Abstract

Os isotiocianatos a partir de plantas da ordem

Brassicales

são considerados câncer promissor fitoquímicos quimioterápicos. No entanto, sua citotoxicidade selectiva sobre câncer de fígado foi mal pesquisado. Portanto, no presente estudo, foram estudados sistematicamente a potência quimioterápico de isotiocianato de 4-metiltiobutilo (MTBITC). toxicidade seletiva foi investigado pela comparação do seu efeito sobre as células de câncer de fígado e suas subpopulações quimiorresistentes de hepatócitos primários normais e fatias de tecido do fígado. Além disso, em uma primeira avaliação, o

in vivo

tolerabilidade do MTBITC foi investigado em camundongos. parada do crescimento na M e apoptose indução /G2 foi evidente em todos os

In vitro

modelos de cancro tratados com MTBITC, incluindo populações com características de câncer de iniciação. Isto foi encontrado independente de TP53; No entanto a morte celular foi atrasado em células comprometidas p53 em comparação com células wt p53 que foi provavelmente devido a diferenças de BH3 única regulação de genes i. e. Noxas e o seu antagonista A1. Em hepatócitos normais, não apoptose ou necrose poderia ser detectado após a administração repetida de até 50 mM MTBITC. Em ratinhos, aplicada por via oral foi bem tolerado MTBITC mais de 18 dias de tratamento para até 50 mg /kg /dia, a dose mais elevada testada. Em conclusão, podemos mostrar aqui que o efeito de eliminação de MTBITC tem uma seletividade definitiva para as células cancerosas sobre as células normais do fígado e sua citotoxicidade aplica-se mesmo para células cancerosas iniciar quimiorresistentes. O nosso estudo poderia servir para uma melhor compreensão das propriedades de isotiocianatos quimioterapêuticos em células cancerosas humanas derivadas do fígado

citação:. Lamy E, Hertrampf A, C Herz, J Schüler, Erlacher H, Bertele D, et ai . (2013) pré-clínica Avaliação de 4-metiltiobutilo isotiocianato de cancro do fígado e cancro da Stem Cells com diferentes status p53. PLoS ONE 8 (8): e70846. doi: 10.1371 /journal.pone.0070846

editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Reino Unido

Recebido: 07 de maio de 2013; Aceito: 23 de junho de 2013; Publicação: 02 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lamy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. EL é financiado por uma bolsa acadêmica da Fond social Europeu e pelo Ministério da Ciência, Investigação e Artes de Baden-Württemberg, Alemanha. A. B. foi apoiado para este estudo por uma bolsa da Fundação Alexander von Humboldt Fellowship para investigadores experientes. A taxa de processamento artigo foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) e da Universidade Ludwig Albert, Freiburg na publicação Programa de Financiamento Open Access. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Torsten Giesemann e Julia Schueler são empregados assalariados de Oncotest GmbH. Este trabalho não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o câncer mais comum do sistema digestivo no Sudeste Asiático e África Subsaariana; um aumento da incidência também está a ser notado no mundo industrializado [1]. O prognóstico para pacientes com HCC maior ou multifocal é pobre, com a taxa de sobrevida de 5 anos é inferior a 5% [2]. Isto é principalmente devido à falta de resposta à quimioterapia e radioterapia no tratamento do carcinoma hepatocelular e da função prejudicada TP53 foi identificado como factor importante para este [3]. TP53 é um jogador-chave na paragem do crescimento e apoptose [4] e um dos genes supressores de tumor mais frequentemente mutado em HCC [5]. Além disso, o conceito de que as células-tronco do cancro altamente resistentes ao tratamento (células iniciadoras de tumor, TIC) desempenham um papel central na patogénese do carcinoma hepatocelular tem recentemente capturado muita atenção. TIC são capazes de auto-renovação, diferenciação e manutenção do crescimento do tumor e heterogeneidade. tratamentos antineoplásicos comuns tais como a radiação e a quimioterapia não erradicar a maioria das TIC altamente resistentes [6]. Assim, em busca de estratégias alternativas de terapia que afetam de forma eficaz estas subpopulações, superando assim a resistência do tumor e não dependem de p53 intacta para matar células de câncer é de extrema importância [7].

