Abstract
A lista crescente de microRNAs (miRNAs) mostram padrões de expressão aberrante em carcinoma hepatocelular (HCC), mas os mecanismos de regulação em grande parte permanecem obscuros. edição de ARN catalisada por membros da desaminase de adenosina actua sobre a ARN da família (ADAR) poderia ter como alvo os precursores de miARN e afectar o processo de biogénese. Por isso, investigamos se a edição de RNA poderia ser um mecanismo que contribui para a desregulamentação dos miRNAs específicos no HCC. Por superexpressão de Adars individuais em células de hepatoma, edição de RNA sobre os precursores de 16 miRNAs frequentemente desregulados em HCC foi rastreado por uma plataforma de fusão de alta resolução sensível. Os resultados identificaram precursores de ARN de miR-214 e miR-122 como alvos potenciais editada por ADAR2. Um subconjunto de HCC mostrando elevada ADAR2 verificadas as edições principais identificados em células de hepatoma ARAR2 sobre-expresso, ou com um-para-I ou alterações L-a-C. A edição incomum L-a-C a resíduos específicos foi demonstrada como sendo atribuído ao A-para-I edição no transcritos de ARN complementares para a pri-miARNs. O evento de edição causou uma diminuição do transcrito de ARN complementar à pri-miR-214, o que levou à diminuição de pri-miR-214 e miR-214 e resultou no aumento do nível de proteína do seu gene alvo Rab15 romance. Em conclusão, o estudo descobriu edição ADAR2 mediada dos transcritos antisense complementares como um novo mecanismo para a regulação da biogênese de miRNAs específicos durante hepatocarcinogênese
Citation:. Liu WH, Chen CH, Yeh KH, Li CL, Wu YJ, Chen DS, et ai. (2013) ADAR2-Mediated Edição de miR-214 e miR-122 Precursor e antisense RNA transcrições de cânceres de fígado. PLoS ONE 8 (12): e81922. doi: 10.1371 /journal.pone.0081922
editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 31 Julho, 2013; Aceito: 17 de outubro de 2013; Publicação: 27 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa para Biopharmaceuticals, Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC102-2325-B-002-032-), e do National Health Research Institutes, Taiwan (INDH-EX100-9832BI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não-codificadores endógenos identificados como reguladores pós-transcricional da expressão do gene. aumento do número de miRNAs foram frequentemente encontrado para ser desregulamentados HCC, e alguns têm participado no processo cancerígeno através de segmentação de genes celulares específicos envolvidos na proliferação do tumor, apoptose, e metástase [1], [2].
vários mecanismos têm sido relatados contribuindo para a expressão aberrante de miARNs em tumores. Para além das alterações genómicas ou epigenética, defeitos do processo de biogénese de miARN também foram considerados envolvidos na desregulação, quer transcricionalmente por factores de transcrição específicos ou posttranscriptionally por fatores de processamento [3]. O aumento do número de factores que participam nos passos biogênese pós-transcrição, foram identificados, incluindo os factores gerais de todos os miARNs (tais como Drosha, DGCR8, e Dicer) [4] e os factores específicos para um subconjunto de miARN (tais como p53, TRBP2, KSRP, p68 /p72, Lin28B, e outros) [5], [6]. Além destes factores, considerou-se que a edição de ARN pode ser um outro mecanismo para regular o nível de miARN posttranscriptionally em tumores.
edição de ARN resulta numa alteração da sequência de ARN, que é diferente da codificada pelo do genoma e contribui para a diversidade de produtos de proteínas [7]. Nos seres humanos, este evento é mediada por enzimas de adar, incluindo ADAR1 e ADAR2, que catalisam a desaminação de adenosina a inosina (A-a-I) na cadeia dupla ARN [8]. Foram identificadas duas isoformas ADAR1 por uso alternativo promotor que ADAR1S codificar e ADAR1L [7], [8].
