ​​(q35; q14) e t (1,13) (p36; q14) translocações cromossómicas, que são comumente encontrados em rabdomiossarcoma alveolar, um tumor esquelético-muscular predominante em crianças [ ,,,0],14]. FOXO proteínas desempenham um papel central numa variedade de processos biológicos, incluindo a apoptose, o ciclo celular, diferenciação, respostas a stress, reparação de danos no ADN e o metabolismo da glucose [15]. Ativação de membros da subfamília FOXO pode regular positivamente a inibidores do ciclo celular p21

Cip1 e p27

KIP1 e regular negativamente a ciclina regulador do ciclo celular D1 /2, consequentemente levando a G1 /S do ciclo celular prisão [16] – [ ,,,0],18]. Portanto, os factores de transcrição são FOXO supressores tumorais chave. A evidência crescente sugere que a activação de FOXO1 induz a apoptose em células de cancro da próstata [18] – [23]. Brunet et ai. indicaram que, através da interacção com proteínas 14-3-3 chaperone, a fosforilação pode induzir a translocação nuclear de factores de transcrição FOXO [13]. No entanto, as razões pelas quais FOXO é regulada negativamente em células cancerosas são mal caracterizadas. Assim, a hipótese de que um mecanismo alternativo pode regular a expressão da proteína FOXO em células cancerosas.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos, não-codificação, RNAs de cadeia simples que pode regular negativamente a expressão do gene no posto nível -transcriptional, principalmente por ligação a região 3 ‘não traduzida (UTR) dos seus mRNAs alvo [24] – [26]. Numerosos estudos demonstraram que a expressão aberrante de miARNs está intimamente associada com a proliferação, invasão, metástase e o prognóstico de vários cancros, incluindo o cancro da próstata, cancro da mama, glioma e cancro do pulmão [27] – [30]. expressão aberrante de miRNAs resulta em mudanças de expressão de genes, modificações epigenéticas e abundância alterada da enzima miRNA-processamento Dicer. a progressão do cancro da próstata está relacionado com a expressão alterada de vários oncogenes e supressores tumorais, e miARN pode potencialmente regulam estes genes; No entanto, a relação entre o cancro da próstata miARNs e só começou a ser elucidado nos últimos anos [31]. Mais de 50 miARNs são relatados para ser envolvido no cancro da próstata; no entanto, a maioria dos dados atuais sugerem que apenas um pequeno número de estes se relacionam com a patogênese do câncer de próstata. Interessantemente, dos miARNs que são conhecidos de alterar o fenótipo de células de cancro da próstata, são considerados alguns oncogénica (por exemplo, o miR-221 /-222, miR-21 e miR-125b), ao passo que outros são considerados como sendo supressores tumorais (por exemplo, , miR-101, miR-126 *, miR-146a, miR-330, o cluster miR-34 e da família miR-200). Com base nestes resultados, os miRNAs são pensados ​​para ter um número de potenciais aplicações clínicas no cancro da próstata como biomarcadores e alvos terapêuticos [27], [30], [32] – [38].

No estudo atual , algoritmos publicamente disponíveis (TargetScan, PicTar, Miranda) indicaram que miR-370 pode ter como alvo diretamente o 3`-UTR de

FOXO1

. Nós demonstramos que miR-370 promoveu a proliferação de células de câncer de próstata, visando directamente o 3′-UTR de

FOXO1

mRNA, que posteriormente reduzida expressão da quinase dependente da ciclina (CDK), inibidores de

p27

KIP1

e

p21

Cip1

e regulada do regulador do ciclo celular

ciclina D1

. Nossos resultados sugerem que miR-370 pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

cultura celular

células epiteliais da próstata normais (Prec ) foram obtidas da Clonetics-Biowhittaker (Walkersville, MD, EUA) e cultivadas em meio PrEMB (Clonetics-Biowhittaker). linhas celulares de cancro da próstata TSU-PR1 PC3, DU145, LNCaP e 22Rv1 linhas celulares foram obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA). PC3 foi mantida em F-12K Médio (Invitrogen), foi cultivada em DU145 de Eagle Mínimo Essencial Médium (Invitrogen), e Tsu-Pr1,22Rv1 e LNCaP foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA) e 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen).

