Abstract

O desenvolvimento de resistências aos fármacos anti-cancerígenos convencionais compromete a eficácia do câncer tratamentos. No caso de agentes quimioterapêuticos de direccionamento de ADN, as células cancerígenas podem exibir tolerância para as lesões do ADN induzidas por drogas e /ou de reparação do ADN aumentada. No entanto, o papel da resposta ADN danos (DDR) e de reparação do ADN na quimiorresistência este tem ainda a ser definido. Para fornecer insights nesta área desafiadora, analisamos a assinatura de reparo do DNA de linhas de células 7 câncer tratados por 5 drogas citotóxicas utilizando um ensaio de reparo do DNA funcional multiplexado desenvolvido recentemente. Essa abordagem abrangente considerada a complexidade e redundância das diferentes vias de reparação de DNA. Os dados foram analisados ​​utilizando métodos de agrupamento e testes estatísticos. Este método de reparação perfis de ADN definido grupos relevantes com base em semelhanças entre diferentes medicamentos, proporcionando assim informações relativas ao seu mecanismo dominante de ação no nível do DNA. Da mesma forma, as semelhanças entre diferentes linhas celulares, presumivelmente identificado DDR funcional idêntica, apesar de um elevado nível de heterogeneidade genética entre linhas celulares. Nossa estratégia tem uma nova luz sobre a contribuição de reparação sub-caminhos específicos para a citotoxicidade induzida por drogas. Embora outras caracterizações moleculares são necessárias para desvendar os mecanismos subjacentes totalmente os nossos resultados, a nossa abordagem mostrou-se muito promissora para interrogar a complexidade da resposta de reparação do ADN. De facto, poderia ser utilizada para prever a eficácia de uma determinada droga e a quimiossensibilidade de pacientes individuais, e, assim, para escolher o melhor tratamento para cancro cuidados individualizado

citação:. Um Forestier, Sarrazy F, Caillat S, Vandenbrouck Y, Sauvaigo S (2012) Assinatura Reparo do DNA funcional de linhas celulares de cancro expostas a um conjunto de citotóxicos Anticancer Drugs Usando um multiplexada enzimática Reparação Ensaio sobre Biochip. PLoS ONE 7 (12): e51754. doi: 10.1371 /journal.pone.0051754

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Arábia Saudita

Recebido: 24 Julho, 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicado: 31 de dezembro 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Forestier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer aos Technologies programa transversal CEA para a saúde de apoio, bem como Gravit para seu acompanhamento financeiro. Este trabalho também foi parcialmente financiado pela Comissão Europeia (Contrato LSHB-CT-2006-037575) – projeto ‘Ensaio Cometa e célula matriz para ensaios de genotoxicidade rápido e eficiente “(comics). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar da pesquisa ativa e desenvolvimento de terapias dirigidas a públicos específicos, resistência a drogas citotóxicas padrão ainda representa um desafio no tratamento do câncer. Muitas drogas anticancro convencionais, tais como agentes alquilantes, antimetabolitos e inibidores da topoisomerase induzir lesões no ADN como parte do seu efeito citotóxico. Um factor importante que afecta o efeito citotóxico destas drogas é a capacidade das células tumorais para sentir uma grande variedade de lesões do ADN e eliciar uma resposta coordenada, incluindo a activação da transcrição, a paragem do ciclo celular, apoptose e processos de reparação do ADN [1], [2] . Esta resposta a danos no ADN global (DDR) pode levar a tolerância para as lesões do ADN induzida por drogas ou para reparação melhorada [3], [4], impedindo um resultado ideal para os pacientes após a quimioterapia. A importância crítica da DDR é demonstrada pela existência de mutações na p53, K-ras, vias PIK3CA associados com a resistência ao tratamento [5], [6]. os mecanismos de reparação de ADN são um componente fundamental da RDA, que representa um conjunto de vias altamente organizada que se desenvolveram para lidar com vários tipos de danos no ADN [7] – [9]. Reparação de base /modificações de açúcar – com exceção de rupturas dos filamentos – se baseia em mecanismos de excisão /síntese. reparação por excisão de base (BER) pode lidar com pequenas bases danificadas e locais não básicos [10], ao passo que o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) lida com lesões que distorcem hélice [11]. Recentemente, reparação incisão de nucleótidos (NIR) tem sido descrito como uma alternativa tanto BER e NER [12]. Algumas proteínas possuem funções que se sobrepõem dentro e entre BER e NER vias [13] e proteínas atribuídas a uma de vias podem interagir com as proteínas das outras vias [14] – [16]. Finalmente, intercadeias ligações cruzadas (ICLs) são reparadas por meio de vários mecanismos, ou recombinação-dependente ou independente de recombinação, com possibilidade de cooperação de proteínas de NER e incompatibilidade de reparação de vias (MMR) [17], [18].