Além dos genes codificantes de proteína, os Adars poderia também alvo os precursores de miRNA, ou o pri- ou pré-miARNs, que contêm as estruturas de haste-laçada como substratos favoráveis para a maquinaria de edição. Auxiliado por análise de alto rendimento de sequenciação, estimou-se que ~ 20% da pri-miARNs humanos são editados [9]. Tais eventos de edição tem o potencial de prejudicar a função de miARN, incluindo a estabilidade dos precursores, a eficácia de processamento durante a biogénese, ou ainda a selecção do gene alvo [10], [11]. Essa possibilidade já foi bem demonstrada em vários miRNAs específicos. Por exemplo, pri-miR-142 foi encontrado editada por ADAR1 e ADAR2
in vitro
, o que levou à supressão de seu processamento por Drosha. Outro exemplo veio da edição de pri-miR-151 por ADAR1, que inibe a pré-amadurecer-miR-151 de processamento, bloqueando a sua clivagem por Dicer [12].
No presente estudo, procuramos para investigar se a edição de ARN por Adars ocorre para a regulação do processamento de miARN relacionados-HCC. Como um estudo piloto, esperamos que os resultados poderiam ajudar a compreender se os eventos de edição de RNA contribuir para a expressão desregulamentado de miRNAs específicos na hepatocarcinogênese.
Materiais e Métodos
plasmídeo Construções
os clones de ADNc para ADAR1L humana e ADAR2 foram adquiridos a partir de mamíferos Colecção Gene (MGC, NIH, EUA), e o ADAR1S foi subclonada a partir do clone ADAR1L. Estes fragmentos de cDNA foram transformados em pCMV.SPORT6 vector e então procedeu ainda mais para clonar no vector lentiviral de pLenti6 /V5-DEST usando gateway Sistema ™ Tecnologia (Invitrogen Life Technologies Inc.).
O pLKO.1 -siLuc e pLKO-1-siGFP construções conduzidos pelo promotor U6 foi obtida a partir da Facilidade de RNAi Núcleo em Academia Sinica, Taiwan (Taipei, Taiwan). Além disso, vários plasmídeos siRNA baseado no vetor pLKO.1 foram construídos através da inserção da sequência de siRNA específico no vector pLKO.1-siLuc nos sítios de restrição de AgeI e EcoRI. As sequências para cada siRNA inserções contra os sentido e anti-transcrições de miR-214 e miR-122 foram listados como se seguiu. siRNA para miR-214: 5′-CCTTTGCTCATAGACAGATAC-3 ‘; siRNA para AS-miR-214: 5’-GTATCTGTCTATGAGCAAAGG-3 ‘; siRNA para miR-122: 5’-CCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘, ARNsi para AS-miR-122: 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGG -3’. Os detalhes para a preparação dos lentivírus que expressam os siRNAs Adars ou específicas foram como descrito anteriormente [13].
para construir os plasmídeos que exprimem, quer o sentido ou os transcritos antisense complementares a pri-miR214 e pri-miR122 em células de cultura, clonámos os produtos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de células Huh-7 no vector pCMV.SPORT6. Os conjuntos de iniciadores foram desenhados para compreender o precursor de miARN com aproximadamente 200 bases que se estende para ambos 5 ‘e 3’ de cada sequência flanqueadora miARN. As mutações de resíduos específicos nestas construções, incluindo A-34G e A-27G para pri-AS-miR-214 e A-7G para pri-miR-122, foram introduzidas através de mutagénese dirigida ao local utilizando o QuickChange II Site-Directed kit de mutagénese (Stratagene, Cedar Creek, TX), seguindo as instruções do fabricante.
o repórter construir pGL3-Rab15-3’UTR, contendo 3 ‘UTR do gene Rab15, foi construído por inserção do fragmento de ADN de cobertura nt. 1~714 da 3’UTR do gene Rab15 (nt. 1 da 3’UTR como o primeiro nucleótido do codão de paragem depois de Rab15, no nt. 709 a posição de transcrição Rab15, NM_198686) em pGL3-Promotor vector (Promega, Madison, WI). A inserção de ADN foi amplificado por PCR a partir do ADN genómico de células Huh-7 com os iniciadores de 5’-GGTCCGTCTAGACAGAGCTGGTGCTGCAGGCCCAT-3 ‘e 5’GGTTCTTC-3-GAAGGCTCTAGACGAGGCAGGGTGGAG’.
de alta resolução de fusão Análise (GRH)
GRH é uma ferramenta poderosa desenvolvido para rastreio sensíveis variante de sequência, utilizando a propriedade de separação de DNA de calor na presença de saturação de corantes de fluorescência, tais como a alta resolução de fusão corante (Roche Diagnostics Applied Science, Mannheim, Alemanha) utilizado no presente estudo. Os fragmentos de ADN heteroduplex pode ser distinguida de os homozigóticos, mostrando uma curva de fusão diferentes em forma de [14]. Isto permite a detecção de alterações de pares de bases únicos em fragmentos de ADN até 400 pb por análise de curva de fusão. análise de HRM é, portanto, adequado para a nossa identificação das alterações de nucleótidos causados editando eventos de pré-miRNAs (-100 bps em média).
