Abstract
Purpose
O presente estudo investigou o significado clínico da transmembrana protease, serina 4 (TMPRSS4) e quinases reguladas por sinais extracelulares 1 (ERK1) no desenvolvimento, progressão e metástase de câncer gástrico.
Métodos
a imuno-histoquímica foi utilizada para analisar a expressão TMPRSS4 e Erk1 em 436 gástrica casos de câncer e 92 tecidos gástricos humanos não-cancerosas.
resultados
Os níveis de proteína de TMPRSS4 e Erk1 foram regulados positivamente nas lesões de câncer gástrico em comparação com os tecidos não cancerosos adjacentes. Alta expressão de TMPRSS4 correlacionada com a idade, o tamanho, a classificação de Lauren, profundidade de invasão, linfonodo e metástases à distância, estágio linfonodos regionais e estádio TNM, e também com expressão de ERK1. Em fases I, II e III, a taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com alta expressão TMPRSS4 foi significativamente menor do que em pacientes com baixa expressão. Além disso análise multivariada sugere que a regulação positiva de TMPRSS4 e Erk1 foram indicadores prognósticos independentes para a doença, juntamente com profundidade de invasão, linfonodo e metástases à distância e estágio TNM.
Conclusões
A expressão de TMPRSS4 no câncer gástrico é significativamente associada com linfonodo e metástases à distância, a alta expressão Erk1 e mau prognóstico. proteínas TMPRSS4 e ERK1 poderia ser marcadores úteis para prever a progressão do tumor e prognóstico do cancro gástrico
Citation:. Luo ZY, Wang YY, Zhao ZS, Li B, Chen JF (2013) a expressão dos TMPRSS4 e ERK1 Correlatos com metástases e mau prognóstico em pacientes chineses com câncer gástrico. PLoS ONE 8 (7): e70311. doi: 10.1371 /journal.pone.0070311
editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de fevereiro de 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Luo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi o apoio por uma concessão do Zhejiang Provincial Departamento de Ciência e Tecnologia da Fundação de Investigação (2008C33040) e Fundos especiais Nacionais para a Fundação de Saúde (200.802.112). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
transmembranar do tipo II de proteases de serina (TTSPs) foram reconhecidas como uma nova subfamília de proteases de serina com um domínio proteolítico, um domínio transmembranar, um domínio citoplasmático curto e uma região de haste de comprimento variável que contém domínios estruturais modulares [ ,,,0],1] – [2]. A maioria dos TTSPs foram implicados no desenvolvimento e progressão do tumor, principalmente com base na sua expressão desregulada. Transmembranar de protease, serina 4 (TMPRSS4) é um TTSP que é altamente expresso no pâncreas, da tiróide, pulmão e colo-rectal [3] – [4]. TMPRSS4 invasão induzido e epitelial-mesenquimal de transição (EMT), ativando FAK de sinalização e Erk [5]. Extracelular quinase regulada por sinal 1 (Erk1) é um membro da família MAP quinase e actua de uma cascata de sinalização que regula diversos processos celulares tais como a proliferação, a diferenciação e a progressão do ciclo celular em resposta a uma variedade de sinais extracelulares [6]. As funções biológicas e significado clínico TMPRSS4 e Erk1 no cancro gástrico não são compreendidos. O presente estudo analisou a expressão de TMPRSS4 e Erk1 em 436 espécimes cirúrgicos de câncer gástrico por imuno-histoquímica, para explorar a possível correlação de expressão TMPRSS4 e Erk1 com variáveis clínico-patológicas, e para determinar o valor prognóstico da expressão TMPRSS4 e Erk1.
Materiais e Métodos
arquivados gástricas amostras de tecido e não-tumorais Mucosa
tecidos câncer gástrico foram coletados a partir de amostras gastrectomia de 436 pacientes (311 do sexo masculino, 125 do sexo feminino, idade mediana de 60,0 anos, faixa 30-91) do Departamento de Cirurgia do Hospital de Zhejiang Provincial Popular, de janeiro de 1998 a janeiro de 2004. os tecidos tinham sido fixadas em formalina, parafina-embedded, e diagnosticados clinicamente e histopatologicamente no Serviço de Cirurgia Departamentos de Gastrointestinal e Patologia. Todos os pacientes tiveram registros de acompanhamento para 5 anos. O prazo de acompanhamento foi de Dezembro de 2008. O tempo de sobrevida foi calculado a partir da data da cirurgia para o prazo de acompanhamento ou data da morte, que foi causada principalmente pela recorrência do carcinoma ou metástase. Noventa e dois tecidos gástricos humanos não-cancerosas foram obtidos a partir gastrectomia de adjacentes margens 5 cm. quimioterapia de rotina foi dado aos pacientes com doença em estágio avançado após a operação, mas nenhum tratamento de radiação foi administrada a qualquer um dos pacientes incluídos no estudo.