Os isotiocianatos (ITC) de plantas da fim

Brassicales Quais são atualmente de grande interesse devido ao seu potencial de aplicação na prevenção e tratamento do câncer. Numerosas investigações mostram que ocorre naturalmente ITC e seus análogos sintéticos retardar ou inibir o crescimento de células tumorais, tanto

in vitro

e

in vivo

[8], [9]. Mais importante, foi demonstrado recentemente que a TCI pode suprimir a aldeído desidrogenase (ALDH) -positivo TIC da mama [10] e da próstata [11]. No entanto, a eficácia da ITC contra TIC de outros órgãos, incluindo o fígado, está ainda a ser determinado. Em geral, a informação sobre o potencial citotóxico e de ITC citostático em células de tumor do fígado é escasso [12] – [14]. É um pré-requisito que os agentes terapêuticos potenciais mostrou baixa toxicidade nos tumor normal de tecido circundante, existe ainda apenas informações muito limitadas sobre os efeitos da ITC em tecidos saudáveis. Aqui descreve-se a actividade antineoplásica de isotiocianato de 4-metiltiobutilo (MTBITC, erucin) e a sua morte selectiva das células tumorais e TIC através de um mecanismo independente de p53. MTBITC é obtido a partir da hidrólise enzimática de glucoerucin, isolado de espécies de plantas do foguete (

Eruca sativa Mill

. E

Diplotaxis tenuifolia L

.). Além disso, ele é derivado

In vivo

por redução metabólica do sulforafano isotiocianato, que é característica de bróculos (

Brassica oleracea L.

). Para os nossos estudos, utilizamos um conjunto de

in vitro

modelos que consistem em linhas HCC celulares, resistente à quimioterapia TIC, hepatócitos normais primárias e fatias de tecido de fígado de corte de precisão (PCLS) derivadas de pacientes para estudar o cancro citotoxicidade selectiva de MTBITC . Nossos resultados foram, então, comprovadas através de estudos mecanicistas sobre TP53 ativação da via diferencial após tratamento MTBITC. Com base em nossa

in vitro

resultados finalmente investigou a tolerabilidade do MTBITC em um modelo de mouse.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

hepatócitos normais foram obtidos de pacientes após o seu consentimento informado por escrito do Departamento de Cirurgia da Universidade de Freiburg Medical Center, na Alemanha. Esta parte foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Freiburg (Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg /Comissão de Ética da Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). Para experiências de corte de tecido, fígado humano e resectates tumor no fígado foram obtidas de pacientes após o seu consentimento informado por escrito do Departamento de Geral, Visceral Cirurgia de Transplante do Hospital Universitário, Tübingen, Alemanha. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Comissão de Ética da Faculdade de Medicina da Eberhard-Karls-University e da University Clinic Hospital Tuebingen). Experimentos em animais foram realizados de acordo com as directrizes do Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz) e sob os números de permissão do Regierungspräsidium Freiburg, Alemanha G-10/05 e 35-9.185,64 /1. saúde animal foi examinado antes da aleatorização para assegurar que apenas os animais sem quaisquer sintomas de doença foram seleccionados para entrar os procedimentos de teste. Durante os experimentos, os animais foram monitorados duas vezes por dia quanto à condição geral, os alimentos e abastecimento de água.