Os iniciadores foram desenhados para cada miRNA usando o LightCycler Sonda Software Design, com as sequências resumidos na Tabela S1. Os comprimentos de cada fragmento amplificado foram ~ 200 pb, que sobre toda a pré-miARNs com pelo menos 50 pb que se estende a 5 ‘e 3’-extremidades. A análise de amplificação e GRH PCR foi conduzida pelo LightCycler® 480 (Roche Diagnostics Applied Science), como descrito com detalhes [15].
Os produtos de PCR contendo os fragmentos de heteroduplexes foram identificados por mostrando a diferença relativa de sinal as curvas de fusão em comparação com aqueles amplificado pela DNA genómico de células Huh-7 (como o padrão sem edição), utilizando o gene de software de digitalização (Roche Diagnostics Applied Science). Para evitar os resultados falsos positivos causados pelas variações do ensaio, estabelecemos os valores de corte para cada fragmento amplificado através da análise da diferença de sinal em relação entre os produtos de PCR a partir de 12 repetições de reacção de PCR com Hu-7 de DNA genómico como modelo, que foi 3,5 em todos os casos. Portanto, os valores de corte para a diferença de sinal relativa foram definidos como 5 em nossa análise.
Os sujeitos do estudo
Os tecidos do fígado de pacientes com HCC masculinos relacionados 20 HBV recolhidos no cancro do fígado Taiwan rede (TLCN) foram incluídos neste estudo. O DNA e RNA a partir da tumoral emparelhados e os tecidos do fígado não tumorais adjacentes de cada paciente foram usadas para a transcrição reversa e as reacções de PCR. Em seguida, o produto de PCR foi processado para análise de sequenciação, a fim de identificar os resíduos com edição de eventos putativos. Os espécimes cirúrgicos ressecados foram rapidamente mantidos em azoto líquido até a extracção de ARN e ADN. O Conselho de Revisão Institucional da National Taiwan University Hospital aprovou o uso desses tecidos arquivados, e todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito antes da inscrição.
Quantificação de Pri-miRNA e maduro miRNAs
O RNA total foi isolado a partir das células com o reagente Trizol (Rezol C T, protech, Taipei, Taiwan) e depois processadas para a transcrição reversa, utilizando o Superscript III One-Step RT-PCR System (SuperScript® III First-Strand Synthesis System, Invitrogen, Carlsbad, CA), para a quantificação subsequente de pri-miARN. As misturas de reacção de transcrição reversa continha 1 pg de ARN, 10 fiM de primer específico, 5′-ATATCAGATGAACCTTCTTGCTC-3 ‘para a pri-miR122 e 5’-GGTTGTAGCTCTTGGTGTAGATG-3 para a pri-miR-214, com os detalhes de reacção tal como descrito [ ,,,0],13].
A qPCR foi realizado pelo LightCycler FastStart DNA Mestre SYBR Green I Kit (Roche, Mannheim, Alemanha) na máquina LightCycler PCR com detalhes como descrito [13]. Os iniciadores utilizados para a amplificação específica de pri-miR214 e pri-miR122 são listados como se segue. Pri-miR-214: 5′-GTATCTGTCTATGAGCAAAGGAAACC-3 ‘e 5′-GGTGTAGATGCTATGGTGTGAGGGC-3′; pri-miR-122: 5’-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘e 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3’
Quantificação de madura miR-214 e miR-122 foi realizada utilizando o kit TaqMan miARN Ensaio (TaqMan ® MicroRNA. Transcrição Reversa Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. U6 ARN foi utilizado como um controlo interno para a determinação do nível de expressão miRNA parente com detalhes como descrito [13].
