câncer

Abstract

próstata é o câncer mais comum dos homens no mundo ocidental, e novas abordagens para a próstata são necessários redução do risco de câncer. compostos fenólicos derivados de plantas atenuar o crescimento do câncer de próstata em modelos pré-clínicos através de vários mecanismos, o que está de acordo com achados epidemiológicos que sugerem que o consumo de dietas à base de plantas está associada com baixo risco de câncer de próstata. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de uma mistura lignana-stilbenoid romance em células cancerosas humanas da próstata PC-3M-luc2

in vitro Comprar e em xenoenxertos ortotópicos. Lignana e extrato rico em stilbenoid foi obtido a partir de pinheiro silvestre (

Pinus sylvestris

) nós. extrato de pinheiro nó, bem como estilbenóides (pinosylvin metilo e pinosylvin), e lignanas (matairesinol e nortrachelogenin) presentes no extrato de pinheiro nó mostrou eficácia antiproliferativa e pró-apoptótica em ≥40 concentração? M

in vitro

. Além disso, pinho extrato nó estilbenóides derivados aumentada necrose tumoral a apoptose induzida ligando (TRAIL) indutor de apoptose relacionado com o factor já em concentrações ≥10 uM. Em xenoenxertos PC-3M-luc2 ortotópico de ratinhos portadores imunocomprometidos, três semanas de exposição perorai de extracto de pinho nó (52 mg de linhanos e estilbenóides por kg de peso corporal) foi bem tolerada e mostrou eficácia anti-tumorigénica, demonstrada pela análise multivariada combinando essencial marcadores de crescimento do tumor (volume do tumor, vascularização e proliferação de células). pinosylvin metilo, pinosylvin, matairesinol, nortrachelogenin, bem como o resveratrol, um metabolito de pinosylvin, foram detectados no soro para uma concentração total de 7-73 pM, confirmando a biodisponibilidade de linhanos derivados extrato de pinheiro nó e estilbenóides. Em resumo, os nossos dados indicam que o extrato de Pine Knot é um romance e rentável fonte de resveratrol, pinosylvin metilo e outros lignanas bioativos e estilbenóides. Pine extrato nó mostra eficácia anticarcinogenic no modelo de cancro da próstata pré-clínico, e nossa

in vitro

dados sugerem que os compostos derivados do extrato pode ter potencial como novos chemosensitizers a TRAIL. Estas descobertas promover mais pesquisas sobre aplicações relacionadas com a saúde de bioquímicos madeira

Citation:. Yatkin E, Polari L, Laajala TD, Smeds A, Eckerman C, Holmbom B, et al. (2014) Novel Lignan e stilbenoid Mistura Mostra anticarcinogenic Eficácia em pré-clínica PC-3M-luc2 Modelo do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (4): e93764. doi: 10.1371 /journal.pone.0093764

editor: Rajesh Agarwal, da Universidade do Colorado em Denver, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Janeiro, 2014; Aceito: 08 de março de 2014; Publicação: 03 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yatkin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pelo FIBIC finlandesa Bioeconomy Cluster, o programa BioRefine da financiadora finlandesa de Tecnologia e Inovação, e da Academia da Finlândia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum dos homens na América do Norte, Europa Ocidental, Europa Oriental e Escandinávia. A longa história natural do CaP apresenta uma janela de tempo relativamente amplo para intervenções dietéticas ou farmacológicos que podem se manifestar como redução na incidência, a recorrência, morbidade ou a progressão da doença [1]. fatores de risco modificáveis ​​propostas para CaP que fornecem potenciais alvos para a prevenção incluem inflamação, hormônios esteróides e seus receptores, obesidade, hipercolesterolemia e fatores dietéticos [2]. compostos fenólicos naturais, que possuem propriedades anticancerígenas, podem oferecer possibilidades interessantes para a redução da incidência do cancro [3], [4]. No entanto, mais dados sobre sua eficácia e mecanismos de ação é necessária a partir de modelos pré-clínicos relevantes, a fim de selecionar os compostos ideais ou misturas para ensaios clínicos e desenvolvimento de produtos.

