Abstract

Fundo

receptores de neurotrofina foram inicialmente identificados em células neurais. Eles foram recentemente detectada em alguns tipos de câncer em associação com a invasão, mas a função destes receptores tirosina quinase não foi previamente investigado em células de câncer colorretal (CRC).

métodos e resultados

Nós relatamos aqui que as linhas celulares de CRC humanos sintetizar o factor neural factor de crescimento neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), sob condições de stress (privação de soro). Em paralelo, células de CRC expresso elevada (TrkB) e baixa afinidade (p75

NTR) de receptores na membrana plasmática, enquanto que TrkA e TrkC, outros dois receptores de elevada afinidade para NGF e NT-3, respectivamente, eram indetectáveis. Nós demonstramos que o BDNF induziu a proliferação de células e tinham um efeito anti-apoptótico mediado através TrkB, tal como avaliado por K252a, um inibidor farmacológico Trk. É suprimida tanto a proliferação celular e sobrevivência de células de CRC que não expressam TrkA nem o TrkC. Em paralelo com o aumento da secreção de BDNF, sortilina, uma proteína actua como um transportador de neurotrofina, bem como um co-receptor para a p75

NTR, foi aumentada no citoplasma de células de CRC primários e metastáticos, o que sugere que sortilina poderia regular neurotrofina transporte nestas células. No entanto, pró-BDNF, também detectada em células de CRC, foi co-expressa com p75

NTR na membrana celular e de co-localizada com sortilina. Em contraste com o BDNF, a apoptose induzida por exógena-BDNF Pro CRC, o que sugere que um mecanismo de contrapeso está envolvido no controlo da sobrevivência de células de CRC, através sortilina como o co-receptor para a p75

NTR, o receptor de elevada afinidade para pro- neurotrofinas. Da mesma forma, mostramos que BDNF e TrkB transcrições (e não p75

NTR) são sobre-expressos em tumores dos pacientes em comparação com seus tecidos normais adjacentes, nomeadamente em estágios avançados da CRC.

Conclusão

Tomados em conjunto, estes resultados evidenciam que o BDNF e TrkB são essenciais para o crescimento de células de CRC e sobrevivência in vitro e em tumores. Este ciclo autócrino poderia ser de grande importância para definir novas terapias direcionadas

Citation:. Akil H, Perraud A, Melin C, Jauberteau MO, Mathonnet M (2011) Roles ajuste fino do fator neurotrófico derivado do cérebro endógena , TrkB e sortilin em celulares de cancro colorrectal Survival. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10.1371 /journal.pone.0025097

Autor: Mark P. Mattson, National Institute on Aging Research Program intramuros, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2011; Aceito: 23 de agosto de 2011; Publicação: 26 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Akil et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Ligue contre le Câncer e Conseil Régional du Limousin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

derivado do cérebro do factor neurotrófico (BDNF), um membro da família da neurotrofina, é conhecida por desempenhar um papel crítico na modulação da sobrevivência celular, diferenciação e apoptose no sistema nervoso [1].

sinais de BDNF, através de dois tipos de receptores de superfície celular: a alta-afinidade de quinase relacionadas com a tropomiosina (Trk) do receptor B (TrkB), um receptor de tirosina cinase e o receptor de baixa afinidade (p75

NTR), bem como um receptor de domínio de morte pertencente ao factor de necrose tumoral (TNF) família de receptores, um receptor comum para todos factor de crescimento do nervo neurotrofinas (NGF), a neurotrofina-3 (NT-3) e neurotrofina-4/5 (NT-4/5 ). As neurotrofinas são sintetizadas como precursores (proneurotrophins) que são proteoliticamente clivados para amadurecer neurotrofinas. Pro-BDNF de clivagem pode ocorrer intracelularmente pela acção da furina ou proconvertase, ou extracelularmente pela acção da plasmina, de matriz metaloproteinase 7 (MMP-7) ou MMP-9 [2]. Ambos amadurecer BDNF e pro-BDNF são biologicamente ativos, com papéis divergentes que refletem afinidades aos receptores diferentes: pro-BDNF mostra afinidades mais elevadas para p75