as proteínas que pertencem a estas vias de reparação de ADN e para a sinalização de danos no ADN /classes de transdutores foram identificados como potenciais alvos terapêuticos [19], [20]. defeitos específicos do tumor em fatores de DDR, tais como BRCA1 /BRCA2, p53, ATM, agora são exploradas para desenvolver novas terapias específicas [19]. Considerando o papel da DDR e as várias vias de reparação de DNA em resistência, uma melhor compreensão dos mecanismos acionados por drogas quimioterápicas diretos ou indiretos de metas de DNA é importante porque vai ajudar a prever a eficácia dos medicamentos, bem como quimio-sensibilidade do indivíduo pacientes.

As linhas celulares derivadas de tumores humanos representam modelos experimentais de cancros que permitem determinantes da quimio-sensibilidade a serem investigadas [21], [22]. Recentemente, expressão gênica perfis e outras abordagens com base na matriz identificou padrões específicos associados com a sensibilidade quimioterápico [23], [24]. Estas estratégias globais também revelou alguns aspectos dos mecanismos de acção da droga [25]. Sub-classificação de cânceres de acordo com estes novos dados em larga escala é agora um conceito fortemente emergente que aumenta as esperanças de encontrar medicamentos mais adequados para os tratamentos sob medida [26].

Uma das principais limitações que tem impedido a compreensão do papel de mecanismos de reparação do ADN é a complexidade das vias de reparação de ADN. Até agora, as tentativas para determinar o papel da reparação do ADN investigada uma proteína de reparação de cada vez [27], [28] que permanece limitada de energia. É agora evidente, como afirma Sander e Van Houten [29], que o reparo do DNA deve entrar em biologia de rede e interactome proteína idade. Na verdade, a resposta de reparação é regulada através de mecanismos adaptativos e coordenadas, incluindo proteínas modificações e translocações [30], [31] pós-traducionais. Consequentemente, uma abordagem funcional abrangente parece mais adequado do que as abordagens transcriptomic ou genómicas para a análise de eficiência de reparo do DNA eficaz na resposta a fármacos quimioterapêuticos.

No presente estudo, foi utilizado um ensaio enzimático multiplexado específica de reparo de DNA em biochip para investigar simultaneamente várias vias de reparação. A relevância e vantagens deste conceito foram demonstradas em estudos de envelhecimento e em uma investigação das consequências de fotoexposição sol usando amostras de células da pele humana [32] – [34]. Foram avaliadas as assinaturas de reparação de ADN de um painel de 7 linhas celulares de cancro derivadas de 4 tipos de tumor, tratados com fármacos anti-cancerígenos 5 citotóxicos. Em especial, actividades excisão /reparação síntese pertencentes a BER, NER, NIR, e em parte de reparação ICLs foram quantificados. Uma estratégia rigorosa nos permitiu apresentar uma nova maneira eficaz de classificar as respostas das células do câncer de modelo para os medicamentos quimioterápicos. É fornecida novas indicações sobre o mecanismo de acção de medicamentos citotóxicos, da capacidade de linhas de células de resposta e no possível envolvimento de actividades específicas de reparação em quimioresistência. A nossa abordagem original é um complemento funcional interessante estratégias de farmacologia molecular para compreender o DDR e pode ser altamente eficaz como parte de escolher o tratamento certo para o cuidado otimizado de pacientes com câncer.