Análise vertente específica qRT-PCR
A vertente específica qRT-PCR para o primário transcrição dos seus transcritos anti-sentido complementares pri-miR-122 e miR-pri-214, e também, foram realizadas seguindo o protocolo como descrito por Ho
et al [16]. Em resumo, 2,5 ug de RNA extraído a partir de células ou tecidos foi processado para a reacção de transcrição reversa (RT) por primer específico cadeia; e, em seguida, o produto de RT específica cadeia foi usado para a análise qPCR. Os iniciadores específicos para cadeia concebidos pri-miR-122 e miR-pri-214 são miR-122S: 5′-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘e miR-214S: 5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCTG-3′; e os que foram concebidos para as transcrições são complementares do miR-122AS: 5’-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3 ‘e miR-214AS: 5′-AGGCTGGGTTGTCATGTGACTG-3’. O mesmo conjunto de iniciadores para a reacção de RT específica cadeia foi usado para a análise subsequente qPCR com detalhes como descrito [13].
de clonagem TA e análise de sequenciação
Os produtos de RT-PCR a partir do Lenti -ADAR2 células infectadas foram purificadas por extracção em gel e clonado no yT Um vector (Yeastern Biotech Co. Ltd., Taipei, Taiwan) por clonagem TA. Os clones positivos contendo inserções foram processadas para análise de sequenciação para detectar as alterações de nucleótidos, em comparação com a sequência a partir das amostras de controlo sem ADAR2 superexpressão.
Cultura
celular, transfecção, Luciferase Reporter Assay, e Western Blot Análise
Duas linhas de células de hepatoma, HepG2 e Huh-7 células, foram adquiridos de BCRC (Coleção Bioresource e Centro de Pesquisa, Taiwan, https://www.bcrc.firdi.org.tw). O genótipo destas duas linhas celulares foi autenticado pelo BCRC utilizando o kit de amplificação AmpFI STR Identifiler PCR da Applied Biosystems para análise de DNA STR PCR extensa, com os perfis idênticos com os dados ATCC. Os pormenores para a manutenção de células, transfecção, ensaio de repórter de luciferase, e a análise Western blot foram tal como descrito previamente [17]. Os anticorpos utilizados para a análise de transferência de Western incluídos anti-ADAR2, anti-GUTL1, anti-IGF-1R, e anti-Rab15 (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-ADAR1 (Abnova, Taoyuan), e anti-β-actina (Sigma, St. Louis, MO).
resultados
edição de miR-214 e miR-122 Precursores no Huh-7 células pela superexpressão de ADAR2
Para examinar se a edição RNA contribui para a expressão aberrante de miRNAs específicos na hepatocarcinogênese, 16 miRNAs reproducibly relatado como desregulados em HCC (Tabela S1) foram escolhidos para os nossos testes se fossem substratos editada por Adars. Nós levamos a abordagem pela superexpressão lenti-Adars individuais em Huh-7 células, incluindo ADAR1S, ADAR1L e ADAR2, e depois examinou se a edição RNA causou quaisquer alterações de nucleótidos nos precursores destes miRNAs. O aumento da expressão da proteína de Adars individuais foi primeiro verificada por análise de transferência de Western (Fig. 1A). O ARN foi extraído a partir de células que sobre-expressam Adars individuais para análise subsequente GRH RT-PCR e.
(A) As células não infectadas foram (simulado), infectadas com lenti-SH-Luc (controlo negativo), ou infectadas com o lenti-ADAR1S, ADAR1L, e ADAR2 individualmente. Os lisados celulares foram processadas para transferência de Western por sondagem com ABS, conforme indicado na parte inferior de cada painel. Os resultados GRH para miR-214 (B) e miR-122 (C). Os dados em bruto para os sinais relativos são mostrados no painel superior; e a diferença entre o sinal relativo em comparação com o padrão de “nenhuma edição” são mostrados no painel inferior. As estruturas em ansa pedunculada para pré-miR-214 (D) e pré-miR-122 (E) estão ilustrados esquematicamente, com os nucleótidos correspondente a amadurecer miRs marcadas com verde. As posições dos nucleótidos alterados por sobre-expressão de ADAR2 são marcadas em vermelho, com os números que mostra as suas posições em relação ao primeiro nucleótido da miRs maduros (como posição não. 1). Os resultados resumo das alterações de nucleotídeos em precursores destes dois miRNAs são mostrados no painel direito, por sequenciamento de 100 clones de clonagem TA dos produtos de RT-PCR amplificados pela RNA a partir de células infectadas-ADAR2 Lenti.