NTR, enquanto BDNF maduro tem maiores afinidades para TrkB

liga BDNF. o receptor de TrkB de comprimento completo 145 e uma variante gp95TrkB truncada que retém a actividade directa de sinalização [3] e aumenta a especificidade para o BDNF [3], [4], [5]. Enquanto os receptores trk estão envolvidos na maioria das propriedades de sobrevivência e crescimento das neurotrofinas, as funções de p75

NTR, extensivamente estudado em neurónios, depende do tipo de célula neuronal, a presença de ligando, e a sua associação com um co- receptor. Com efeito, p75

NTR associada com Melhora co-receptor Trk [6] ou suprimir a sobrevivência celular mediada por neurotrofina [7]. Foi recentemente mostrado ser capaz de se ligar pró-BDNF e induzir a morte celular quando associado com sortilina (um membro da Vps10p-domínio família de receptores) [8], [9], [10].

Assim , a regulação dos pro-BDNF processamento adiciona controle adicional sobre o equilíbrio entre a p75

NTR e engajamento TrkB [11], [12]. A função anti-apoptótica do BDNF é mediada embora a interacção com a elevada afinidade dos receptores 95 e 145TrkB [5], enquanto pró-BDNF induz a apoptose através da interacção com um complexo receptor de p75

NTR e sortilina [10], [13].

sortilin é expresso em vários tecidos, especialmente o cérebro, a espinal medula, coração, músculo, adipócitos [14] e linfócitos B [8]. Sortilin foi inicialmente descrita em células neurais como uma proteína de transporte intracelular de neurotrofinas e proneurotrophins [15] e, mais recentemente, como transportador de Trk receptores de neurotrofina em células neurais [16]. Além disso, também foi sortilina conhecido como um receptor de co (NTSR3) para um receptor acoplado a proteína G, o receptor-1 neurotensina (NTSR1) que é activado pela neurotensina [17]. Neurotensina foi inicialmente demonstrado desempenhar um papel no crescimento e sobrevivência das células do cancro colo-rectal (CRC), através da sua ligação a esta sortilina /NTSR1 complexo [18].

BDNF tem sido implicado na patogénese e prognóstico de numerosas doenças malignas humanas, tais como os neuroblastomas [19], [20], meduloblastoma [21], o cancro da próstata [22], [23], o cancro do pulmão [24], carcinoma pancreático [25], [26], [27], e carcinoma hepatocelular [28]. Em CRC, uma sobre-expressão de BDNF [29] e TrkB [30] Recentemente, foi relatado nos tecidos dos pacientes, mas não há promoções de dados com a função de BDNF como um alças autócrinas em sobrevivência de células de CRC. Desde expressão TrkB está associada a vários tipos de câncer; o objetivo deste estudo foi o de definir as condições de secreção endógena de BDNF e expressão de receptores de neurotrofina no CRC. Aqui, mostra-se que o BDNF endógena é segregado pelas células de CRC submetidos ao soro privação e induz a sobrevivência celular por meio do receptor de cinase TrkB tirosina que é expresso na membrana de células estressadas. Vale ressaltar que TrkB e expressão BDNF foi reforçada nos tumores dos pacientes, especialmente em estágios avançados. Colectivamente, estes dados apontam a relevância da BDNF via /TrkB no potencial de crescimento e capacidade de invasão de CRC.

Materiais e Métodos

células e cultura

linhas celulares de CRC Humano correspondendo a diferentes fases de tumor foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection. WiDr [31] e SW480 [32] foram primário linhas celulares de CRC-derivados, ao passo que as outras duas linhas foram derivadas de metástases de CRC, no nódulo linfático (SW620 derivado do mesmo paciente, como a linha SW480) [32] e ascite (COLO 205) [33]. Em condições basais, as células WiDr foram mantidas em meio MEM (Gibco) suplementado com inactivado pelo calor 10% Soro Fetal de Vitelo (FCS) (Gibco), piruvato de sódio 1 mM (Gibco), aminoácidos essenciais que não a 1% (Gibco), 100 UI /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco). SW480, SW620 e Colo 205 linhas foram cultivadas em meio RPMI (Gibco) suplementado com 10% de FCS, 100 UI /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina, a 37 ° C sob atmosfera húmida e 5% de CO2. As células cultivadas foram enfatizado por 24 a 72 h privação de soro. O clone 35.928,11 (10 ug /mL) Rato anticorpo monoclonal anti-BDNF antagonista (mAb) foi comprada a Calbiochem. O BDNF recombinante humano (100 ng /ml), BDNF recombinante pró-(4 ng /ml), e o K252a (200 nM) foram adquiridos dos laboratórios Alomone.