As árvores são uma fonte abundante de compostos fenólicos, estruturalmente idênticos ou semelhantes aos de plantas comestíveis [5]. Estes compostos podem ser facilmente isolado a partir da madeira por extracção hidrófilo após a remoção dos extractos liofilicos por extracção com hexano [6]. Wood-derivado extractos são, portanto, uma fonte de custo-eficaz de compostos fenólicos naturais, e uma opção atraente para o desenvolvimento de novos produtos de promoção da saúde.

fenólicos de plantas, tais como ligninas e estilbenóides, modulam vários processos biológicos importantes em células de mamíferos [7], [8], e apresentam propriedades anticancerígenas em modelos pré-clínicos de CaP. Centeio ou linhaça contendo dietas, que têm um elevado teor de lignano, bem como uma dieta suplementada com um derivado de madeira planta lignano, 7-hydroxymataresinol (HMR), inibem o crescimento de CaP em

In vivo

[ ,,,0],9], [10], [11], [12]. Da mesma forma, estilbenóides derivados de plantas, o resveratrol (RV) e pterostilbene têm sido relatados para suprimir o crescimento de CaP

In vivo

[13]. Vários mecanismos possíveis, pelo qual lignanas e estilbenóides podem exercer suas ações anticancerígenas em CaP foram identificados, incluindo a parada do ciclo celular e indução de apoptose [14], [15], a inibição da proliferação celular [16], [17], a vascularização do tumor [18], a modulação do perfil de citocinas [19], e a sensibilização de células de cancro para a morte celular programada [20], [21], [22].

factor de Necrose tumoral-relacionadas ligando Indutor de apoptose (TRAIL ) apoptose mediada foi recentemente identificada como um alvo interessante para linhanos e estilbenóides. TRAIL é uma proteína que funciona como um ligando, o qual activa uma via de sinalização da morte especialmente nas células cancerosas, com o mínimo de toxicidade para tecidos normais [23]. Resistência a TRAIL é comum em APC, e compostos que sensibilizam CaP para TRAIL estão atualmente sob investigação ativa. Curiosamente, linhanos, como matairesinol (MR), e nortrachelogenin (NTG), bem como RV aumentar a actividade antitumoral de TRAIL em células CaP [21], [22] ou xenoenxertos [18].

Experimental estudos sugerem, assim, que lignanas naturais e estilbenóides atenuar o crescimento PCA através de inúmeros mecanismos de ação. É, portanto, razoável propor que a combinação dos dois grupos de compostos fenólicos podem oferecer vantagens adicionais em relação ao uso de compostos individuais. No entanto, não há dados publicados existe sobre os efeitos combinados de lignanas e estilbenóides em configurações experimentais controladas. Neste estudo, demonstrou efeitos inibidores do crescimento de extrato de pinheiro knotwood (PKE), rico em lignanas e estilbenóides, em PC-3M-luc2 células CaP humanos

in vitro

e

in vivo

. Além disso, foi confirmada a biodisponibilidade de compostos fenólicos PKE-derivados, e identificaram os compostos susceptíveis de explicar os efeitos anticancerígenos de PKE.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Animal cuidado e uso foi efetuada de acordo com a Lei finlandesa sobre as leis de experimentação animal e da UE, orientações e recomendações. Todos os estudos foram aprovados pelo Conselho em Experimentação Animal nacional na Finlândia (número de licença 1993 /04.10.03 /2011).

Preparação e Caracterização Química de PKE

nós de pinheiro silvestre foram obtidos a partir de um industrial processo de fábrica de celulose (a chamada pedra armadilha) (UPM Tervasaari, Valkeakoski, Finlândia). Os laços foram moídos, peneirados ( 2 mm), liofilizou-se, e extraiu-se sequencialmente com