Materiais e Métodos

cultura celular

sete linhas de células de cancro representativo de diferentes locais do cancro foram seleccionados e fornecida por Oncodesign (França). HCC-1937 e MCF-7 (linha celular de cancro da mama), OVCAR-8 /ADR (linha celular de cancro do ovário, inicialmente identificado erroneamente como MCF-7 /ADR [35] (Oncodesign)), HCT-15 e HCT-116 (cólon célula cancerosa linhas), RPMI 8226 (mieloma), T24 (linha celular de cancro da bexiga). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 2 mM de L-glutamina e suplementadas com 10% de soro fetal de vitelo (Lonza) a 37 ° C num CO

2 incubadora (5%). cultura celular, os tratamentos com células e estudos de toxicidade foram realizadas por Oncodesign.

ensaio Chemosensitivity

A sensibilidade de linhas de células para 5 fármacos anticancerígenos (cisplatina (CDDP (Sigma), a oxaliplatina (OHP (Eloxatine®, Debiopharm)), adriamicina (ADR (doxorrubicina, Sanofi Aventis)), 5-fluoro-uracilo (5-FU (Sigma)), e carmustina (BCNU (Sigma)) foi avaliada pela MTS (3- (4,5-dimetiltiazol -2-il) -5- (3-fenil carboximetoxi) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio), Promega ensaio). A absorvância foi medida a 490 nm utilizando um Victor 3 ™ 1420 multi-contador marcado ( Wallac, PerkinElmer) (ver métodos S1).

os mecanismos de ação dos medicamentos são indicados como informação de apoio, Tabela S1. a concentração da droga que conduz à mortalidade de 20% foi calculado (IC20) e é fornecido em.

Tratamentos e preparação de extractos nucleares de células

cada linha celular, banhado em um 75 cm

2 frasco (Nunc), foi tratado no IC20 com cada uma das substâncias de ensaio 5. Um balão de controlo para cada linha celular foi também preparada em paralelo. Após 48 h de tratamentos, as células foram tripsinizadas, contadas e sedimentadas por centrifugação a 550 g durante 10 min. Os sedimentos foram suspensos em meio RPMI-1640 completado com 10% de FCS e 10% DMSO e congeladas a -80 ° C até a preparação dos extractos celulares. Cerca de 3 10

6 células estavam disponíveis por microesfera.

extractos nucleares de células foram preparadas como descrito anteriormente [32], [36]. teor de proteína típica foi de 1 mg /mL.

plasmídeo modificado microarray

O microarray plasmídeo modificado foi descrito em outros lugares [33], [36] e é apresentado como informação de apoio (Métodos S1).

excisão de ADN /síntese reacção

excisão reacção /síntese foi realizada nas matrizes plasmídeo modificado tal como descrito em [33] a uma concentração final de proteína de 0,2 mg /mL para todas as amostras (ver métodos S1 para as condições experimentais). Cada lâmina composta por 12 matrizes plasmídeo modificado idênticos: 9 matrizes foram utilizados para as reacções de reparação realizadas com os extractos da linha de células de cancro e 3 para reacções de controlo realizadas com células HeLa comercial padrão extrai (HeLa_Com; CilBiotech). Cada extrato de linhagem de células de câncer foi testado em duplicidade (réplicas técnicas).

Dois conjuntos independentes de reacções de reparação (chamados set_1 e Set_2) foram realizados em pelotas de células obtidas de forma independente e preparou vários meses de intervalo. Assim, a análise foi realizada em dados obtidos a partir de dois estudos independentes (duas repetições experimentais).

digitalização Microarray, quantificação de fluorescência, o tratamento de dados e normalização

As imagens foram adquiridas a 635 nm de comprimento de onda de 10 m resolução usando um scanner GenePix 4200A (Axon Instrument). Total de intensidade da mancha de fluorescência (FI) foi determinado usando o software 5.1 GenePix Pro (Axon Instrument). Dentro de cada conjunto de reacções, recolhidos dados duplicados das experiências de linha de células de cancro foram normalizados utilizando software NormalizeIt [36]. Em seguida, para cada amostra de ensaio, determinou-se um valor de intensidade para os 6 plasmídeos modificados correspondentes à soma das intensidades das diluições A, B e C a partir do qual o valor para a CTRL foi subtraído. Este valor correspondeu à intensidade do plasmídeo de controlo não modificado multiplicado por três, para consistência em relação à soma das intensidades de diluição 3 plasmídeo. Portanto, cada amostra foi caracterizado por valores de 6, correspondendo à reparação das lesões do ADN 6 representadas na biochip

.