Pacientes e amostras de tecido

Todos tecidos derivados do paciente foram coletados e arquivados, no Tumorotheque do Hospital Universitário de Limoges, no âmbito de protocolos aprovados pelo Conselho de revisão Institucional (AC N 2007-34, DC 2008-604 e 72-2011-18). consentimento informado por escrito foi obtido por todos os assuntos para este estudo. Os tecidos tumorais foram obtidos de 20 pacientes, que foram submetidos à remoção cirúrgica do CRC no Hospital Universitário de Limoges entre janeiro de 2006 e fevereiro de 2007. Os pacientes Quatro adenocarcinoma por estágio (de acordo com a classificação pTNM [34]) foram escolhidos para este estudo. Os tecidos de quatro pacientes com uma doença benigna colorrectal, megadolichocolon, foram utilizados como controlos.

análise de RT-PCR

linhas celulares de CRC foram cultivadas em meio contendo ou não 10% de FCS, durante 24 a 72 -H. SV total do sistema de isolamento de ARN (Promega) foi usado para isolar o RNA total a partir das linhas de células, tal como descrito nas instruções do fabricante. A quantidade de RNA extraído foi quantificada pela medição da absorvância a 260 nm utilizando o espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Labtech). A pureza do ARN foi verificada pela razão DO260 /DO280 nm entre 1,83 e 2,00. A ausência de degradação do ARN foi confirmado por electroforese num gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etídio. A extracção de ARN a partir de tecidos dos pacientes foi realizada como descrito [35]. síntese da primeira cadeia de ADNc foi gerado utilizando o SuperScript III (Invitrogen). A PCR foi realizada utilizando polimerase de ADN de Taq (Invitrogen). O ARN total isolado a partir de linhas de células humanas de neuroblastoma (IMR32, SH-SY5Y e células K562) erythromyeloblastoid de leucemia humana foram utilizados como controlos positivos. amostras (fabricado por omitindo a transcriptase reversa) não sujeitos a transcrição reversa foram corridas em paralelo com as amostras transcrito reversamente para excluir contaminação por ADN genómico.

Os iniciadores foram concebidos utilizando o iniciador 3 (fornecida no domínio público pela o Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica /MIT Center for Genomic Research, Cambridge, MA, e disponível em https://www.wi.mit.edu). pares de primers desenhados são listados, juntamente com seus tamanho do produto e de recozimento temperaturas esperadas na Tabela 1.

Sequencing

Após a extração de produtos de PCR com Rapid PCR Purificação Sistemas (MARLIGEN biociência), de acordo com as instruções do fabricante, os produtos de PCR foram directamente sequenciados utilizando o Kit BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) num termociclador GeneAmp® PCRSystem 2700 (Applied Biosystems). Os fragmentos foram purificados por precipitação com isopropanol. O gel de sequenciamento foi executado em um laser automatizado sequenciador de DNA ABI fluorescente Prism® 3130 × l Analisador Genético (Applied Biosystems) e homologias foram verificados, usando Finch TV, depois da explosão com o BDNF, TrkB145, TrkB95, p75

NTR, e sortilina sequências do GenBank (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507, NM_002959 e, respectivamente).