o produto de PCR amplificado pela DNA genômico de células Huh-7, que, aparentemente, não é o alvo de Adars, serviu como o padrão “sem edição” para a análise HRM. Através da comparação com um padrão tal, as pontuações relativas de sinal para cada um dos 16 miARNs de células infectadas com lenti-Adars individuais foram calculados, com os resultados resumidos na Tabela S2. As curvas de fusão aberrantes, que mostram a pontuação 5, foram identificados nos produtos de RT-PCR amplificados por pri-miR-214 e PRI miR-122-ARN precursor extraído a partir de células infectadas com ADAR2 lenti (Fig 1B para miR. -214 e a Fig. 1C para miR-122). Os resultados indicaram que ADAR2 superexpressão pode introduzir algumas inadequações nas transcrições de pri-miR-214 e miR-pri-122, sugerindo os precursores podem ser os substratos para ADAR2.
Para identificar outros resíduos específicos na transcritos primários destes dois miARNs editado por ADAR2, os produtos de RT-PCR a partir de células lenti-ADAR2-infectadas foram processadas para AT-clonagem, sequenciação e a análise subsequente foi realizada em 100 clones para cada pri-miARN. Várias alterações de nucleótidos recorrentes foram identificados como sendo diferente a partir da sequência de amostras sem ADAR2 superexpressão. FIG. 1D (para o pri-miR-214) e a fig. 1E (por pri-miR-122) ilustrado esquematicamente as suas posições relativas ao miRs madura, que também resumidos a percentagem destas alterações de nucleótidos nos clones sequenciados. As alterações mais frequentes ocorreu com o haplotipo de U-28C /L-37 ° C durante pri-miR-214 (em ~ 50% dos clones) e com o haplotipo de A-7G para pri-miR-122 (em ~ 30% de clones).
ADAR2 Elevation correlacionadas com as variações de nucleotídeos em resíduos específicos de Pri-miRNAs em HCC tecidos
em seguida, examinamos se as alterações de nucleótidos recorrentes ADAR2-meditado identificados em células Huh-7 também ocorreram em amostras clínicas. O cDNA a partir de 20 pares de HCC e seus correspondentes tecidos não tumorais adjacentes foram analisados por sequenciação directa do seu produto de RT-PCR a partir dos transcritos primários de pri-miR-122 e miR-pri-214. Três fragmentos de CCH mostrou claras alterações de nucleótidos (Fig. 2, nenhum paciente. 11, 13, e 20), com modificações L-a-C a -37 e -28 de pri-miR-214 (Fig. 2A, revelado como um -to-G alterações por sequenciação com o iniciador inverso), e uma mudança de a para G na -7 de pri-miR-122 (Fig. 2B, como revelado-a-g a alterações por sequenciação com o iniciador directo) . Tais modificações não ocorrem no produto de PCR a partir de ADN genómico dos mesmos tecidos HCC (dados não mostrados). Interessantemente, estas alterações nucleotídicas foram as mesmas que as mais importantes identificadas nos ADAR2-sobre-expressos Huh-7 células (Fig. 1D, 1E), apoiando esses eventos edição também pode ocorrer em amostras clínicas. Foi digno de nota que estes nucleótidos específica mudanças ocorreram principalmente nos tumores, mas pouco nos tecidos não tumorais adjacentes destes pacientes (Fig. 2A e 2B, NT vs t), sugerindo isso como um evento ocorrer preferencialmente em tumores.
os resultados de sequenciação representativos para miR-214 (a) e miR-122 (B), com os produtos de RT-PCR a partir de quatro pares de fragmentos de CCH como indicado. Os resíduos de nucleótidos com as mudanças no (T) tecidos tumorais, em comparação com aqueles nos tecidos correspondentes não tumorais (NT), estão marcados com setas vermelhas. As posições relativas ao dos miARNs maduros são indicados por cima das setas. Os níveis de expressão relativa de ARNm ADAR2 nestes tecidos HCC (C) foram determinados por análise de qPCR, com os resultados quantitativos como mostrado em relação ao nível da parte de NT nenhum paciente. 8. (D) A expressão da proteína de ADAR2 e ADAR1 nestes quatro pares de fragmentos de CCH foi examinado por Western blot.