Como as duas experiências separadas (set_1 e Set_2) foram conduzidos em diferentes lotes de plasmídeo de microarray em dias diferentes , tivemos que corrigir para a inter set e variações dia fluorescência inter-atribuídas, em parte, às mudanças no nível de ozono [37]. A estratégia utilizada para o tratamento de dados e normalização é fornecido como informação de apoio (Experimental de Fluxo de Trabalho Fig. S1).

expressão de dados

Efeito do tratamento sobre as diferentes actividades de reparação de ADN enzimática foi analisada por meio do cálculo da razão de FI obtidos para cada lesão e cada condição de tratamento, entre os animais tratados (T) e não tratados amostras (NT). Os rácios foram transformados em log 2, de modo a que a reparação estimulada e inibida em relação às células não tratadas foi centrado em zero e valores de sinal oposto exibiu. Estes valores são reportados como log2 (T /NT). Note-se que em Set_2, 4 linhas de células tratadas (RPMI8226_5-FU, HCT-116_ADR, HCT-116_BCNU e MCF7_OHP) apresentaram intensidades de reparação não significativamente acima do fundo. Os rácios de log2 correspondentes foram definido para o mínimo do conjunto de dados (menos 1)

Análise dos dados -. Métodos de agrupamento – Exibição de Resultados

agrupamento hierárquico não supervisionado foi usado para explorar a estrutura do conjunto de dados, para descrever e visualizar a relação entre os diferentes tratamentos e as diferentes linhas celulares. A análise foi realizada utilizando o ambiente de software livre para a computação e gráficos estatísticos, R (https://r-project.org/). O algoritmo de ligação agrupamento média hierárquica foi executado com duas medidas de dissimilaridade diferentes (1) a distância euclidiana, que agrega perfis com dois níveis de intensidade semelhantes e co-variação, (2) a medida de correlação de dissimilaridade (1 – r), onde r indica a correlação de Pearson coeficiente, que agrega perfis com co-variação semelhante independentemente dos seus níveis de intensidade. Assim, dois classificações complementares foram obtidos que explorar os dados de maneira diferente, considerando tanto co-regulação das vias de reparação e nível de intensidade e o outro, considerando a co-regulação apenas em vias de reparação, independentemente do nível de intensidade (ver métodos S1).

Investigação da relação entre a resposta DNA Repair (DNA-REP-Res) e quimio-sensibilidade

para explorar a associação entre o IC20 obtidos para cada droga e as DNA-REP-Res, realizamos agrupamento hierárquico não supervisionado usando a medida de dissimilaridade euclidiana eo método average linkage aglomeração. IC20 foi escolhido como, a este nível de toxicidade ligeira, espera-se que as células ser capazes de induzir um DDR específica, proporcionando assinaturas específicas de exposição à droga. O log2 média (T /NT) FI dos 2 conjuntos de experimentos para cada associação lesão de tratamento foi em função do log10 (IC20) do tratamento correspondente. Valores ao longo de cada eixo foram padronizados dentro de cada série linha de células (média = 0 e desvio padrão = 1). O número ideal de clusters foi determinado através do corte dos dendrogramas de cluster no ponto critérios de aglomeração de inflexão (Fig. S2). As partições do tratamento de lesões obtidos para cada linha de células em função do IC20 poderia ser facilmente visualizados em gráficos coloridos bidimensionais.