Chemicals

DMSO, verapamil-cloridrato, dexametasona, erysoline, etanol, iodeto de propídio (PI) e neutra vermelho (NR) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemanha). Dulbecco Minimal Essential Médium (DMEM), soro fetal de vitelo (FCS), tripsina 10 × (25 mg /ml), tripsina-EDTA a 10 × (5 mg /ml), Hanks tampão de sal equilibrada (HBSS sem Ca e Mg) e salina tamponada com fosfato (PBS, sem Ca e Mg) foram de PAA Laboratories GmbH (Cölbe, Alemanha). Penicilina-estreptomicina (P /S) e solução Hoechst 33342 solução (10 mg /mL), meio RPMI 1640, a insulina-transferrina-Selen (ITS), colagenase de tipo IV, e 5,5 ‘, 6,6’-tetracloro-1 , 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodeto (JC-1) foram de Invitrogen Life Technologies (Darmstadt, Alemanha), reagente WST-1 a partir de Roche (Mannheim, Alemanha). Accumax foi comprado de eBioscience (Frankfurt, Alemanha), colagénio a partir de L Schubert Weiss (Munique, Alemanha), colagenase II a partir de CLS Biochrom (Berlim, Alemanha) e EDTA a partir de Serva Electrophoresis (Heidelberg, Alemanha). CaCl

2, Glicose, EGTA, ácido acético (pureza de 100%), Roti®-fenol /clorofórmio /Isoamylalkohol e clorofórmio /Isoamylalkohol foram adquiridos da Carl Roth (Karlsruhe, Alemanha), A camptotecina (CPT) a partir de Tocris (Eching, Alemanha), Caspase 3/7 GLO reagente de Promega (Mannheim, Alemanha) e Triton X-100 da Merck (Mannheim, Alemanha). Rompun 2%, e xylazinchloride foram adquiridos a partir da Bayer (Leverkusen, Alemanha), 10% e ketanest ketaminiumchloride de Essex Tierarznei (Munique, Alemanha). 4-metiltiobutilo isotiocianato (MTBITC, erucin) foi sintetizado pelo Inst. of Organic Chemistry, Universidade de Giessen, Alemanha, tal como descrito antes [15]. Valinomicina foi adquirido à Fluka (Buchs, Suíça). ITC foram dissolvidos em DMSO estéril.

linhas de células de carcinoma hepatocelular, isolamento e cultivo de HCC explantes e hepatócitos

linhas de células de carcinoma hepatocelular.

HepG2 (WT-53) e Hep3B ( null-p53) linhas de células foram obtidas a partir da Colecção alemã de Microrganismos e culturas celulares (DSMZ), Braunschweig, Alemanha. células Huh-7 (MUT-p53), fundado originalmente pelos Nakabayashi et al. [16] foram gentilmente cedidas por H. Blum (Centro Médico da Universidade de Freiburg, Alemanha). As células foram cultivadas em baixo DMEM de glucose suplementado com 15% (HepG2) ou 10% (Huh7, Hep3B) de FCS e 1% de P /S em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C até 70% de confluência e subsequentemente colhidas com tripsina. verificação linha celular foi feito por verificação microscópica da morfologia das células e para a análise da curva de crescimento, numa base regular. Apenas as células em número de passagem de quatro a dez foram usadas. A cultura de células foi ainda testado negativo para contaminação por micoplasma.

explantes HCC.

tumor no fígado humano engraftments (LIXF, xenotransplante câncer de fígado Freiburg), originalmente estabelecido pelo Oncotest GmbH, Alemanha, foram cultivadas por via subcutânea em ratinhos nus como descrito noutro local [17]. Os explantes foram enviadas para o nosso laboratório imediatamente após a cirurgia, evitando o arrefecimento ou outras manipulações. O procedimento para a preparação de culturas foi de acordo com Patrawala

et al.

[18].

hepatócitos primários humanos.

hepatócitos normais foram isolados dentro de 2 h. Avaliação do parênquima hepático não-tumoral foi realizada por um patologista sênior, com experiência em patologia hepática. Os hepatócitos foram isolados usando a técnica de dois passos perfusão com colagenase de acordo com um protocolo modificado a partir de Guguen-Guillouzo

et ai.

[19] e Strom

et ai.

[20]. As células foram, em seguida, finalmente ressuspensas em meio RPMI-1640 suplementado com 15% de FCS, 2 mM de L-glutamina 1% de P /S, 1% de ITS, 100 nM de dexametasona e cultivadas num CO 5%

2 atmosfera a 37 ° C durante 20 h.

hepatócitos de murino.

hepatócitos de ratinho foram isolados de fresco com uma técnica de perfusão semelhante ao descrito para hepatócitos humanos e cultivadas num CO 5%

2 atmosfera a 37 ° C durante 10 h.