N

-hexano a 90 ° C (3 × 5 minutos) e de etanol-água (95:5 em vol .) a 100 ° C (3 x 5 min) utilizando extracção por solvente acelerada. O PKE foi caracterizada quimicamente pela detecção GC-ionização de chama (FID), GC-MS e por cromatografia de exclusão de tamanho de elevado desempenho com detecção de dispersão de luz evaporativo (ELSD-HPSEC). A GC-FID, GC-MS, e HPSEC-ELSD análises foram realizadas como descrito anteriormente [24]. GC-FID foi utilizado para quantificação dos componentes do extracto que eluiram da coluna de CG. A quantificação foi baseada na análises em triplicado com o mesmo extracto. ácido Heneicosanoic foi utilizado como padrão interno, com os coeficientes de resposta 1,00. Os compostos individuais detectadas por GC-FID foram identificados por GC-MS, utilizando as próprias bibliotecas espectrais do laboratório comercial e. A distribuição da massa molar dos componentes PKE foi determinada por HPSEC-ELSD

Os principais grupos de compostos na PKE foram:. Linhanos (16%), estilbenóides (17%), os ácidos de resina oxidados (20%), Os ácidos de resina (24%), e compostos de maior massa molar (550-4000 Da, 18%). As concentrações (% em peso de extrato seco) dos principais compostos fenólicos GC-detectável no PKE foram pinosylvin monometil (MEPS, 10,2%), GTN (7,0%), pinosylvin (PS, 4,0%), MR (1,5%) , ácido abiético (1,5%), e pinostilbene (0,4%). Os ácidos de resina CG-detectável representavam 21,8% do peso seco do PKE. Pequenas quantidades ( 0,1-0,5%) de lignanas HMR, ácido conidendric, secoisolariciresinol e todolactol A foram encontrados

Referência e Teste compostos

A preparação e purezas do HMR lignanas, MR. , NTG, secoisolarici-, larici-, cyclolarici-, 7-oxomatai-, pino- e medioresinol, α-conidendrin, enterolactone, 7-hidroxienterolactona, MR

d

6 e enterolactone-

d

6 foram descritos anteriormente [25], [26]. O PS e os deputados estilbenos e do ácido resina de ácido dehidroabiético (pureza 95%) foram preparados no Laboratório de Madeira e Papel Química da Åbo Akademi University por isolamento a partir de madeira e purificação por cromatografia flash (Biotage flash 40i) com colunas de sílica. RV e enterodiol foram da Sigma-Aldrich Co, pinostilbene da TCL Pharma Chem., Inc (Vaughan, ON, Canadá) e

O

ácido -methylpodocarpic, ácido neoabietic e ácido abiético da Helix Biotech Corp. (CanSyn Chem Corp., Toronto, Canadá).

a fim de estudar os efeitos combinados de pura lignanas PKE-derivado e estilbenóides

in vitro

, preparamos uma mistura lignana-estilbeno (mistura LS), contendo os quatro compostos PKE derivados mais abundantes em proporções molares semelhantes a PKE (Tabela 1).

Cultura e proliferação celular, apoptose e ciclo celular Assays

células PC-3M-luc2 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) foram cultivadas em meio isento de vermelho de fenol de Dulbecco modificado de Eagle suplementado com 50 UI /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor ( Invitrogen, Paisley, Reino Unido). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /atmosfera de ar a 37 ° C.

Para o ensaio de proliferação de células, as células PC-3M-luc2 foram semeadas numa placa de 96 poços (1500 células por poço). Dimetil sul f óxido soluções de estoque de PKE (1-100 mg /l), os compostos purificados (1-100 uM) ou os controlos dimetil sulfóxido preparadas em meio de cultura foram adicionados aos poços (seis repetições). Após 48 horas, a proliferação celular foi medida com kit ELISA de Proliferação Celular BrdU imunoensaio (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

Para o ensaio de apoptose, as células PC-3M-luc2 foram semeadas em uma 96 placa -bem. Quando 60-80% confluentes metade do meio foi removido e substituído com meio contendo os compostos derivados de madeira (concentrações finais 1-40 mg /L). Após 48 horas, as células foram descoladas com tripsina e rebentadas com tampão de citrato 0,4 M em PBS contendo 0,3% de Triton-X (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO). Os núcleos e os fragmentos nucleares foram marcadas com iodeto de propídio (Sigma). Para determinar a fracção de eventos sub-G0 /G1, as amostras foram analisadas com citometria de fluxo (BD LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Para avaliação da sensibilidade TRAIL, as células foram tratadas com a combinação dos compostos da madeira derivado (como acima) e de TRAIL humano /Apo2L (cat. No. C-63600, Promokine, Heidelberg, Alemanha) em concentrações de 3, 25, 50 e 100 . ng /ml