Western blot

de ratinho anti-BDNF (1 ng /ml) e de ratinho anti-TrkB (1 ug /ml) anticorpos (Abs) foram adquiridos a partir de R D Systems, de coelho anti-P75

NTR (1 ug /ml), anticorpos de cabra anti-sortilina (1 ug /ml) e anticorpo de coelho anti-fosfo-AKT (Ser 473 ; 1 ug /ml) Abs a partir de Santa Cruz Biotechnology, de coelho anti-TrkA (1:1000), de coelho anti-TrkC (1:1000) e de ratinho (1:2000) Abs anti-Akt a partir de Cell Signaling Technology. linhas de células subconfluentes foram lisadas culturas (5 minutos em gelo), em frascos de cultura em 1 × tampão de lise celular (Cell Signaling Technology) contendo PMSF 1 mM (Sigma-Aldrich). A suspensão foi sonicada durante 1 min (uma pulsação de 40 Hz a cada 20 s) para degradar o ADN cromossómico e centrifugado a 14.000 g durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram recolhidos e a concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de Bradford concentração de proteína (Sigma). SDS-PAGE foi realizada e as proteínas foram electro-transferidas para membranas de PVDF (BioTrace ™). Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, em solução (leite seco a 5% não gordo em PBS) de bloqueio, as membranas foram expostas ao Abs primária específica em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes durante 5 minutos com TBS /0,1% Tween-20 e as reacções imunológicas foram detectados por rábano Ac secundário conjugado com peroxidase de rato, coelho, cabra ou Ig (DakoCytomation) diluído a 1:2000 em solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, a visualização dos imunocomplexos foi realizada utilizando o Immobilon Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (Millipore). controle de proteína de carregamento foi realizada com anti-actina Ab (Cell Signaling Technology). Western blot foram digitalizados usando um sistema de bio-imaging (Genesnap; GeneTool; Syngene). análises densitométricos foram realizadas utilizando um programa de software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA https://rsb.info.nih.gov/ij/). A expressão proteica foi determinada em unidades relativas em referência à expressão de actina.

Imunofluorescência

Células cultivadas em lamelas de 12 mm foram fixadas com PFA a 4%, à temperatura ambiente durante 30 min, e permeabilizadas ou não com 0,1% de Triton X-100. A ligação não específica foi bloqueada por incubação de 30 minutos com PBS-BSA a 2% à temperatura ambiente. As lamelas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C em solução com o Ab primária bloqueio. Foram utilizados os seguintes Abs: de coelho anti-FNEC Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-Pro-BDNF AB (8 ug /ml; Alomone Labs), de ratinho anti-TrkB Ab (2,5 ug /ml; R D Systems), de coelho anti-p75

NTR (2 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology) e de cabra anti-sortilina Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology). As células foram lavadas 3 vezes em PBS, e incubou-se durante 2 h à temperatura ambiente com Abs secundário conjugado com Alexa Fluor-(Invitrogen) diluiu-se em PBS 1:5000. Após 3 lavagens em PBS, os núcleos foram coradas durante 5 min com DAPI. Após lavagens intensivos, lamelas foram invertidos em lâminas e montado com Dako fluorescente montagem Médio (DakoCytomation). Os controlos negativos eram células incubadas com coelho irrelevante normal, mouse ou IgG de cabra (Sigma). As fotos foram tiradas com um microscópio confocal (Carl Zeiss, LSM 510); parcelas de superfície de dados de fluorescência foram gerados com o programa de software ImageJ.

ELISA

Depois de 24 h, 48 he 72 h de cultura, as amostras de sobrenadante de linhas celulares foram recolhidos e armazenado a -80 ° C até ao dia do ensaio. Imunoensaios Sistemas (Promega), específicas para o BDNF foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos como média ± EPM (pg /mL). Pelo menos três experimentos independentes foram realizadas para cada condição experimental, cada um com medições em triplicado.

ensaios de proliferação celular

A proliferação celular foi medida utilizando o Click-lo EdU Alexa Fluor 488 citometria de fluxo de ensaio ( Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células (2 x 10

5 por poço) foram incubadas durante a noite em placas de doze poços antes do tratamento, em seguida, cultivadas durante 24 h em meio isento de soro com ou sem exógeno BDNF, K252a ou tanto o BDNF e o K252a adicionados em simultâneo . valores de proliferação foram medidos utilizando uma citometria de fluxo BD LSRFortessa (BD Biosciences). As experiências foram realizadas em triplicado, e três conjuntos de 50.000 células foram recolhidas para cada condição. Os dados foram adquiridos e analisados ​​pelo software 6.0 FACSDiva BD (BD Biosciences). Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes.