Plasmids e transfecção

A sequência clone do

FOXO1

3’UTR é tão Segue: CTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAACTGAGAGAAGCAGTCCAAAGATGTCTTTCACCAACTCCCTTTTAGTTTTCTTGGTTAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAACCCTCCTTTTTTCCTTTCGTCAGACTTGGCAGCAAAGACATTTTTCCTGTACAGGATGTTTGCCCAATGTGTGCAGGTTATGTGCTGCTGTAGATAAGGACTGTGCCAT.

This sequência foi amplificado por PCR a partir do PREC RNA e clonado no

Sac

I /

Xma

locais do controle pGL3 plasmídeo repórter luciferase (modificado pela adição de

I Sac

I /

Xma

Eu sites para plasmídeos de Promega, Madison, WI, EUA) e o

Sac

I /

Xma

locais I do pGFP-C3 (modificado pela adição de

Sac

I /

XMA

Eu sites para plasmídeos de Clontech, mountain View, CA, EUA). Nós modificamos o vetor de controle de pGL3 original por digerindo o local de Xbal 1934 e destruindo locais multiplicam clonagem (MCS), que é a montante do promotor de SV40, por isso os locais originais de

Sac

I /

Xma

I são perdidas. E então, temos sintetizado uma seção da sequência incluindo

Sac

I /

Xma

Eu sites. Mais tarde, acrescentou esta sequência para o sítio de Xbal 1934. A sequência de pGL3-control modificada é a seguinte:

TCTAGA AA GAGCTC AACCAATGCATTGGTCC CCCGGG GGAGCTCTAGA

Depois de todos estes, FOXO1 3’UTR é clonado na 3’UTR de Luc + não a montante do promotor de SV40.

pGFP-C3 plasmídeo, MCS está localizado na 3’UTR de GFP, incluindo o seguinte sequence:

TACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCA.

The primers foram:

FOXO1

-3’UTR-wt-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAAC-3 ‘;

FOXO1

-3’UTR-wt-dn: 5′-GCCCTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 ‘;

FOXO1

-3’UTR-mu-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCACCAAC-3 ‘e

FOXO1

-3’UTR-mu-dn: 5′-GCC CTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3′. O plasmídeo MLP-IRS-Luc P3X foi construído como descrito anteriormente [19]. Os miR-370 imita, controle negativo e anti-miR-370 inibidor foram adquiridos de RiboBio (Guangzhou, Guangdong, China). A transfecção do inibidor de microARN e microARN foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Western blotting

análise de Western blot foi realizada de acordo com métodos padrão utilizando anticorpos anti-FOXO1, anti -p21, anti-p27, anti-ciclina D1, anti-Ki-67 anticorpos (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), anti-Rb e anticorpos anti-Rb fosforiladas (Abcam, Cambridge, MA, EUA). As membranas foram retirados e re-hibridar com um anticorpo monoclonal anti-SS-tubulina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) como um controlo de carga.

extracção de ARN e em tempo real quantitativa de PCR

total de miARNs foram extraídos a partir de células cultivadas utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, em seguida, ADNc foi sintetizado a partir de 5 ng de ARN total usando o kit de transcrição reversa Taqman miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os níveis de expressão de miR-370 foram quantificados utilizando um kit TaqMan miARN ensaio específicos para as miARN (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de miARN foram definidos com base no ciclo limiar (C

T), e os níveis de expressão relativos foram calculados como 2

– [(Ct de miR-370) – (Ct de U6)].