xenoenxertos PC-3M-luc2 ortotópico em ratinhos atímicos

Hsd: atímicos nu – Foxn1

camundongos machos nu (5-6 semanas de idade) comprados de Harlan Laboratories (Horst, Holanda) foram alojadas em condições assépticas no Laboratório Central animal da Universidade de Turku. Os ratos foram aclimatizados durante duas semanas; fornecida com a dieta ingrediente natural livre de soja (RM3, SDS, Essex, UK) e água da torneira

ad libitum

.

células PC-3M-luc2 usados ​​no experimento de xenotransplante ortotópico foram cultivadas em RPMI 1640 fenol-vermelho livre médio suplementado com 50 UI /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e soro bovino a 10% inactivado pelo calor fetal. As células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /atmosfera de ar a 37 ° C. As células PC-3M-luc2 (1 × 10

6 células em 20 ul simples meio RPMI 1640) foram inoculadas em dorsolateral da próstata através de uma incisão abdominal sob anestesia com isoflurano. Para alívio da dor, ratos receberam buprenorfina (Temgesic, 0,05-0,1 mg /kg

sc

.) E carpofen (Rimadyl, 5 mg /kg

sc

.) Antes e após a operação, respectivamente. O crescimento do tumor foi seguido por imagiologia IVIS bioluminescência com lúmenes II, equipado com XGI-8 gás Anestesia Sistema (Caliper Life Sciences, Runcorn, Reino Unido). Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano, injectou

ip

com 150 mg /kg de D-luciferina (Xenogen cat. N. XR-1001, Oregon, EUA) 10 minutos antes da imagiologia, e bioluminescência foi quantificada utilizando LivingImage 4.09A software de carbono (Xenogen).

Uma semana após a inoculação, os animais livres de tumor foram identificados por imagem de bioluminescência e excluídos do estudo. ratinhos portadores de tumor foram divididos em veículo (controlo), de dose baixa (32 mg /kg) ou dose elevada (160 mg /kg) grupos PKE. dose baixa e alta continha aproximadamente 5.0 e 5.4, e 25 e 27 mg de lignanas e estilbenóides, respectivamente. PKE foi dissolvido num veículo que continha 10% (v /v) de etanol absoluto e 90% (v /v) de óleo de milho. Ambos veículo e PKE foram tratadas por gavage

p.o.

Diária. Os murganhos foram pesados ​​semanalmente, e imagem de bioluminescência foi efectuada duas vezes por semana.

Durante a terceira semana de tratamento de amostras de urina de 24 h foram recolhidos em gaiolas metabólicas (5-6 ratos por gaiola). A urina foi recolhida em frascos contendo 0,15 M de azida de sódio e ácido ascórbico 0,56 M como conservantes. As amostras de urina foram centrifugadas e armazenadas em -20 ° C até serem analisadas.

Após o tratamento de três semanas, os ratinhos foram sacrificados com CO

2 asfixia seguido por deslocamento cervical. O sangue foi recolhido através de punção cardíaca, centrifugado, e o soro foi separado e mantido em -70 ° C até serem analisadas. Os tumores foram dissecados e pesados, e o tamanho do tumor foi medido com um compasso de calibre a três dimensões. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: Volume (mm

3) = (comprimento x largura x altura) × π /6. Os tumores foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra e processados ​​para inclusão em parafina e utilizado para imuno-histoquímica.