Tissue-cut de precisão que corta (PCLS)

O fatiamento iniciada dentro de uma hora de ressecção em um vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Alemanha) como descrito anteriormente [21] As fatias foram incubadas em oxigenado meio e de William contendo glucose 25 mM e 50 ug /ml de gentamicina (Lonza Bioscience, Verviers, Bélgica), numa atmosfera oxigenada (80% de oxigénio, 5% de CO

2).

Determinação da droga efeito em células cancerosas

para as experiências, as células de cancro foram semeadas, suplementado com meio de cultura e incubou-se durante 48 h a 37 ° C. Subsequentemente, as células subconfluentes foram expostas a ITC durante 24 h a 96 h. Para a exposição 24 h, o meio de cultura, contendo ITC foi substituída a cada 24 h

Detecção de citotoxicidade

ensaio de retenção de vermelho neutro

O ensaio de retenção de vermelho neutro.. determina a acumulação do corante vermelho neutro em lisossomas de células viáveis ​​não lesionados, o qual foi utilizado como um outro parâmetro para a detecção de citostase /citotoxicidade. Após a exposição composto, as células foram incubadas durante 3 h com corante NR (50 ug /ml) dissolvido no meio de cultura correspondente. As células foram depois lavadas cuidadosamente com PBS e pré-aquecido a 150 ul meio de fixação (EtOH: AcCOOH: água desionizada, 50%: 1%: 49%) foi adicionado seguido por agitação suave durante 20 min. Absorbância foi registrado a 540 nm usando um leitor de microplacas Tecan.

Detecção de apoptose e Crescimento Arrest

Caspase 3/7 ensaio de clivagem.

A indução de apoptose em linhas celulares e células primárias foi determinada usando o ensaio de Caspase3 /7-Glo (Promega, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

apoptose em fatias de tecido de fígado foi determinada por incubação com 50 jiM de

N

-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarina (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburgo, Alemanha) em tampão de ensaio (HEPES 50 mM, pH 7,4, 1% de sacarose, 0,1% de CHAPS, 10 mM DTT). A clivagem do substrato foi medida cineticamente por espectrofluorimetria. Caspase 3/7 actividade foi determinada como a inclinação das regressões lineares resultantes e expressa em unidades de fluorescência arbitrárias por minuto.

Avaliação do potencial de membrana mitocondrial (MMP).

Para a detecção de alterações na MMP no nível de uma única célula, o catião lipófilo JC-1 foi utilizado como descrito noutro local [14].

SubG1 conteúdo de DNA e do ciclo celular de distribuição.

Para a detecção da distribuição do ciclo celular , foi utilizada coloração PI de DNA após a fixação, como descrito em outros lugares [14].

detecção de necrose

iodeto de propídio (PI) ensaio de absorção.

O ensaio é baseado na quantificação de PI manchado células necróticas. Portanto, depois de exposição ao composto, PI (2 ug /ml) foi adicionada a cada poço de uma placa de microtítulo de 96 poços durante 5 minutos a temperatura ambiente sob agitação contínua. Em seguida, as placas foram centrifugadas a 189 g (3 min, RT). A quantidade de fluorescência de PI intracelular foi medida utilizando um leitor de microplacas Tecan no Ex.:. 525 nm /Em595 nm

ensaio de libertação de LDH para fatias de tecido

A percentagem de lactato desidrogenase (LDH), libertação para o sobrenadante como substituto para a integridade da membrana foi determinada utilizando o ensaio de LDH Mono-P (ANALYTICON, Lichtenfels, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de LDH libertada para ser sobrenadante foi determinada e normalizada para o conteúdo de proteína das fatias individuais, que foi determinada por um ensaio BCA Pierce (Thermo Scientific, Dreieich, Alemanha).