PCR em tempo real foi realizada utilizando o 7500 sistema de Detecção de Sequência de Applied Biosystems utilizando os seguintes iniciadores para

p21

Cip1

, (para a frente, 5′-CGATGCCAACCTCCTCAACGA-3 ‘e reverter, 5’ TCGCAGACCTCCAGCATCCA-3 ‘);

p27

KIP1

(para a frente, 5′-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3 ‘e inverso, 5′-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3′) e o ARNm da ciclina D1 (para a frente, 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ‘e inverso, cinco ‘-CCACTTGAG CTTGTTCACCA-3’). Os dados de expressão foram normalizados para o nível de expressão média geométrica do gene de manutenção

GAPDH

(para a frente, 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 ‘; reversa, 3′-AGAGGCAGGGATG ATGTTCTG -5’) e calculada usando 2

– [(Ct de

p21, p27, ou ciclina D1

) – (Ct

de

GAPDH

)], em que C

t representa o ciclo limite para cada transcrito .

3- (4, 5-Dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazólio (MTT)

As células foram semeadas em placas de 96 poços. Nos pontos de tempo indicados, as células foram incubadas com 100 uL de MTT esterilizado (0,5 mg /ml, Sigma) durante 4 h a 37 ° C, depois o meio foi removido e substituído por 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). A absorvância foi medida a 570 nm, com 655 nm como um comprimento de onda de referência. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Anchorage-independente capacidade de crescimento ensaio

Quinhentos células foram tripsinizadas e ressuspensas em 2 ml de meio completo contendo 0,3% de agar (Sigma). A mistura de células-agar foi plaqueada em meio completo contendo 1% de agar. Após 10 dias, as colónias viáveis ​​foram medidos usando um micrómetro ocular e as colónias contendo mais de 50 células e colónias maiores do que 0,1 mm de diâmetro foram contados. O experimento foi realizado três vezes independentes para cada linha de células.

ensaios de formação de colónias

As células foram colocadas em placas de 6 poços (0,5 × 10

3 células por placa), cultivadas por 10 dias, fixado com formol a 10% para 5 min, coradas com 1,0% de violeta cristal durante 30 s e contadas.

rotulagem Bromodeoxyuridine e imunofluorescência

As células cultivadas em lamelas (Fisher, Pittsburgh, PA , EUA) foram incubadas com bromodesoxiuridina (BrdU) durante 1 h, em seguida, coradas com um anticorpo anti-BrdU (Upstate, Temecula, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. imagens de níveis de cinza foram adquiridos utilizando um microscópio de varredura a laser (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss Co. Ltd., Jena, Alemanha).

Os ensaios de luciferase

células cancerosas da próstata (3,5 × 10

4) foram semeadas em triplicado em placas de 24 cavidades, deixou-se assentar durante 24 h e, em seguida, co-transfectadas com 100 ng P3X IRS-MLP ADN plasmídeo de luciferase, com 100 ng de pGL3-FOXO1-3’UTR (p /mu) plasmídeo de ADN ou 100 ng de controlo pGL3 lucif erase-1 ng de plasmídeo e de controlo de Renilla plasmídeo pRL-TK (Promega) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Luciferase e a actividade de Renilla foram medidos 48 h após a transfecção usando o duplo de Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Três experiências independentes foram realizados e os dados são apresentados como a média ± DP. valores de actividade de luciferase normalizada para a actividade de Renilla.

análise de citometria de fluxo

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas em PBS gelado, fixo em gelada etanol a 80% em PBS, centrifugada a 4 ° C e ressuspenderam-se em PBS arrefecido. ARNase pancreática bovina (Sigma-Aldrich) foi adicionado a uma concentração final de 2 ug /ml, incubou-se a 37 ° C durante 30 min, em seguida, 20 ug /mL de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) foi adicionada e incubada durante 20 min a sala temperatura. Em cada grupo, 50.000 células foram analisadas por citometria de fluxo. (FACSCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA)