Ensaio de Apoptose

A apoptose foi medida por meio da detecção de nucleossomas solúveis citoplasmáticos utilizando um ensaio calorimétrico, Cell Death Detection ELISAPLUS Kit (Roche Molecular Diagnostic) de acordo com a as instruções do fabricante. Os valores de absorvância foram medidos em dois comprimentos de onda 405-490 nm. A absorvância obtidos nos controlos foi normalizado para um valor de 1, tal como anteriormente [7] descrito. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

A análise estatística

significância estatística foi determinada por uma análise de uma via de variância (ANOVA) com software Statview 5.0 (Abacus Concepts ).

valores P Restaurant 0,05 foram considerados significativos. Os valores médio e SEM foram obtidos de pelo menos 3 experiências independentes.

Resultados

linhas celulares de cancro colorrectal expressar TrkB e p75

NTR mas não receptores TrkA ou trkC

TrkB e p75

expressões NTR foram detectados em linhas celulares de CRC sob basal (10% de FCS) as condições de cultura, tanto no ARNm (Figura 1A) e os níveis de proteína (Figura 1D), com algumas diferenças consoante linhas celulares. Considerando que o TrkB de comprimento completo (TrkB145) e p75

transcritos NTR foram predominantes em um primário (SW480) e uma metástase (SW620) linha (Figura 1A) (duas linhas de células isoladas a partir do mesmo paciente), os transcritos mais fortemente expresso foram os da isoforma truncada (TrkB95) em todas as linhas celulares (Figura 1A), excepto para as células WiDr que expressa TrkB95 e p75

NTR só depois de uma privação de soro de 48 horas (Figura 1B). TrkB e p75

sequenciamento NTR depois de géis de agarose de eluição validados estes resultados. No entanto, TrkA e trkC transcritos (Figura 1C), assim como os receptores de proteínas (Figura 1D) não foram detectados, quaisquer que sejam as condições de cultura, em contraste com a linha celular de leucemia K562 erythromyeloblastoid conhecida para expressar estes receptores de neurotrofinas [36].

(a): RT-PCR de BDNF, a sua elevada (TrkB) e baixo (p75

NTR) receptores de afinidade, TrkA, e TrkC a partir de células cultivadas em basal (10% de meio FCS), WiDr (pista: 1 ), SW480 (pista: 2), SW620 (pista: 3), COLO 205 (pista: 4). Os níveis de ARNm de GAPDH foi usada como um controlo interno. controle positivo (pista 5) foi a linha de células de neuroblastoma (IMR32) para BDNF, TrkB e p75

NTR; e as células de leucemia erythromyeloblastoid (K562) para TrkA e C. Um resultado representativo de, pelo menos, três a cinco experiências independentes. (B) Comparação de TrkB95 e p75

NTR no ARN total extraído de células WiDr cultivadas em 10% de FCS ou após 24 a 72 horas de privação de soro (0% de FCS). TrkB95 e p75

NTR mRNA /GAPDH mRNA quantificação de intensidades de bandas por densitometria avaliadas são mostrados acima pistas e expressa em unidades arbitrárias (média de três experiências independentes). (C) O mesmo experimento: RT-PCR de TrkA e TrkC no ARN total extraído de células WiDr cultivadas em condições de cultura de base (10% FCS) e após 24-72 horas de inanição de soro, em comparação com o controlo positivo (K562) (D) a expressão de BDNF e pró-BDNF, TrkB de comprimento completo 145 e TrkB truncado 95 e p75

NTR proteínas em linhas celulares de CRC cultivadas em 10% de FCS. TrkA e TrkC não foram detectados. Actina foi utilizado como controlo de carga de proteína. WiDr (pista: 1), SW480 (pista: 2), SW620 (pista: 3), COLO 205 (pista: 4). controle positivo (pista: 5) foram IMR32 células para BDNF, pro-BDNF, TrkB e p75

NTR e células K562 ou TrkA e TrkC. Um resultado representativo de pelo menos três experiências independentes.