Análise de lignanas e estilbenóides mouse soro e urina

O soro (50 ul) e na urina ( 300 ul) e as amostras foram hidrolisadas em fase sólida extraída como anteriormente descrito, com algumas modificações [25], [27]. Para a hidrólise, um preparado de fresco β-glucuronidase /-sulphatase em 10 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0) foi adicionado a amostras de soro e de urina e incubou-se durante 19 h a 37 ° C. Após a hidrólise, foram adicionados padrões internos às amostras: MR

d

6 para lignanas vegetais e estilbenos, EL-

d

6 para enterolignans (concentrações finais ~ 1 ug /ml), e

o

ácido -methylpodocarpic para os ácidos resínicos (concentração final ~ 3 ug /ml). A fase sólida extraída e evaporou-se amostras de soro e de urina [25] foram redissolvidos em 150 uL e 500 uL de metanol /0,1% de ácido acético a 20:80 (v /v), respectivamente. Os componentes PKE e seus metabolitos foram quantificados utilizando HPLC-MS /MS com monitorização de iões múltiplos no modo de ião negativo, tal como descrito anteriormente [24]. As várias transições de monitoramento de íon otimizadas foram o ião molecular desprotonado e os seguintes fragmentos em MS

2 (

m /z

); PS 169 18; MEPS 182 20; RV 143, 22; pinostilbene 225. Os ácidos de resina formada há fragmentos em MS

2. As tensões cone utilizados foram 40 V para os estilbenos e 48 V para os ácidos de resina. As energias de colisão eram cerca de 20 eV para os estilbenos e 5,0 eV para os ácidos de resina. Os parâmetros ms para a analisadas linhanos tem sido descrito anteriormente [26]. As quantificações foram realizados usando soluções padrão, contendo os padrões internos e seis níveis de concentração de substâncias a analisar, como descrito anteriormente [26].

A imuno-histoquímica e Detecção de células apoptóticas em amostras de tumor

Para de von Willebrand fator (vWF, a diluição: 1:4000, ab6994-100, Abcam, Cambridge, UK) e fosfo-histona H3 (pH-H3, a diluição: 1:200, Ser10, a sinalização celular) imuno-histoquímica, secção de tecido foram desparafinados, reidratadas e incubou-se em 10 mM de Tris-EDTA a pH 9 (para a coloração de vWF) ou em 10 mM de citrato de sódio a pH 6 (para a coloração de pH-H3) de tampão, num forno de micro-ondas para a recuperação de antigénio. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2. Após lavagem com PBS, as secções foram incubadas com albumina de 3% de soro de bovino (BSA) durante 10 minutos, e marcadas com vWF ou anticorpos pH-H3 durante 60 minutos à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a + 4 ° C, respectivamente. anti-coelho de peroxidase de rábano (DAKO sistema de visionar, Dako) polímero marcado foi usado como um anticorpo secundário. Diaminobenzidina (Dako) foi aplicada às secções seguidas de hematoxilina de Mayer e montagem.

O desoxinucleotidil transferase de biotina-dUTP nick end rotulagem terminal (TÚNEL) método foi utilizado para determinar células apoptóticas em secções de tumores. A análise foi realizada utilizando ApopTag peroxidase in situ de apoptose kit de detecção (Chemicon International, Hampshire, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. Os cortes foram desparafinados, re-hidratados e tratou-se com tampão de citrato de sódio 10 mM em micro-ondas para a recuperação de antigénio. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2. Para o controlo positivo, uma secção foi incubada com ADNase I (Invitrogen) durante 30 min a + 37 ° C. Para o TUNEL, as secções foram incubadas com 0,8 U /ul TdT mistura reaccional: tampão de TdT, 4 L /transferase ul, CoCl 25 mM

2 (transferase terminal, Roche, Mannheim, Alemanha), biotina-16-dUTP (Roche ) e água MilliQ; e para o controlo negativo, uma secção foi incubada com TUNEL mistura de reacção sem transferase durante uma hora a + 37 ° C. TUNEL reacção foi parada com NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM em dH

2O (15 min à temperatura ambiente). Locais não específicos foram bloqueados com BSA a 3% /PBS durante 30 min à temperatura ambiente. ExtrAvidine®-peroxidase 1:500 (Sigma) foi aplicada em 1% de BSA /PBS durante 30 min a + 37 ° C, após o que foi aplicada diaminobenzidina e as secções foram coradas com hematoxilina de Mayer e montadas.