A análise estatística

O Student bicaudal

t

-test foi utilizado para avaliar a significância das diferenças entre os dois grupos;

valores P Art 0,05 foram considerados significativos

Resultados

miR-370 é regulada em linhas celulares de cancro da próstata

A análise de PCR em tempo real revelada. que a expressão de miR-370 foi significativamente aumentada em todas as linhas celulares de cancro de cinco próstata testados (Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 e LNCaP), em comparação com epitelial de próstata normal (PrEC) células (Figura 1A), indicando que o miR-370 é regulada positivamente em linhas celulares de cancro da próstata

a, em tempo real a análise de PCR de miR-370 a expressão em células epiteliais prostáticas normais. (PrECs; mostrado como N1 e N2) e cancro da próstata incluindo linhas celulares PC3, DU145, 22Rv1 e células LNCaP B, ensaios MTT, indicando que a proliferação de células de miR-370 transfectadas aumentou, em comparação com o controlo negativo (CN) -transfected células. C, o ensaio de formação de colónias de miR-370 células com superexpressão; micrografias representativas (esquerda) e quantificação (direita) de cristal violeta colônias de células coradas. D, Quantificação de Ki-67 células positivas em células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 controle de mímica ou negativo (NC) 48 horas após a transfecção. E, regulação positiva de miR-370 promoveu tumorigenicidade de células de câncer de próstata; micrografias representativas (esquerda) e quantificação das colónias contendo mais de 50 células (meio) ou colónias maiores do que 0,1 mm (direita) no ensaio de crescimento independente de ancoragem. Barras representam a média ± SD de valores de três experiências independentes; *

P Art 0,05

A superexpressão de miR-370 aumenta a proliferação e aumenta a tumorigenicidade

A fim de investigar a função de miR-370 no câncer de próstata. , que um transfectadas HSA-miR-370 e PC3 imitar em células de cancro da próstata DU145 e proliferação celular medido. Utilizando ensaios de MTT e a formação de colónias, foi observado que a taxa de crescimento de células que sobre-expressam o miR-370 foi dramaticamente aumentada, em comparação com o controlo negativo (CN) -transfected células de cancro da próstata (Figura 1B e 1C). Além disso, a proporção de células positivas Ki-67, um indicador conhecido de células em proliferação, foi significativamente aumentado nas células que expressam ectopicamente de miR-370, em comparação com células NC-transfectadas (Figura 1D). Estes resultados demonstraram que a sobre-regulação de miR-370 promove a proliferação de células cancerosas da próstata.

Além disso, a expressão ectópica de miR-370 em células de cancro da próstata PC3 e DU145 aumentou significativamente a capacidade de crescimento independente de ancoragem e levar a um aumento número de colónias e tamanho no ensaio de formação de colónias em agar mole (Figura 1F), sugerindo que a regulação positiva de miR-370 aumentou tumorigenicidade de células de câncer de próstata

in vitro

. Tomados em conjunto, estas experiências demonstraram que a sobre-regulação de miR-370 promoveu a proliferação e transformação de células de cancro da próstata.

A sobre-expressão de miR-370 promove a /S transição G1 do ciclo celular em células cancerosas da próstata

além disso, investigamos o efeito do miR-370 sobre a proliferação utilizando a citometria de fluxo. PC3 e DU145 células miR-370 que sobre-expressam teve uma percentagem significativamente inferior de células na fase G1 /G0 e aumento da percentagem de células na fase S, em comparação com células NC-transfectadas (Figura 2A). Além disso, foram observados um aumento do número de células-incorporação de BrdU nas células de miR-370 transfectadas, em comparação com células NC-transfectadas (Figura 2b). Colectivamente, estes dados sugerem que a superexpressão de miR-370 pode aumentar a proliferação de células de cancro da próstata através da promoção da G1 /S do ciclo celular de transição.