Isolamento e Análise de Side População (SP ) As células

e células SP não-SP foram analisados ​​e isolados a partir de células Huh7 como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, as células Huh7 foram tripsinizadas, contadas e um milhão de células /ml ressuspensas em DMEM w /o vermelho de fenol contendo 2% de FCS e 10 mM de HEPES. As células foram coradas com 20 ug /ml de Hoechst 33342 sozinho ou em conjunto com verapamil (50 uM) a 37 ° C durante 90 min. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com HBSS frio gelo contendo 2% de FCS e 10 mM de HEPES. Análise e classificação de células SP e não-SP foi realizada utilizando MoFlo (DakoCytomation). Em seguida, as células foram lavadas com HBSS, contadas e semeadas em placas de cultura durante mais 24 h. As células foram então expostas a MTBITC e subsequentemente utilizado para a análise.

A detecção de aldeído-

Expressão da enzima aldeído-(ALDH) foi analisada utilizando o Kit ALDEFLUOR de StemCell Technologies (Grenoble, França) de acordo com o protocolo do fabricante. Como controlo positivo, o DEAB inibidor da ALDH, que foi fornecido no kit, foi usado.

A migração celular (zero) Ensaio

O ensaio zero foi realizado conforme descrito em outro lugar [23]. imagens microscópicas luz adquiridos para cada amostra foram analisados ​​quantitativamente usando o software de computação J Imagem (https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). Para cada imagem, as distâncias entre um lado de zero e o outro foi medida. Ao comparar as imagens de tempo 0 para o ponto última vez (72 h) a distância de cada fechamento zero foi obtido e a meia-hora para o encerramento gab calculado.

Sincronização celular por Serum privação e DMSO

para a sincronização de células em G0 /G1, o meio foi removido a partir de células HepG2 e substituído por meio sem FCS durante 96 h. Após esse período, as células foram expostas quer a DMSO ou MTBITC durante mais 24 h em meio contendo diferentes concentrações de FCS. As células foram então colhidas e analisadas quanto à sua distribuição de conteúdo de ADN.

Num segundo conjunto de experiências, 2% de DMSO foi adicionado ao meio de cultura de células HepG2 aderente crescimento durante 72 h. Em seguida, as células foram fornecidas com meio de cultura fresco contendo DMSO ou MTBITC durante 24 h, subsequentemente colhidas e analisadas quanto à sua distribuição de conteúdo de ADN.

In vivo

tolerabilidade de MTBITC

Crl: nU-Foxn1mice (ratinhos nus) foram adquiridos de Charles River, Erkrath, Alemanha e obtido em microisolators em condições de barreira. O tratamento foi feito por sonda oral diariamente com veículo ou MTBITC suspenso no veículo por 18 dias.

Gene Análise da expressão de p53 usando Quantitative PCR em Tempo Real

O RNA total foi isolado com o mini kit de isolamento RNeasy da Qiagen (Hilden, Alemanha), seguido por um passo de purificação utilizando o kit de DNase isenta de RNase da Qiagen (Hilden, Alemanha). Um total de 2 ug de ARN de cada amostra foi utilizada para a produção de cDNA usando a primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit de Fermentas (St. Leon-Rot, Alemanha). As amostras de cDNA foram então diluídas 1:02 – 1:05 e amplificado com o LightCycler FastStart DNA mestre

PLUS SYBR Green I kit da Roche (Mannheim, Alemanha). ADNc de p53 foi amplificado utilizando sentido 5′-CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 ‘, e anti-sentido 5′-TCATAG GGCACCACCACACT-3′ Os oligonucleótidos que produzem um fragmento de 371 pb. O ADNc de microglobulina beta-gene de referência foi amplificado utilizando sentido 5’-AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 ‘e anti-sentido 5′-ACGGCAGGCATACTCATCTT-3’ Os oligonucleótidos que produzem um fragmento de 248 pb. Todos os pares de iniciadores transversais limites intrão /exão e, portanto, os produtos de PCR não representam a contaminação de ADN genómico. As condições de PCR foram: primeiro 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 s, 59 ° C durante 10 s e 72 ° C durante 30 s. Os produtos de amplificação foram quantificados com o software LightCycler 2.0 a partir de Roche, Mannheim, Alemanha, através da preparação de uma curva padrão utilizando diluições conhecidas do ADNc padrão. Para normalizar a expressão de ARNm de p53 para diferenças de amostra-a-amostra na entrada de ARN, ARN de qualidade, e a eficiência da transcriptase reversa, o gene de referência beta-microglobulina foi amplificado em paralelo. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