Quantificação de proliferação e apoptose índices e densidade dos vasos sanguíneos e Comprimento

cortes corados foram digitalizados com um microscópio virtual (microscópio Virtual digital, soft Imaging System, Olympus, Alemanha). O número eo comprimento dos navios vWF-positivos foi quantificado em três ou quatro áreas selecionadas usando a ferramenta de medição do programa dotSlide (Soft Imaging System). A quantificação de pH-H3 e TUNEL de células positivas em secções de tumores foi levada a cabo com funções de mercadorias desenvolvido para a análise de imagens de tecido por Quva Ltd (Tampere, Finlândia). Em primeiro lugar, as imagens obtidas a partir de lâminas examinadas foram normalizados para a intensidade de cor e variações. O processamento foi continuado por thresholding imagem, que detecta as áreas com a cor apropriada para ser considerado como alvo as células coradas positivamente. Finalmente, as detecções estranhos foram filtrados por tamanho e forma da informação, e as células resultantes foram visualizados em manchas vermelhas sobre a imagem original.

Análises Estatísticas

As análises univariadas foram realizadas utilizando a versão GraphPad Prism 4.00 para Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Em dados distribuídos normalmente, o one-way análise de variância e teste post-hoc de Tukey foram utilizados; caso contrário, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis não paramétrico ou t-teste. Todos os dados são apresentados como média ± EPM grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

p

. 0,05

comparações multivariadas par a par de meios do grupo (digamos μ1 e μ2) foram testados com a distância de Mahalanobis (MD) 🙁 1)

Mahalanobis é uma estatística multivariada bem conhecido, que incorpora a correlação linear de co-variáveis ​​por meio da matriz de covariância-variância

S

, com dimensão igual ao número de co-variáveis ​​[28]. Ao acumular informações complementares de factores interligados e ter sensibilidade para padrões diferentes das grandes tendências [29], MD é uma estatística conveniente para testar os efeitos do tratamento mais subtis potencialmente perdidas pelos testes univariados. Em casos especiais, MD reduz a distância euclidiana normalizada, se

S

é uma matriz diagonal, e com a distância euclidiana ordinária, se

S

é uma matriz unitária, e, portanto, ligações de perto para o convencional

t

estatística teste de marcadores de crescimento tumoral independentes. A significância estatística da distância

D

foi avaliada por permutação aleatória dos rótulos de classe nos testes de duas amostragens (Veículo vs. baixa dose ou veículo vs. alta dose) [30]. As distribuições nulos foram obtidos executando 100.000 simulações de tais distâncias gerados aleatoriamente eo empírico

p

-Valores foram definidos como a proporção das distâncias aleatórias superiores ou iguais à distância observada

D

.

resultados

PKE e sua proliferação celular Componentes Inibição PC-3M-luc2 e induzir a apoptose

in vitro

PKE significativamente atenuada PC-3M-luc2 proliferação celular em ≥40 mg /L (Fig. 1A), demonstrada por incorporação de BrdU reduzida. Em consonância com isso, os principais constituintes da PKE, estilbenóides (deputados e PS), bem como lignanas (MR e NTG) cada proliferação celular significativamente inibido pelo 40-100 concentração? M (Fig. 1B). Além disso, a combinação destes quatro compostos (MPE, PS, MR, e GTN), na mesma proporção que a presente em PKE (lignan-estilbeno, LS, mistura), reduziu a incorporação de BrdU de um modo semelhante ao extracto inicial (fig. 1C). PKE (40 mg /l) e mistura LS (40 uM), ambas aumento da taxa de apoptose, demonstrado por análise de citometria de fluxo (Fig. 2A). PKE paragem do ciclo celular induzida, isto é, aumentou a fracção de células não apoptóticas em G0 /G1 (Fig. 2B), e, respectivamente, diminuiu a fracção de células em S e G2 /M fases. a apoptose induzida por TRAIL-PC-3M luc2 células Além disso, PKE (10 e 40 mg /ml) para sensibilizados (Fig. 3A). mistura LS e todos os testados compostos PKE derivados (MEPS, NTG, PS, MR, e RV), exceto o ácido abiético, aumentou significativamente a apoptose mediada por TRAIL (Fig. 3B), PS, os deputados, e do Sr. mostrando os efeitos mais pronunciados .