, análise de citometria de fluxo de células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 mímico ou um controlo negativo (CN) 48 horas após a transfecção. B, micrografias representativas (à esquerda) e quantificação (direita) do ensaio de incorporação de BrdU em células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 ou NC 48 horas após a transfecção. C, a análise Western blot indicando diminuição da expressão da p21

Cip1, p27

KIP1 e aumento da expressão de ciclina D1 e Rb fosforilada (p-Rb) em células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 ou NC 48 horas após a transfecção . α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. D, em tempo real de análise de PCR de

p21

Cip1, p27

KIP1

e ciclina D1 mRNA em células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 ou NC 48 horas após a transfecção.

GAPDH

foi utilizado como um controlo de carga. Barras representam a média ± SD de valores de três experiências independentes; *

P

. 0,05

miR-370 diminui a expressão dos inibidores do ciclo celular

p21

Cip1

e

p27

KIP1

e aumenta a expressão do regulador do ciclo celular da ciclina D1

Como o miR-370 promoveu a proliferação de células, que explorado o efeito de miR-370 sobre a expressão dos genes que regulam a transição G1 /S [4 ] – [6], incluindo a CDK inibidores de p21

Cip1 e p27

KIP1 ea ciclina D1 regulador de CDK. Usando Western blot e análise de PCR em tempo real, observamos que a p21

Cip1 e p27

proteína KIP1 e mRNA foram reprimidos e proteína ciclina D1 e mRNA foram upregulated em células de miR-370 transfectadas, em comparação com NC-transfectadas células (Figura 2C e 2D). Coincidente com a expressão alterada de reguladores do ciclo celular, o nível de fosforilação de Rb, uma proteína-alvo a jusante de CDK, foi significativamente aumentado nas células de miR-370 transfectadas (Figura 2C), ainda confirmando que o miR-370 pode influenciar a proliferação de próstata células cancerosas.

a inibição de miR-370 reduz a proliferação de células de cancro da próstata

Como descrito acima, o miR-370 desempenha um papel crítico na proliferação de células cancerosas da próstata. No entanto, manteve-se desconhecido se inibir o miR-370 iria reduzir a proliferação celular. Como esperado, a inibição de miR-370 aumentou a transcrição da

p21

Cip1

e

p27

KIP1

e reduziu a expressão de mRNA de ciclina D1 (Figura 3A). Além disso, a inibição de miR-370 aumentou significativamente a percentagem de células na fase G0 /G1 e diminuiu a percentagem de células na fase S (Figura 3B). Além disso, utilizando o ensaio de MTT, descobrimos que a expressão ectópica do inibidor de HSA-miR-370 reduziu o crescimento de células de cancro da próstata PC3 e DU145, em comparação com células NC-transfectadas (Figura 3C). Além disso, como mostrado na Figura 3D, a inibição de miR-370 diminuiu o número de colónias e tamanhos de colónias de células PC3 e DU145, no ensaio de formação de colónia, e também reduziu acentuadamente a capacidade de crescimento independente de ancoragem de ambas as linhas celulares.

real-time PCR análise de

p21

Cip1, p27

KIP1 ciclina D1 mRNA em células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 inibidor ou controlo negativo Comprar e (NC) 48 horas após a transfecção .

GAPDH

foi utilizado como um controlo de carga. B, análise de citometria de fluxo de células PC3 e DU145 transfectadas com miR-370 inibidor ou NC 48 horas após a transfecção. C, ensaios MTT revelou que a inibição de miR-370 reduziu o crescimento celular. D, micrografias representativas (esquerda) e quantificação das colónias contendo mais de 50 células (meio) ou colônias maior do que 0,1 mm (direita) nos ensaios de crescimento independente de ancoragem. Barras representam a média ± SD de valores de três experiências independentes; *

P

. 0,05

miR-370 atinge diretamente o fator de transcrição

FOXO1

em células de câncer de próstata

Um estudo anterior revelou que FOXO1 pode regular uma série de genes relevantes para o ciclo celular em um nível de transcrição, incluindo

p21

Cip1

,

p27

KIP1

e ciclina D1 mRNA. Em paralelo, a nossa análise utilizando três algoritmos publicamente disponíveis (TargetScan, PicTar, Miranda) demonstraram que miR-370 pode ter como alvo diretamente o 3′-UTR de