Gene Expression Analysis usando uma matriz de via de sinalização

isolamento de ARN a partir de 10

6 células por amostra foi realizada com o RT

2 qPCR -grade Kit de Isolamento de RNA (SABioscience, Frederick, Maryland, EUA). O ADNc foi sintetizado utilizando a RT

2 Disposição de PCR kit First Strand Synthesis (SABioscience, Frederick, Maryland, EUA). Quantitativa PCR em tempo real da via de sinalização p53 humana RT

2 Matriz Profiler ™ (catalogar no .: HAP-027, SABioscience, Frederick, Maryland, EUA) foi feito através de um Sistema de Detecção de PCR MyiQ Single-Cor Real-Time (Bio-Rad, Munique, Alemanha). Para análise dos dados do RT baseado na web

2 Matriz Profiler ™ PCR análise dos dados foi utilizado. Os dados foram analisados ​​pelo “2

-ΔΔCt método ‘usando o software fornecido pelo fabricante. Para cada gene, dobra-a mudança foi calculada como a diferença na expressão do gene entre dois grupos. Os resultados foram expressos como a média de 3 experiências independentes.

análise de proteínas por imunotransferência

A concentração de proteína foi determinada como descrito por Bradford [24]. Para imunotransferência, 20 ug de proteína foram misturadas com tampão de amostra contendo SDS preparado, suplementado com 0,5% β-mercaptoetanol. A electroforese foi realizada de acordo com o método de Laemmli [25]. O gel foi então transferido para uma membrana de nitrocelulose por transferência de tanque. Os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 5% de leite com baixo teor de gordura em TBS /T e incubadas com primária, e, subsequentemente, a peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpo secundário durante 1 h, ou durante a noite. Após incubação do anticorpo, as proteínas de interesse foram detectadas por quimiluminescência. Uma imagem digital do Western blot foi capturada por uma câmara CCD. aproximações de tamanho foram tomadas por comparação das bandas coradas com a de um padrão de proteína carregada durante a electroforese. O processo foi repetido para a proteína estrutural β-actina.

silenciamento de p53 por RNAi

células HepG2 foram colhidas por trypsination e 2,5 × 10

5 células foram sujeitas a transfecção com inverter Transpass R1 (sem .: M2551S) do NEB (Frankfurt a. M., Alemanha). Para a transfecção, 10 ul TransPass R1 foram misturados com 240 ul de DMEM e incubadas durante 15 min à temperatura ambiente antes da adição de oligómeros de siRNA (p53 atalho siARN da mistura, não .: N2011S, NEB, Frankfurt uma M., Alemanha;. Controlar gato siARN. . não SC-37007, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, EUA; fluoresceína conjugado siARN controlo, não .: N2100S, NEB, Frankfurt uma M., Alemanha) a uma concentração final de 25 nM, seguido por um outro passo de incubação à temperatura ambiente. durante 15 min a 250 ul de complexo de transfecção foram então transferidas para cada poço e as células HepG2 contendo DMEM + FCS 15% w /o antibióticos foram subsequentemente incubadas com o complexo durante 24 h sob condições de cultura de células padrão. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e suplementadas com DMEM fresco contendo 15% de FCS por mais 24 h antes da exposição à substância a testar, durante 24 h.