Os testes estatísticos para avaliar o grau de semelhança

Foi utilizado o ” pvclust “pacote de R para avaliar a incerteza na análise de agrupamento hierárquico (https://www.is.titech.ac.jp/~shimo/prog/pvclust/). Clusters com AU

P

valor 95% foram considerados significativos (ver métodos S1 para mais detalhes)

Resultados

Sensibilidade de linhas celulares de drogas anticâncer: classificação de acordo com IC20. (Fig. 1)

Nós fato para induzir dano ao DNA sem induzir a apoptose excessiva ou necrose nas 7 linhas celulares testados, como células apoptóticas e necróticas contêm altos níveis de nucleases. Estes nucleases iria interferir com a nossa análise a jusante. IC50 é comumente utilizado em estudos farmacêuticos para testar compostos e a sua toxicidade para as células, mas preferiu-se utilizar um nível de toxicidade mais suave, IC20, de modo a desencadear uma resposta das células sem induzir morte celular excessiva. Os 7 linhas celulares e os 5 tratamentos foram agrupados de acordo com log10 (IC20) utilizando a medida de dissimilaridade euclidiana. Na primeira dimensão, as linhas de células foram agrupadas por semelhança do seu (IC20) perfil log10 entre os 5 tratamentos. Na segunda dimensão, os tratamentos foram agrupadas por semelhança do seu (IC20) perfil log10 entre as 7 linhas de células. Na grade com código de cores, linhas celulares e tratamentos foram listados nas duas dimensões, e cada bloco grade mostra o valor log 10 (IC20) para cada linha e tratamento celular. Brilho da cor está relacionada com log10 (IC20), com vermelho para maior IC20 e verde para baixo IC20 (Fig. 1A). As linhas celulares foram separados em dois grupos representados pelos dois ramos principais dendrograma: MCF7 e OVCAR-8 /ADR em um lado com um IC20 muito baixo para 5-FU e muito alta para os outros tratamentos (excepto BCNU para OVCAR-8 /ADR e ADR para MCF7). Por outro lado, as outras linhas de células foram agrupadas em conjunto, com uma IC20 superior para BCNU do que para os outros tratamentos, os quais tinham um IC20 intermediário. Dentro deste agrupamento, HCT-116 foi significativamente mais perto de HCT-15, demonstrando uma sensibilidade semelhante das duas linhas de células do cancro do cólon para os diferentes tratamentos (Fig. 1B). Os tratamentos podem ser divididos em 3 grupos distintos: por um lado, a CDDP, ADR e OHP foram agrupados em conjunto, com o IC20 para células MCF7 e OVCAR-8 /ADR mais elevado do que para as outras linhas celulares. 5-FU se opunha a este grupo, com IC20 para MCF7 e OVCAR-8 /ADR muito menor do que para as outras linhas celulares. Finalmente, BCNU foi classificada separadamente, com um IC20 muito maior para cada linha de células, exceto OVCAR-8 /ADR (Fig. 1C).

Com base no log10 (IC20), o agrupamento usado a medida de dissimilaridade euclidiana. A. Calor representação mapa dos clusters. Brilho da cor está relacionada com log10 (IC20), com vermelho para maior IC20 e verde para baixo IC20. B. As linhas celulares dendrograma com valores agregados de significância. C. Tratamentos dendrograma com valores agregados de significância.

P

-Valores (AU (aproximadamente Imparcial) em vermelho e BP

valores P

(Bootstrap probabilidade) em verde são relatados nos dendrogramas.

Reparo do DNA perfis de resposta: (Fig. 2) classificação das linhas celulares de acordo com o efeito do tratamento sobre a actividade de reparação do ADN

Foi utilizado o conjunto de dados completo (log2 (T /NT) e valores de set_1 Set_2) para aglomerar o DNA-Rep-Res (representados pela reparação dos 6 lesões) e obter uma visão geral de semelhanças entre as linhas de células e tratamentos. É importante ressaltar que isso também nos permitiu avaliar a consistência entre os dois conjuntos independentes de experimentos.

Clustering com medida de correlação dissimilaridade foi utilizado para agrupar as 7 linhas de células a partir de duas experiências e as 5 tratamentos por tipo de lesão (correspondente a reparar via), nas duas dimensões. na primeira dimensão, as linhas celulares foram agrupados pelo semelhança do seu DNA-Rep-Res covariação entre os 5 tratamentos utilizando os tipos 6 lesão. na segunda dimensão, os tratamentos associados com os tipos de lesão 6 foram agrupadas por semelhança do seu padrão de co-variação entre as 7 linhas de células a partir de duas experiências (Fig . 2A). O heatmap ofereceu uma visão abrangente da classificação, onde as diferenças entre os fenótipos induzidas pelo tratamento com respeito à identidade das linhas de células poderiam ser facilmente visualizado.