FOXO1

(Figura 4A). Estes dados indicaram que miR-370 pode modular a expressão da p27

KIP1, p21

Cip1 e ciclina D1, regulando

FOXO1

. Como mostrado na Figura 4B, a Figura S2A e Figura 4C, a expressão ectópica de miR-370 diminuiu os níveis de proteína e ARNm de FOXO1 expressão em células PC3 e DU145, indicando que

FOXO1

é um potencial gene alvo miR-370 . FOXO1 é regulada negativamente em células de câncer de próstata (Figura S1A e Figura 1A); que é susceptível de ser ligada à sobre-regulação de miR-370 em células de cancro da próstata (Figura 1), o que reduziria a expressão do gene alvo de miR-370

FOXO1

.

A, de Sequência

FOXO1

miR-370 região de semente de ligação 3’UTR e mutação do

FOXO1 região semente

3′-UTR para criar FOXO1-mu. B, a análise Western blot de expressão FOXO1 no miR-370 ou negativa de controle (NC) PC3 -transfected e células DU145 48 horas após a transfecção. C, Relative actividades repórter FOXO1 em miR-370 ou células NC-transfectadas 48 horas após a transfecção. D, análise de transferência de Western da expressão do gene repórter da GFP em miR-370 ou CN-transfectadas células 48 horas após a transfecção. E, a actividade de luciferase relativa de PC3 ou da próstata DU145 células cancerosas co-transfectadas com quantidades crescentes de miR-370 oligonucleótidos imitam (20, 50 nM) e o repórter de controlo pGL3, repórter pGL3-FOXO1-3’UTR, ou pGL3-FOXO1 repórter -3’UTR-mu, 48 horas após a transfecção, respectivamente. Barras representam a média ± SD de valores de três experiências independentes; *

P

. 0,05

Para confirmar a função do sítio de ligação putativo miR-370 no

FOXO1

3′-UTR, nós clonado

FOXO1

3′-UTR para os plasmídeos repórter pEGFP-C3 e pGL3. a expressão da proteína GFP foi dramaticamente inibida pela expressão ectópica de miR-370 em células PC3 e DU145, em comparação com o plasmídeo de controlo de GFP-γ-tubulina, o que sugere que o miR-370 tem como alvo especificamente o

FOXO1

UTR 3 ‘. Transfecção de miR-370 de forma consistente e dose-dependente reduziu a atividade da luciferase do

FOXO1

3′-UTR luciferase plasmídeo repórter em PC3 e células cancerosas da próstata DU145 (Figura 4E). Além disso, o efeito repressivo do miR-370 no

FOXO1

3′-UTR foi revogada por mutações pontuais na região de semente de miR-370 de ligação do

FOXO1

3′-UTR ( A Figura 4E). Estes resultados demonstraram que

FOXO1

é um

fidedigno

alvo de miR-370.

A transfecção de um inibidor de miR-370 restaurou a actividade de luciferase do pGL3-FOXO1- 3’UTR plasmídeo repórter em PC3 e células cancerígenas da próstata DU145 (Figura 5A), e a expressão da proteína FOXO1 regulada positivamente (Figura 5B). Além disso, a inibição de miR-370 de forma consistente e dependente da dose, aumentou a actividade da luciferase de pGL3-FOXO1-3’UTR em ambas as linhas de células de cancro da próstata (Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a inibição de miR-370. FOXO1 upregulated

ensaio da actividade de luciferase relativa de células PC3 e DU145 co-transfectadas com o plasmídeo pGL3-FOXO1-3’UTR e quantidades crescentes (20, 50 nM) de miR-370 mimic- ou miR-370 inibidor de oligonucleótidos, 48 ​​horas após a transfecção, respectivamente. B, a análise Western blot de expressão FOXO1 no miR-370 ou negativa de controle (NC) PC3 -transfected e células DU145 48 horas após a transfecção. C, Ensaio de actividade da luciferase de células PC3 e DU145 transfectadas com o plasmídeo pGL3-FOXO1-3’UTR e quantidades crescentes (20, 50 nM) de miR-370 Inibidor de oligonucleótidos de 48 horas após a transfecção. Barras representam a média ± SD de valores de três experiências independentes; *