) células

a foram tratados com PKE ou uma mistura dos seus principais linhanos e estilbenóides (mistura LS) durante 48 horas. B) As células foram tratadas com compostos derivados PKE individuais durante 48 horas. taxa de proliferação celular expressos como percentagem de controlo foi medido com o ensaio de BrdU. Os dados são médias de três experimentos independentes ± SEM. A significância estatística foi determinada por não paramétrico do teste t para cada tratamento em comparação com o respectivo tratamento com veículo (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001

taxas de apoptose, o número de células na fase G0 /G1 são expressas em relação ao veículo de controlo (Ctrl = 1). As células foram tratadas com compostos de teste durante 48 horas e em fase taxa de apoptose e o ciclo celular foi determinada com o citómetro de fluxo. LS, mistura de principais lignanas e estilbenos PKE; Eurodeputados, pinosylvin éter monometílico; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, o ácido abiético; RV, resveratrol. Os dados são médias de três experimentos independentes ± SEM. A significância estatística foi determinada por não paramétrico do teste t para cada tratamento em comparação com o respectivo Ctrl. * P 0,05, ** p 0,01, *** p .

0,001

) células A tratada com PKE em combinação com concentrações crescentes de TRAIL humano (0-100 ng /ml), valores são percentagens de fragmentação nuclear. B) As células tratadas com PKE, LS mistura, ou com compostos PKE individuais em combinação com TRAIL humano (25 ng /mL), os valores são relativos taxas de apoptose (Ctrl = 1). As células foram tratadas com compostos de teste durante 48 horas e fragmentação nuclear foi determinada com o citómetro de fluxo. LS, mistura de principais lignanas e estilbenos PKE; Eurodeputados, pinosylvin éter monometílico; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, o ácido abiético; RV, resveratrol. Os dados são médias de três experimentos independentes ± SEM. A significância estatística foi determinada por não paramétrico do teste t para cada tratamento em comparação com o respectivo tratamento com veículo (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Efeito da PKE em Ortotópico PC-3M-luc2 Xenoenxerto Volume, proliferação celular e angiogênese

. três semanas a ingestão diária de PKE foi bem tolerada, e não há sinais de efeitos adversos foram observados em qualquer ponto de tempo. PKE reduziu significativamente o índice de proliferação (Fig. 4A) e o comprimento dos vasos sanguíneos (isto é, de perímetro) nos tumores PC-3M-luc2 (Fig. 4B). Uma tendência para redução bioluminescência e o volume do tumor foi observada em CaP a dose mais elevada PKE grupo (160 mg /kg) (Fig. 4C e D). Não se observaram alterações significativas no índice de apoptose, tal como quantificado a partir de secções de tumores de TUNEL-corados (dados não apresentados). A comparação multivariada do volume do tumor extirpado, os índices de bioluminescência tumor log-transformados, de apoptose e proliferação, e densidade dos vasos sanguíneos e comprimento foi realizada utilizando a estatística MD (Eq. 1). Quando a resposta foi testada em termos do efeito combinado destas 6 co-variáveis ​​(Fig. S1), houve uma diferença significativa entre os grupos PKE de veículos e de alta dose (p = 0,0051, Fig. 5a), enquanto o veículo eo grupos PKE baixa dose foram semelhantes (p = 0,4195, Fig. 5B). Curiosamente, a avaliação conjunta dos co-variáveis ​​e suas interações claramente separado do veículo e grupos PKE de alta dose (Fig. 5C, com as 3 características mais importantes visualizado). A inferência tirar desta análise combinada era profundamente diferente das análises uni independentes (Fig. 4); por exemplo, a abordagem multivariada detectou que alguns tumores tinham reduzido vascularização (

navio de comprimento

), enquanto outros tinham reduzido tamanho (

tumor volume de

), e, portanto, deu uma visão multidimensional dos efeitos do tratamento . As medições do tumor originais são mostradas no material complementar, tal como bivariável (Fig. S1) e parcelas univariada (Fig. S2). A estrutura de variância-covariância calculada

S,

após a escala a matriz de correlação, é mostrado na Fig. S3. Como esperado, os fatores relacionados, tais como o volume do tumor e bioluminescência tumor ou densidade de vasos e comprimento do navio, foram altamente correlacionados, e suas distâncias foram efetivamente agrupadas na análise MD (Fig. S3).