Uma vez que nossos
in vitro
estudos mostraram que essas alterações de nucleótidos pode ser causada por ADAR2 sobreexpressão, nós examinamos se ADAR2 foi elevada em HCC mostrando alterações de nucleótidos específicas. Os níveis de expressão de ARN e proteína de ADAR2 nestes três pares de HCC foram examinados por qPCR e Western blot, com um par de HCC, sem quaisquer alterações de nucleótidos tal como o controlo (o paciente n ° 8.). Tanto o ARN e os níveis de proteína de ADAR2 foram significativamente elevados nos tecidos HCC destes três pacientes, mas não no caso de controlo (Fig. 2C, 2D). Os resultados sugerem que os acontecimentos de edição de ARN ADAR2 mediadas também pode ocorrer em um subconjunto de HCC, que é bem associada com a expressão aumentada de ADAR2.
edição de ARN transcritos complementares ao ARN transcritos de Pri-miR- 214 e Pri-miR-122
é bem documentado que o RNA edição por ADAR2 causa principalmente as mudanças a-to-I /(G) [8]; no entanto a maioria das alterações de nucleótidos que identificamos para pri-miR-214 e miR-pri-122 precursores em células ADAR2-sobre-expressos Huh-7 foram as mudanças U-to-C, com exceção de um na posição -7 de miR-122 (Fig . 1D e 1E). Uma vez que tais incomuns mudanças U-to-C são complementares às mudanças A-para-G esperados, propusemos a possibilidade de que a edição de A-to-I ADAR2 mediada poderia ocorrer nas transcrições de RNA complementares a estes dois pri-miRNAs.
Para testar esta possibilidade, tomamos a abordagem pela superexpressão ou a pri-miR-214 /pri-miR-122 (sentido) ou os seus transcritos de RNA complementares (antisense) em Huh-7 células individualmente, em combinação com a sobre-expressão de ADAR2. Tal projeto pode ajudar a distinguir os eventos de edição em ambos os pri-miRNAs ou as transcrições antisense complementares. De acordo com a sobre-expressão de ambos transcritos para ambos pri-miARNs ( 50 vezes, revelada pela análise qPCR), verificou-se que ADAR2 poderia induzir a L-a-C muda apenas nas células que sobre-expressam os transcritos de sentido inverso complementar (Fig 3A,. -28 e -37 por aS de miR-214; a Fig. 3B, 57 para aS de miR-122) .Em contrapartida, foram identificadas as mudanças a-para-G apenas nas células que superexpressam o pri-miR-122 ( a Fig. 3B, para -7 S de miR-122). Este suporte que as observadas alterações L-a-C pode ser devido ao ADAR2 mediada por A-para-I Edição na transcritos de ARN complementares a ambos pri-miARNs. Estas mudanças não ocorrem nas células infectadas com lenti-ADAR1S ou lenti-ADAR1L, mais uma vez o apoio a estes eventos de edição para ser mediada por ADAR2.
As células Huh-7 foram transfectadas com as construções de plasmídeos que expressam tanto o sentido (S), ou o complementar de sentido inverso (aS) transcritos de pri-miR-214 (a) e pri-miR-122 (B), e, em seguida, infectadas com lenti-Adars como indicado. O ARN foi extraído de cada preparação de células para subsequente análise de sequenciação directa de RT-PCR e. Os resultados aqui apresentados são representativos, com foco nas regiões que abrangem os resíduos identificados como os principais locais de edição (como revelado na Figura 2), incluindo -37 e -28 para a pri-miR-214 e -7 e 57 de pri-miR -122 (marcado com setas). Os resíduos de nucleótidos que mostram eventos de edição são marcadas com asteriscos vermelhos.