P

. 0,05

Para confirmar o efeito de miR-370 sobre-expressão em células de câncer de próstata (Figura 1), quantificamos a expressão de FOXO1 em células de câncer de próstata. Observamos que FOXO1 é regulada negativamente em células de câncer de próstata (Figura S1A e Figura 1A); confirmando que a sobre-expressão de miR-370 regula negativamente o gene alvo miR-370

FOXO1

em células de câncer de próstata.

proliferação de células cancerosas da próstata induzida por miR-370 é modulada por FOXO1

Para investigar se FOXO1 pôde reprimir a proliferação induzida por miR-370,

FOXO1

(sem o 3′-UTR) e

FOXO1

3′-UTR (com o 3′-UTR) foram transfectados em células de cancro da próstata de miR-370 que sobre-expressam. Como esperado expressão, ectópica de chumbo FOXO1 às mudanças significativamente maiores na expressão de

p27

KIP1

,

p21

Cip1

e ciclina D1 mRNA do que FOXO1-3’UTR (Figura 6A). Em particular, após a transfecção de um gene repórter FOXO1 e miR-370 em células de cancro da próstata PC3 e DU145, a actividade da luciferase pode ser restaurada por sobre-expressão de FOXO1 e parcialmente resgatados por transfecção do FOXO1-3′-UTR (Figura 6B). Além disso, a taxa de crescimento de ambas as células de cancro da próstata PC3 e DU145 foi inibida a uma extensão significativamente maior por co-transfecção de miR-370 e FOXO1 do que a co-transfecção de FOXO1-3′-UTR e miR-370 (Figura 6C). Em conclusão, estes resultados sugerem que a proliferação de células do cancro da próstata induzida por miR-370 está diretamente mediado pela supressão da

FOXO1

.

Real-time PCR análise de

p21

Cip1 , p27

KIP1

e ciclina D1 expressão de mRNA nas células indicadas.

GAPDH foi usada como um controlo de carga de 48 horas após a transfecção. B, ensaio de actividade de luciferase das células transfectadas indicados com um repórter FOXO1 48 horas após a transfecção. C, o ensaio de MTT de células de câncer de próstata transfectadas com miR-370 mímico, co-transfectadas com miR-370 e FOXO1, ou co-transfectadas com miR-370 e FOXO1-3′-UTR.

discussão

neste estudo, demonstrámos que o miR-370 é regulada positivamente em linhas celulares de cancro da próstata, em comparação com as células epiteliais normais da próstata primários. A sobre-regulação de miR-370 promoveu a /S transição G1 do ciclo celular em células de cancro da próstata, que se correlacionou com a regulação negativa da cinase dependente da ciclina (CDK) inibidores de p27

KIP1 e p21

Cip1. Por outro lado, a inibição da proliferação de células de cancro de miR-370 reduzida próstata, upregulated p27

KIP1 e p21

Cip1, e atrasou a transição G1 /S. MiR-370 upregulated o ciclo celular regulador de ciclina D1, visando diretamente o

FOXO1

3′-UTR, demonstrando que FOXO1 é regulada por miR-370 em células de câncer de próstata. Colectivamente, estas descobertas sugerem que a supra-regulação de miR-370 pode promover a iniciação e progressão do cancro da próstata.

Demonstrou-se que a expressão FOXO1 é regulada por vários microARNs, tais como o miR-223, o miR-182, miR-27a, miR-139 e miR-96 [39] – [43]. Destes, alguns microARNs pode ser desregulado no cancro da próstata, tais como o miR-27a, o miR-182 [41], [44].