células CRC produzir endógena BDNF

Desde CRC expressa receptores TrkB, buscamos uma produção endógena de BDNF, um ligando TrkB. ARNm de BDNF foi detectado em todas as linhas celulares estudadas sob basal (10% de FCS) as condições, predominantemente nas duas linhas (CRC primários de WiDr e SW480). Curiosamente, após privação de soro durante 24 a 72 h, os níveis de ARNm do BDNF (Figura 2A), bem como a proteína BDNF madura (17 kDa) detectados por Western Blot nos lisados ​​celulares, foram aumentadas nas quatro células de CRC (Figura 2B), como mostrado pelos valores de densitometria (rácios de BDNF /GAPDH mRNA para os rácios e BDNF /actina para proteínas) (Figura 2A, B). Além disso, a secreção de BDNF foi detectado por ELISA em sobrenadante de cultura de linhas celulares de CRC. libertação BDNF foi significativamente aumentado pela privação de soro nas duas linhas celulares SW480 e WiDr CRC primárias (Figura 2C e Tabela 2), enquanto que, não foi significativamente melhorada em SW620 metastático e COLO 205 linhas celulares de CRC (Tabela 3). privação de soro provocou um aumento dos níveis de BDNF no citoplasma destas quatro linhas de células, como mostrado para SW480 na Figura 2D. A quantificação da intensidade de fluorescência verde em condições de cultura a cada confirmaram as conclusões a partir das imagens de fluorescência (Figura 2D) e reforçaram os resultados obtidos por transferência de Western

.

de produção (A) BDNF avaliada por RT-PCR do ARN total extraído de As células cultivadas em condições basais (FCS a 10%) e de 24 a 72 horas de privação de soro. A quantificação de intensidades de banda é mostrado como acima (média de três experiências independentes). expressão (B) O BDNF por transferência de Western (em referência à actina) na proteína celular total extraído de linhas de células cultivadas em condições basais (FCS a 10%) e após 24-72 horas de privação de soro (0% de FCS). De acordo com análises de densitométricas, quantificação mostrou um aumento significativo de expressão do BDNF em células em cultura. Os histogramas são médias ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes. **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,001, em comparação com condições de cultura basais. (C) A secreção de BDNF avaliada por ELISA no sobrenadante das linhas de células WiDr e SW480 sob condição basal (FCS a 10%) e após 24-72 horas de privação de soro (0% de FCS). Os resultados são expressos como a média ± SEM de triplicados de três experiências diferentes. ***,

p Art 0,001, quando comparado com a condição de cultura basal. (D) Comparação da expressão do BDNF por SW480 células cultivadas em FCS a 10% e após 72 h a privação de soro. A microscopia confocal com anti-BDNF Ab e Alexa fluor-488 conjugado (verde) e núcleos contra-coradas com o DAPI mancha DNA azul-fluorescente. A quantificação relativa foi avaliada por plotagem de superfície fluorescência verde. Imagens eram representativas para pelo menos três experiências independentes. As barras de escala, 10 | im. Resultados semelhantes foram observados com os outros três linhas (dados não mostrados).

privação de soro induz a expressão membranoso de TrkB e sua co-localização com BDNF

A descoberta endógena que o BDNF é segregada sob condições de privação de soro levou-nos a procurar a expressão do seu receptor de elevada afinidade. Em basal (FCS) contendo culturas (Figura 3A, C), o TrkB receptor de elevada afinidade e o seu ligando BDNF foram sequestradas em todas as linhas celulares de CRC. A privação de soro 24 h induzido um desvio de TrkB para a membrana celular (Figura 3B, D). Curiosamente, uma co-localização de TrkB e BDNF na membrana foi detectado em todas as linhas celulares estudadas e atingiu um máximo às 72 horas de privação, como mostrado, por WiDr e células COLO 205 (Figura 3B, D). os padrões de coloração semelhantes foram obtidos para SW480 e SW620 (dados não mostrados). A co-expressão na membrana de ambos TrkB e BDNF endógeno sugere que o BDNF e TrkB poderia estar implicada em um loop autócrino em células estressadas CRC.