Uma vez que a análise geral RT-PCR e seqüenciamento que usamos anteriormente não consegue distinguir os eventos de edição em sentido ou anti-transcrições. Nós, portanto, procurou-se verificar a análise específica RT-PCR e sequenciação específica A-to-I edição a transcritos antisenso de pri-miR-214 por mecha. O RNA extraído de três HCC com ADAR2 elevada (Fig. 2, os pacientes 11, 13 e 20) foram processados para a cadeia específica de RT-PCR, para amplificar os transcritos primários destes dois pri-miARNs e também os seus transcritos anti-sentido complementares, para análise de sequenciação. É de notar, em células de neuroblastoma, Loebel et al. já relatado que o gene que codifica o miR-214 está localizado dentro de um transcrito de 7,9 kb não codificante complementar à região intrónica de dinamina-3 (DNM3), entre o exão 12 e 13 deste gene (Fig. 4A) [18]. Auxiliado por as duas bases de dados, e GeneMark GENSCAN, um curto transcrito complementar a miR-122 foi previsto (Fig. 4B).
ilustração esquemática das estruturas dos genes para os transcritos de ARN complementares a (a) pri- miR-214 e (B) pri-miR-122. (C) Os resultados representativos para a sequenciação dos produtos de RT-PCR específica de filamentos de HCC com eventos de edição putativos no sentido (S) e antisense (AS) transcrições de pri-miR-214 e pri-miR-122, focando as regiões que abrangem os locais com potenciais eventos de edição com a edição marcados com asteriscos vermelhos.
o sequenciamento resultados mostraram que os eventos de edição ocorreu principalmente nas transcrições complementares para pri-miR-214, mas não no transcrições sentido nessas amostras HCC (Fig. 4C, painel esquerdo, -28 e -37 de pri-miR-214). É suportado que as alterações mediadas ADAR2-L-a-C pode ser atribuído a um-para-I edição no transcrições complementares de pri-miR-214 em amostras clínicas. Em contraste, no caso de edição em locais com um padrão de um-para-G ocorreu principalmente no sentido transcrito nestes HCC (Fig. 4C, painel da direita, -7 de pri-miR-122).
ADAR2 mediada edição na RNA transcrito complementar para Pri-miR-214 Funcionalmente afeta o gene alvo de miR-214
a questão seguinte é examinar o efeito funcional da edição ADAR2 mediada na biogênese destes dois miARNs. Para primeiro foco no miR-214, foi analisado o efeito da sobre-expressão em ADAR2 miR-214, bem como os seus precursores em células Huh-7, com as células que sobre-expressam ADAR1S e ADAR1L incluídas como controlos. A endógeno de miR-214 foi reduzida de forma significativa por sobre-expressão de ADAR2 mas não por ADAR1S e ADAR1L (Fig. 5A, painel esquerdo). Ambos pri-miR-214 e o anti-sentido complementar (AS) transcritos de ARN (endógeno) também foram reduzidas por sobre-expressão de ADAR2 (Fig. 5A, meio e painéis da direita).
(A) O RNA extraído de Huh -7 células infectadas com lenti-Adars individuais tal como indicado foi utilizado para a avaliação dos níveis de endógena miR-214 (à esquerda), pri-miR-214 (meio), e transcrito anti-sentido complementares do miR-214 (comp-aS-ARN ) (certo). (B) Os lenti-Adars individuais foram infectadas para células Huh-7, as quais já foram transfectadas com os plasmídeos que expressam quer exogenamente a pri-miR-214 ou a transcrição de sentido inverso complementar (comp-AS-ARN), tal como indicado. O ARN foi extraído para a quantificação dos níveis de ambos os transcritos em conformidade. (C) As células Huh-7 foram transfectadas com o plasmídeo que expressa o de tipo selvagem comp-AS-ARN, ou os introduzindo quer a mutação única como A (-37) G ou duplas mutações como A (-37 /-28 ) G. Os níveis de transcrição anti-sentido foram então determinados por qRT-PCR. (D) As células Huh-7 não foram infectadas (simulada), infectadas com o controle de lenti-si-GFP (si-GFP), ou infectadas com lenti-si-AS-214, que tem como alvo o transcrito de RNA complementar a pri-miR -214, para avaliar os efeitos sobre os níveis de comp-aS-ARN (esquerda), pri-miR-214 (meio), e miR-214 (à direita) de expressão. (E) As células Huh-7 foram transfectadas com o vector de controlo ou o plasmídeo que expressa o comp-AS-ARN, para avaliar o efeito sobre os níveis de comp-AS-ARN (esquerda), pri-miR-214 (meio) e amadurecer miR-214 (à direita). (F) Os lisados de proteínas extraídas de Huh-7 células não infectadas ou infectadas com lenti-Si-Luc ou lenti-pri-miR214 foram analisados por análise de transferência de Western (esquerda). As células Huh-7 transfectadas com pGL3-vetor ou pGL3-Rab15-3’UTR construções repórter foram infectados com lenti-si-GFP ou lenti-pri-miR214. O efeito na actividade repórter foi ilustrado em relação à de pGL3-transfectadas com vector de células infectadas com lenti-Si-GFP (centro). Os lisados de proteínas extraídas de células Huh-7, quer não infectadas ou infectadas com várias lentivírus como descritos foram processados por Western blotting, sondagem com anticorpos contra Rab15, ADAR1, ADAR2, e β-actina (à direita).