A) PKE diminui índice de proliferação celular. Imagens representativas de pH-H3-colorações imunológicas são mostrados. B) PKE diminui o comprimento dos vasos sanguíneos. Imagens representativas de vWF-colorações imunológicas são mostrados. C) Bioluminescência dos tumores, quantificados quinzenal pelo

in vivo

imagem. volumes D) do tumor no sacrifício. Os ratinhos foram tratados diariamente com o veículo (n = 11), PKE 32 mg /kg de pc (n = 10) ou PKE 160 mg /kg de pc (n = 11) durante três semanas. Os dados são expressos como média ± SEM. A significância estatística foi determinada por análise de uma via de variância e teste post-hoc de Tukey. * P 0,05. Barras de escala, 100 mm.

C) O volume do tumor, comprimento e proliferação de vasos índice foram detectados como os mais importantes fatores de diferenças na análise multivariada. O hiperplano indica que dois dos grupos (veículo na dose de preto e alta em verde) foram linearmente separáveis ​​quando os três fatores foram considerados em conjunto. (Hiperplano: 100.55 = 0,104 × Tumor volume de + 0,895 × Proliferação índice de + 21,1 × comprimento do navio)

a fim de avaliar os fatores que estavam mais essencial para distinguir o grupo PKE alta dose do grupo controle, foi realizado um teste exaustivo do MD para diferentes combinações das 6 co-variáveis. Os efeitos mais proeminentes foram detectadas como uma combinação do volume do tumor, o índice de proliferação e comprimento do navio. Investigação das interações entre esses três marcadores revelou que, mesmo se as co-variáveis ​​individuais por si só não foram informada o suficiente para distinguir os dois grupos, quando considerados em conjunto, os veículos e altas doses de grupos PKE foram linearmente separáveis ​​com um hiperplano (Fig. 5C). Além disso, ainda que o veículo e diferença grupo de dose baixa não foi estatisticamente significativa, a tendência geral entre os três grupos sugeriu um aumento do efeito anti-tumoral com um nível de aumento da dose (como visto na ordem das nuvens preto, verde e vermelho na Fig. 5C).

as concentrações de fenólicos compostos no soro e urina de ratos portadores de tumor

concentrações micromolares de NTG, e os deputados foram detectados no soro de animais expostos à dose mais elevada de PKE ( Mesa 2). Os ácidos de resina que estavam presentes no PKE não foram detectados nas amostras de soro ou de urina. Curiosamente, concentrações significativas de RV, que é o metabólito monohidroxilados do PS, assim como pinostilbene, um metabolito de MEPS, foram detectadas no soro e na urina em ratos alimentados com a PKE (Tabela 2). Além disso, as concentrações de MR e HMR e seus metabolitos enterolactona, enterodiol e 7-hidroxienterolactona, bem como as concentrações de MEPS, PS, NTG, e pinostilbene significativamente aumentada em comparação com o controlo (Tabela 2). Estilbeno e lignan metabolitos estavam presentes no soro de 15 min-3 h após a última administração (dados não mostrados), e as concentrações mais elevadas foram medidas a 2 h (Tabela 2). O perfil dos metabolitos na urina (recolha de 24 horas) foi muito semelhante ao que no soro (dados não mostrados).

Discussão

Estudos epidemiológicos e pré-clínicos sugerem uma relação inversa entre o consumo de alimentos ricos em polifenóis e a incidência de doenças crónicas, incluindo o cancro [3], [7], [31]. Em particular, lignanas e estilbenos, e seus metabolitos, são candidatos atraentes para redução do risco de CaP. Neste estudo, nós demonstramos efeitos anticancerígenas do extracto de pinheiro-silvestre nó (PKE), uma mistura rica em lignanas e estilbenóides,

in vitro

e

in vivo

num modelo de xenotransplante CaP ortotópico