A. O mapa de calor foi construído utilizando os rácios log2 transformada da intensidade de fluorescência obtida para a reparação da lesão de cada entre as linhas de células tratadas e não-tratadas (log2 (T /NT)). algoritmo de agrupamento hierárquico com medida de correlação de dissimilaridade foi usado para agrupar em uma grade com código de cores das sete linhas celulares das duas experiências e as cinco tratamentos por tipo de lesão de reparação, nas duas dimensões. Na primeira dimensão, as linhas celulares foram agrupadas por semelhança da sua reparação do ADN perfil de resposta co-variação em todo o impacto dos cinco tratamentos por tipo de lesão de reparação. Na segunda dimensão, os tratamentos por tipo de lesão de reparação foram agrupadas por semelhança de sua co-variação padrão através dos sete linhas celulares dos dois experimentos. Para avaliar a consistência entre os dois experimentos independentes, os dados set_1 e Set_2 foram mantidas separadas e analisadas simultaneamente (marcado _1 e _2 respectivamente). Na grade com código de cores, valores superiores a 0 são sombreadas na estimulação indicando vermelho de actividades de reparação enquanto valores abaixo de 0 são coloridos em verde, indicando uma inibição de actividades de reparação, em comparação com células NT. Valores superiores a 0 foram sombreada na estimulação indicando vermelho das actividades de reparação, enquanto que valores abaixo de 0 foram sombreada na inibição indicando verde da actividade de reparação. Valores em torno de 0 foram coloridas em preto, indicando nenhum efeito detectado. Brilho da cor foi correlacionada com a magnitude do efeito dos tratamentos sobre a actividade de reparação do ADN. B. Dendrograma dos cinco tratamentos por lesão reparação tipo com valores agregados de significância. C. Dendrograma das sete linhas celulares a partir de duas experiências com valores de significância aglomerados. valores P (AU (aproximadamente Imparcial)

valor P

em vermelho e BP (Probabilidade Bootstrap)

P

valor em verde) são relatados nos dendrogramas.

O dendrograma dos tratamentos por tipos de lesão (fig. 2B) revelou que as lesões permaneceram agrupados por tipo de tratamento, o que indica que cada droga teve um efeito distinto em todas as vias de reparação simultâneo. Esta análise revelou ainda três classes de drogas: uma que engloba o tratamento ADR BCNU e (AU valor de p 95%) e outra que engloba OHP e tratamento CDDP (AU valor de p 93%). 5-FU foi separados, embora tendem a agrupar-se com o segundo grupo. Além disso, de um modo geral, quando os tipos de lesão 6 foram agrupados no conjunto de linhas de células por tratamento, entre os dois conjuntos de experimentos consistentemente parecia que 8oxoG (8oxoG), bases alquiladas (AlkB) e sítios AP (ABAS), tudo reparado por BER, tendem a ser agrupadas; Considerando glicol e fotoprodutos (CPD-64) agrupados de forma independente. Cisplatina (CISP) formaram um grupo sozinho (Fig. S3). Quando cada tratamento foi considerado separadamente, esta tendência foi mantida por BCNU e tratamento ADR, embora com algumas diferenças (Fig. 2B). Pelo contrário, as diferenças notáveis ​​apareceram a seguir ao tratamento com 5-FU. Interessantemente, no caso da CDDP e de OHP tratamento, a via de reparação do CISP foi significativamente distinta.

Nas linhas celulares dendrograma, as linhas celulares foram organizados em 3 grupos principais significativos (Fig. 2C). Um ramo separado contido RPMI8226, uma linha de células hematopoiéticas derivadas de mieloma que, ao contrário de todas as outras linhas celulares, não é derivado de um carcinoma. As duas linhas de células de carcinoma mamário, MCF7 e HCC1937, pertenciam ao mesmo cluster, juntamente com HCT-15. Neste subgrupo, as repetições para cada linha de células foram misturados-up. As repetições de outra linha de células de câncer de cólon HCT-116 constituído um subgrupo de um cluster contendo OVCAR-8 /ADR e a linha de células de carcinoma da bexiga T24.