A microscopia confocal de WiDr (A, B) e COLO 205 (C, D ) células, coradas com um Ab anti-BDNF (vermelho), anti-mAb TrkB (verde) ou ambos (overlay) cultivadas com 10% de FCS (A, C) ou após 24 horas de privação de soro (B, D). Sob condições de cultura de base (10% FCS), TrkB e BDNF foram sequestrado no citoplasma (setas) em WiDr (A) e células COLO 205 (C). Os mesmos padrões de coloração foram obtidos com as outras duas linhas de células (dados não apresentados). Depois de deslocalização privação de soro para a membrana celular e uma co-localização de TrkB e BDNF (amarelo em fundido, setas) foram detectados em WiDr (B) e COLO 205 (D). Imagens eram representativas para, pelo menos, três a cinco experimentos independentes.

BDNF promove a proliferação e sobrevivência de linhas celulares de CRC através TrkB

Para determinar a função deste sistema ligando-receptor na a proliferação e sobrevivência de WiDr, SW480, SW620 e células COLO 205 de CRC, proliferação e apoptose ensaios foram realizados com FNEC exógeno, quer em FCS-livre ou em 10% de FCS contendo culturas. Após uma cultura de 24 horas em meio isento de soro, BDNF exógena aumentou significativamente a proliferação de todas as linhas celulares estudadas, em contraste com a ausência de efeito na presença de FCS a 10% (Figura 4A e na Tabela 2, 3). Desde TrkB foi expressa na superfície de células estressadas, temos a hipótese de o seu possível papel na proliferação de células sob tais condições. De facto, a adição de K252a, um inibidor de Trk [37], suprimiu o efeito proliferativo do BDNF exógeno em culturas isentas de soro em todas as linhas celulares estudadas (Figura 4A), o que sugere que endógeno de BDNF foi implicado no crescimento celular por meio de TrkB (Fig. 4A e na Tabela 2, 3). Para avaliar melhor o papel de TrkB e do BDNF na sobrevivência de células de CRC salientou, a apoptose foi avaliada por níveis citoplasmáticos de nucleossomas solúveis em culturas com e sem o BDNF ou exógeno K252a. Após um jejum de soro de 24 horas, WiDr, SW480, SW620, e COLO 205 células estimuladas com FNEC exógeno tinha diminuído significativamente rácios apoptóticas, ao passo que não se observou qualquer efeito significativo sobre as células mantidas em meio normal (Figura 4B, C e Tabela 2, 3 ). Além disso, 200 nM K252a aumentou as proporções apoptóticos de WiDr, SW480, SW620, e COLO 205 (Figura 4B, C e Tabela 2, 3). Os resultados obtidos após 48 e 72 inanição-H soro confirmou estes dados (fig. 4B, C), sugerindo que a proliferação de células de CRC pode ser mediada por um /via de sinalização de TrkB BDNF.

(A) Papel endógeno de BDNF e o seu receptor TrkB na proliferação de células de CRC: efeitos do FNEC exógeno e suprimindo receptor de TrkB endógeno sobre a proliferação celular. As quatro linhas de células foram cultivadas durante 24 horas em meio livre de FCS (FCS a 10%, -) na presença de BDNF exógeno (+), K252a (+) sozinho ou em combinação. A proliferação celular foi determinada por análise de citometria de fluxo utilizando EdU Alexa Fluor 488. Os dados são apresentados como histogramas de células em proliferação em unidades relativas ± SEM de cinco experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

P

0,001, quando comparado com meio isento de soro. (B, C) Efeitos da BDNF exógena e suprimindo receptor TrkB endógena na célula de sobrevivência. índices apoptóticos de nucleossomas solúveis foram detectados por ELISA celular para WiDr, SW480, SW620, e COLO 205 induzida por privação de soro por si só (FCS a 10%, -) ou em associação quer com FNEC exógeno (+), ou com K252a (+), durante 24-72 horas de privação de soro. Histogramas, significa proporção de células apoptóticas ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,001, quando comparado com a condição de isento de soro sozinho. (D, E) Taxa de apoptose após 24 horas de privação de soro por si só (0% FCS) ou com combinação com um neutralizante anti-BDNF mAb (0% de anti-BDNF). Histogramas, significa proporção de células apoptóticas ± SEM de três experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p