Para examinar ainda mais os efeitos de edição em cada transcrição individualmente, a transcritos antisense complementares pri-miR-214 e foram sobre-expressos em células Huh-7 separadamente, em combinação com Adars individuais. Apenas o transcrito de ARN complementar foi diminuída por ADAR2 (Fig. 5B, painel esquerdo). Introdução das modificações A-para-G nas posições -28 e -37 do transcrito complementar reduziu o seu nível de ARN, semelhante à causada por sobre-expressão de ADAR2 (Fig. 5C). É assim demonstrado que ADAR2 poderia causar uma redução do transcrito de ARN complementar à pri-miR-214, através do A-para-I na edição seus resíduos específicos de -28 e -37 posições.
Como observamos , não existe qualquer efeito directo do ADAR2 na sobre-expresso pri-miR-214 (Fig. 5B, painel da direita, pista 4), mas que causou uma diminuição de endógena pri-miR-214 (Fig. 5A, painel do meio, pista 4). É levantada a possibilidade de que a edição ADAR2 causou uma diminuição da transcrição complementares, que por sua vez diminui o transcrito de ARN de pri-miR-214. Para resolver isso, que derrubou o transcrito de RNA complementar a pri-miR-214 em Huh-7 células (Fig. 5D, painel esquerdo), o que levou a uma diminuição de pri-miR-214 (Fig. 5D, painel do meio) . Um efeito regulador positivo da transcrição complementares sobre o nível de pri-miR-214 foi implicada. Em consonância com isso, a sobre-expressão de ARN de sentido inverso complementar aumentou tanto o pri-miR-214 e miR-214 maduro (Fig. 5E).
Para examinar melhor o efeito funcional do evento edição ADAR2 mediada na gene alvo de miR-214, tentámos primeiro a identificar o seu gene alvo putativo em hepatócitos. Os algoritmos PicTar, TargetScan, e Miranda apontou Rab15, um membro da família oncogene RAS, como um gene putativo alvo miR-214. Para testar isto, que sobre-expressa o miR-214 em células Huh-7 com infecção por lenti-pri-miR-214 lentivírus, o que resultou numa diminuição do nível de proteína Rab15 (Fig. 5F, painel esquerdo). A infecção de lenti-pri-miR-214 também poderia reprimir a atividade de repórter luciferase pGL3-Rab15-3’UTR (Fig. 5F, painel do meio), que apoiar o miR-214 poderia reprimir a expressão de Rab15 orientando a sua 3’UTR. Além disso, a sobreexpressão de ADAR2, mas não ADAR1S e ADAR1L, causou um aumento de Rab15 (Fig. 5F, painel da direita), sugerindo que o evento de edição ADAR2 mediada tem efeito funcional no gene-alvo de miR-214.
o transcrito de ARN complementares a Pri-miR-122 regula o nível de expressão de miR-122
Uma análise semelhante para miR-214 também foi aplicada para resolver o efeito de edição ADAR2-mediada para miR-122. Em primeiro lugar, o efeito de Adars individuais sobre madura miR-122 foi avaliada em células HepG2, mas não mostram efeitos significativos (Fig. 6A). Introdução de um-para-G mutação na posição -7 do pri miR-122-transcrição, o principal local editada, não causou alterações significativas nos níveis de miR-122 (Fig. 6B). Portanto, a edição ADAR2 mediada em pri-miR-122 transcrição não afetou seu processo biogênese.