Importante, observou-se que as duas repetições independentes para cada célula linha foram mais estreitamente associado, refletindo a repetibilidade do experimento e, consequentemente, a confiabilidade da abordagem. A medida de correlação de dissimilaridade depende apenas de co-regulação e é independente de qualquer efeito lote entre os experimentos. Esta medida foi mais robusta do que a distância euclidiana ao demonstrar a estreita semelhança entre as repetições

Impacto dos tratamentos de droga nas vias DNA Repair:. Estímulo ou inibição

Para distinguir classes de respostas a tratamentos no que diz respeito às diferentes de reparação de ADN sub-vias, os meios e os erros padrão dos dados (log2 (T /NT) para cada via de reparação), dentro dos 3 grupos principais de linhas celulares identificadas foram representadas no mesmo gráfico. Isto permitiu a fácil visualização dos perfis 3 (Fig. 3). Para caracterizar cada cluster, a estimulação ou inibição dos diferentes reparação sub-caminhos significativa foi posteriormente investigado. Para este efeito, aplicou-se testes de hipóteses estatísticas para cada um dos 2 grupos que contenham 3 linhas de células. Como a distribuição de dados poderia ser não-Gaussiana, foi utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon. Para cada grupo de tratamento e pelo tipo de lesão, o teste de Wilcoxon determinado se a mediana da distribuição da taxa de log2 foi significativamente diferente de 0, destacando-estimulante (se mediana 0) ou inibir (se mediano 0) efeitos. Para o grupo que contém apenas uma linha de células (RPMI8226), a estimulação ou inibição foi considerado significativo quando | significar | 3 x erro padrão. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

médias e erros padrão das três classes identificadas de respostas de linhas celulares em todo os cinco tratamentos e seis tipos de lesões foram calculados utilizando o log2 (T /NT) de dados (linha preta: HCC1937, HCT-15, MCF7; linha vermelha: HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24; linha verde:. RPMI8226)

Dependendo da natureza da droga, a número de vias de reparo afetados variou. Entre as características que surgiram, observou-se que 5-FU drasticamente significativamente inibido CPD-64, AlkB e ABAS reparação na linha de células RPMI8226. CDDP, OHP e ADR todos apareceram para inibir a via de reparo CISP da linha de células RPMI8226 comparação com os outros reparar caminhos investigados. Por oposição, com o tratamento OHP, outras vias de reparo de RPMI8226 (Glicol, 8oxoG e AlkB) foram significativamente up-regulada. BCNU exerceu um efeito inibidor sobre todas as atividades de reparação no [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] cluster com

P

valor 0,1. Curiosamente, ADR inibida reparação de 8oxoG somente dentro deste cluster (

P

valor 0,1). Os dois fármacos anticancerígenos à base de platina, CDDP e OHP, não afetou as actividades de reparação na [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] agrupamento para além de estimular a reparação de AlkB e ABAS para CDDP (

P

valor 0,1). Algumas actividades de reparação no [HCC1937, HCT-15, MCF7] agrupamento foram ligeiramente up-regulada por 5-FU tratamento (significativo para 8oxoG, Abas, CISP com o

P

valor 0,1) e claramente regulada para baixo por as drogas à base de platina (ver Tabela 1 para significância). Por outro lado, ADR e BCNU tratamentos não têm qualquer impacto sobre as vias de reparo de DNA deste aglomerado

Impacto do tratamento medicamentoso:. Análise da resposta ao tratamento linhagem de células por tratamento

Quando se centrou de forma independente em cada tratamento, as particularidades adicionais foram destacados. Isto diz respeito, em particular, as linhas celulares de cancro do cólon dois HCT-15 HCT-116 e tratados por 5-FU. Ambas as linhas celulares exibido estimuladas atividades de reparo de DNA, seja qual for o caminho considerados (teste de Wilcoxon unilateral;

P

value = 0,065) (Fig S4A.). Um cluster linha celular novo semelhanças compartilhadas quando tratados por BCNU: HCC1937, RPMI8226, e HCT-15 para o qual reparação de 8oxoG e CPD-64 foram estimuladas (unilateral teste de Wilcoxon;

P

value = 0,05) ( Fig. S4B).