. 0,001, quando comparado com a condição de isento de soro sozinho

Para definir a via de transdução de sinal induzida por BDNF activação /TrkB, buscamos Akt fosforilação em duas linhas celulares de CRC seguintes O tratamento com BDNF. Com efeito, transferência de Western revelaram que a exposição de WiDr ou SW480 para o BDNF após a privação de soro de 16 horas, induziu a fosforilação de Akt (Ser 473) depois de 5 minutos, atingiu o máximo aos 30 minutos (de 7 a 8 vezes aumento) e ainda detectado depois 24 horas (3 a aumento de 4 vezes) (Figura 5).

a capacidade do BDNF para activar PI3-cinase /Akt sinalização em células de CRC foi avaliada utilizando anticorpos específicos para Akt e fosfo-Akt (pAkt ). células WiDr e SW480 foram privadas de soro durante 16 horas. As células foram então expostas ao BDNF (100 ng /ml) e colhidas em tempos diferentes, durante 5 minutos (min) e 24 horas (h). Trinta ug de lisados ​​de proteína foi analisada por pAkt (Ser473) e Akt total, em análise de Western blot. A densidade de cada banda de pAkt foi corrigido para a variação na carga, utilizando a densidade do Akt total correspondente. A indução de dobragem foi avaliada como a razão entre as densidades de proteína Akt fosforilada entre o controlo (0 min) e as células tratadas. Um resultado representativo de pelo menos três experiências independentes.

Por isso, a determinação dos níveis de apoptose das quatro linhas de células na presença de um neutralizante anti-BDNF mAb [38]. Este mAb na verdade aumentou a apoptose de linhas CRC primárias: WiDr (Figura 4D, esquerda e Tabela 2), SW480 (Figura 4D, à direita e na Tabela 2) e linhas metastáticos, SW620 (Figura 4E, para a esquerda e na Tabela 3) e COLO 205 ( a Figura 4E, para a direita e na Tabela 3).

no seu conjunto, estes dados sugerem que o BDNF endógeno está implicada na sobrevivência de células de CRC em culturas isentas de soro através de TrkB através de um loop autócrino. Isto levou a estudar o papel de sortilina no tráfego BDNF.

sortilin, uma proteína tráfico BDNF, é expressa por linhas celulares de CRC

Os iniciadores utilizados no estudo de transcrições reconhecidas sortilin a parte intracelular da proteína (sortilin IC envolvidos no tráfico de neurotrofina) e a parte extracelular (CE sortilin envolvidos em suas propriedades do receptor). sortilin transcrição (Figura 6A) e de proteína (Figura 6B) foram detectadas em todas as linhas celulares estudadas. Em comparação com células cultivadas em 10% de FCS, de 24 a 72 horas de privação de soro expressão aumentada sortilina como detectado em imunomarcações de WiDr, SW480, SW620 e extractos COLO 205 (Figura 6B). Sortilin é conhecida por existir sob dois estados diferentes de glicosilação em células CRC. De facto, detectou-se como um dupleto na linha celular SW480 (Figura 6B), mas apenas em outros (WiDr, Colo205), com uma expressão variável entre linhas celulares e culturas (Figura 6B). Sortilin foi detectado em todas as linhas celulares de CRC também por microscopia confocal, como mostrado para SW620 (Figura 6C). Double-coloração para sortilin e BDNF mostrou uma co-localização impressionante com aumento da intensidade da fluorescência após inanição 24 h soro (Figura 6C). Quantificar o verde (BDNF) e vermelho intensidades (sortilin) ​​de fluorescência em cada condições de cultura confirmaram os resultados das imagens de fluorescência (Figura 6C). os padrões de coloração semelhantes foram observados com WiDr, SW620, e linhagens de células COLO 205, nas mesmas condições (dados não apresentados). Em conjunto, os nossos resultados estão em acordo com a hipótese de que sortilina poderia exercer a função de transportador para o BDNF.

(A) sortilin detecção por RT-PCR de ARN total extraído de células cultivadas em FCS a 10% e após 24 -72 h privação de soro. Expressão foi controlada com primers específicos para a sua extracelular (sortilin CE) e peças intracelular (sortilin IC). Um resultado representativo de pelo menos três experiências independentes. (B) Avaliação por transferência de western da expressão sortilina (em referência à actina) na proteína celular total extraído de linhas celulares estudadas cultivadas sob condições basais e depois de 24-72 horas de privação de soro. As barras de escala, 10 | im.