RT-MLPA e qPCR

RT- MLPA foi usada para analisar a expressão de ARNm de membros da família Bcl-2. ARN a partir de células HepG2 e Hep3B foi isolado como descrito acima. RT-MLPA (MRC Holland, RM002 kit, R011-C1) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os ARNm específicos foram reversamente transcrito em cDNA e ligado por dois oligonucleótidos consequentemente ligados por uma ligase termoestável. Cada sonda dá origem a um produto de amplificação do comprimento original separados por sequenciador capilar (Genescan). A análise foi realizada com GeneMapper (Applied Biosystems). A soma de todos os dados de pico foi definido como 100% para normalizar para as flutuações entre amostras diferentes, e os picos individuais foram calculadas em relação a 100%. Análise da regulação mRNA de Bcl-2 e Bmf não foi possível por razões técnicas.

Análise de Dados

Os resultados foram calculados utilizando Graphpad Prism 5.0 software (La Jolla, CA). O valor de concentração inibidora média crescimento (IC50) foi calculada após a normalização da resposta e transformação logarítmica com a seguinte equação: Y = 100 /(1 + 10

∧ ((LogIC50-X) * hillslope)). análise de variância entre os grupos foi realizada por ANOVA one-way e o significado da diferença entre os grupos de controle e tratamento foram analisados ​​utilizando Dunnett teste de comparação múltipla. As diferenças com p ≤ 0,05 (*) ou p≤0.01 (**) foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

citotoxicidade do ITC em células de tumor no fígado em relação ao normal hepatócitos

Foi utilizado o ensaio de retenção de NR para a avaliação do MTBITC citotoxicidade em células de câncer em comparação com hepatócitos normais. Este ensaio tem sido reportado como parâmetro citotoxicidade sensível elevada [26]. A perda de viabilidade, dependente da concentração, tal como determinado pela capacidade de retenção diminuída lisossomal NR foi observada em todas as células cancerígenas testadas após o tratamento MTBITC durante 24 h (Figura 1A). Em contraste, nos hepatócitos humanos, sem perda de viabilidade relevante foi observada dentro de 24-72 h tratados com 50 uM MTBITC (Figura 1B). Em hepatócitos de murino, MTBITC desencadeada alguns processos de ampliação da capacidade de acumulação de neutro-vermelho de lisossomas, após 72 h de tratamento MTBITC (Figura 1B). Com base nos resultados obtidos após 24 horas de tratamento MTBTIC, os valores de IC50 foram calculados a 23,18 uM (HepG2), 20,89 uM (Huh7), 31,97 uM (Hep3B), 13,11 uM (LIXF), 72.09 (hepatócitos humanos) e 47,81 (hepatócitos de murino) .

MTBITC tratamento atenua selectivamente a sobrevivência das células de células de tumor no fígado (a), em comparação com hepatócitos primários (b). A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de retenção NR após exposição a MTBITC durante 24-72 h. Os resultados foram expressos relativamente ao controlo (0.1% DMSO), as barras são a média + DP, (número de experiências independentes é dada a seguir as figuras). O controlo positivo (+), 0,01% de Triton X-100. ** ≤p 0,01 em comparação com DMSO

paragem do crescimento e apoptose em células de indução HCC humana e normal hepatócitos /PCLS

Para avaliar a natureza da deficiência viabilidade observada em MTBITC-. sublinhou células HCC, procurou-se estabelecer se isso foi devido a um impasse no crescimento celular, apoptose ou necrose tecidual (figura 2 e 3). Em primeiro lugar, analisou as células para a ativação caspase 3/7 como marcador de apoptose específica. Dentro de 24 h, a apoptose induzida MTBITC significativa a 25 uM, mas apenas em células HepG2 () p53 wt; nenhum aumento pode ser visto nas células, as células Mut-p53 (Huh7) sem p53 (Hep3B) ou LIXF (Figura 2A). hepatócitos normais permaneceram inalterados pelo tratamento, como investigado em células humanas ou de murídeo às 24 h (Figura 2C). Nós não conseguimos encontrar sinais que MTBITC induziram uma reacção necrótico nas células malignas ou normais, mesmo a 50