Investigação da relação entre a resposta DNA Repair and chemosensitivity

as representações gráficas do log2 (T /NT) de dados em função do log10 (IC20) permitiu a visualização significativa dos aglomerados o que representou co-regulados sub-vias para cada induzida por drogas ADN-Rep-Res (Fig. 4 a-G). Para visualização conveniente dos dados dentro de cada gráfico, de reparação do ADN sub-caminhos que pertencem ao mesmo grupo foram enquadrados em conjunto. Dependendo da linhagem de células considerada, o número de grupos variou de 6 a 13 classes. Dentro de cada gráfico, reparação sub-vias relacionadas com um tratamento poderia ser, quer agrupadas (por exemplo, HCT-116, a Fig. 4C e MCF7, Fig. 4E) ou dispersa (por exemplo, HCC1937, a Fig. 4B, HCT-15, Fig. 4D) . Podemos supor que esta última característica revelou regulamentos distintos dos diferentes reparação sub-vias, por sua vez responsável pelo aumento do número de cluster.

Nós relatamos, para cada linha de células, os meios de log2 (T /NT ) de dados (eixo Y) reunidos para cada tratamento dos 2 conjuntos de experiências em função do log10 correspondente (IC20) (eixo X). Os dados foram normalizados dentro de cada série linha de células (média = 0 e desvio padrão = 1). Dentro de cada carta, as associações lesão de tratamento pertencentes ao mesmo grupo foram enquadrados em conjunto. Os dendrogramas de cluster correspondentes são exibidas na Fig Complementar. S2 (as letras à frente das lesões refere-se ao tratamento: A = adriamicina; B = BCNU; C = cisplatina; F = 5-FU; O = oxaliplatina).

Considerando a dimensão do dados, neste artigo, poderia se concentrar apenas em associações óbvias, tais como baixa reparo /baixo IC20 e alta reparação /alta IC20, suscetíveis a reflectir uma relação de causalidade entre a eficiência reparação e quimio-sensibilidade. Isto não exclui que outras associações pode ser biologicamente relevante.

Por exemplo, o gráfico HCC1937 exibida uma reparação menor de locais não básicos em resposta ao tratamento ADR (ADR-ABAS) associado com uma IC20 menor em comparação com outros tratamentos (Fig. 4B). Por outro lado, um BCNU-driven maior nível de reparação de todas as lesões foi associada com níveis elevados de IC20 (Fig. 4B). HCT-116 exibiu uma associação entre toda a resposta de reparação ADR-dirigido e IC20, sendo ambos baixo (Fig. 4C). Outra característica vale a pena mencionar em causa HCT-15, onde o baixo reparação de CISP após o tratamento OHP foi associada com baixa IC20 (Fig. 4D). No caso de RPMI8226, a resposta de alta-BCNU foi conduzido associada com uma alta IC20 (Fig. 4G).

Por oposição, associações invertidos foram também observou tal como por tratamento T24 onde ADR era o mais citotóxico ( baixo IC20) e, no entanto, associada com a mais elevada de ADN-Rep-Res (Fig. 4A). É importante ressaltar que o fato de que ADR DNA-Rep-Res e baixa ADR-IC20 foram inversamente associados não significa que eles foram formalmente anti-correlacionadas e nenhuma hipótese pode ser formulada para o momento sobre o significado biológico desse potencial anti-correlação. O mesma observação foi encontrado no caso de MCF7 tratadas com 5-FU (Fig. 4E). Finalmente, as linhas celulares de cancro dois cólon HCT-116 e HCT-15 exibiram uma resposta similar a 5-FU, com uma toxicidade bastante fraco, mas puderam ser discriminados por, pelo menos, ADR e tratamentos acetatos (Fig. 4C e 4D, respectivamente).

Discussão

neste estudo, se aproveitou de uma abordagem funcional multiplexado que quantifica as atividades de reparo de DNA para explorar a DDR ea relação entre citotoxicidade e de reparação do ADN sub-vias induzidas por drogas. Nós usamos abordagens estatísticas e representações visuais privilegiados que mostravam claramente nossos achados.