Tissue Microarray Analysis
Blocos que continha uma total de 436 amostras de tecido tumoral e 92 amostras de mucosa gástrica normal, foram preparados como descrito previamente [7] – [8]. biópsias de tecidos núcleo (2 mm de diâmetro) foram tomadas a partir de tumores gástricos embebidos em parafina (blocos dadores individuais) e dispostos em blocos de parafina receptores (blocos de matriz de tecido), utilizando uma trefina. Uma vez que foi comprovado que os resultados da coloração obtidos a partir de diferentes áreas intratumorais em vários tumores correlacionam bem [9], um núcleo foi amostrado em cada caso. Um processo adequado foi definida como um tumor ocupando 10% da área de núcleo [10]. Cada bloco continha mais de três controles internos que consistiam em mucosa gástrica não-neoplásica. seções de quatro micrômetros de espessura foram cortadas de cada bloco de arranjo de tecido, desparafinados e desidratados
.
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Zhejiang Provincial Popular e consentimento por escrito foram obtidas de todos os participantes.
imunohistoquímica
a análise imunohistoquímica [11] – [12] foi realizada para estudar a expressão proteína alterada em 92 amostras de tecido não-cancerosas humanas gástricas e 436 tecidos de câncer gástrico humano. Resumidamente, as lâminas foram cozidos a 60 ° C durante 2 h seguida por desparafinização com xileno, e re-hidratada. As secções foram submersas em EDTA tampão de recuperação antigénico e micro-ondas para a recuperação de antigénio, após o que foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol para extinguir a actividade da peroxidase endógena, seguindo-se incubação com 1% de albumina de soro de bovino para bloquear a ligação não específica. As secções foram incubadas com anticorpo de coelho anti-TMPRSS4 (Proteintech Group, Inc) e de coelho anti-Erk1 (Cell Signaling Technology), durante a noite a 4 ° C. soro normal de cabra foi utilizado como um controlo negativo. Após a lavagem, as secções de tecido foram tratadas com anticorpo secundário. As secções de tecido foram então contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado.
Avaliação de Resultados
TMPRSS4 e Erk1 foram coradas como Buffy colorido no citoplasma e núcleo. O grau de imunocoloração foi avaliada e teve independentemente por dois observadores com base na intensidade de coloração com [11], [13], [14]. Intensidade de coloração foi classificada de acordo com os seguintes critérios: 0 (nenhuma coloração), 1 (coloração fraca = amarelo claro), 2 (coloração moderada = amarelo marrom) e 3 (coloração forte = marrom). coloração moderada e forte foram utilizados para definir os tumores com alta TMPRSS4 ou expressão Erk1, e não e coloração fraca foram usadas para indicar uma baixa TMPRSS4 ou expressão Erk1.
Análise Estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 12.0. Os dados de medição foram analisados utilizando
t
teste de Student, enquanto os dados categóricos foram estudadas utilizando o
χ
2 ou teste exato de Fisher. As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier, eo teste de log-rank foi utilizado para calcular as diferenças entre as curvas. A análise multivariada pelo modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foi realizada para avaliar os valores de prognóstico de expressão da proteína. Os coeficientes de correlação entre a expressão da proteína e os achados clínico-patológicos foram estimadas utilizando o método de correlação de Pearson. A significância estatística foi fixado em
P
. 0,05
resuts
A expressão de TMPRSS4 em amostras de tecido gástrico e arquivados não-tumor Mucosa
proteína TMPRSS4 foi detectada em 14 dos 92 (15,22%) amostras de mucosa não-tumorais humanos, e todas as amostras a proteína expressa a um nível baixo. proteína TMPRSS4 foi detectada em 245 dos 436 (56,19%) casos de cancro gástrico humano, alta expressão da proteína TMPRSS4 foi detectada em 203 (46,56%) tumores. TMPRSS4 foi localizada principalmente no citoplasma ou núcleo de câncer primário (Figura 1A, B e C).
A TMPRSS4 negativo em tecidos não cancerosos, ampliação × 400. B TMPRSS4 foi altamente expressa em adenocarcinoma moderadamente diferenciado, ampliação × 400. C TMPRSS4 foi altamente expressa em adenocarcinoma pouco diferenciado, ampliação × 400, respectivamente. D Erk1 negativo em tecidos não cancerosos, ampliação × 400. E Erk1 foi altamente expressa em adenocarcinoma moderadamente diferenciado, ampliação × 400. F Erk1 foi altamente expressa em adenocarcinoma pouco diferenciado, ampliação × 400.
Expressão de ERK1 em amostras de tecido gástrico e arquivados não-tumor Mucosa
proteína
Erk1 foi detectada em 16 dos 92 (17,39%) amostras de mucosa não-humanos de tumor, e todas as amostras a proteína expressa a um nível baixo. proteína ERK1 foi detectado em 231 de 436 (52,98%) casos de câncer gástrico humano, alta expressão da proteína ERK1 foi detectada em 173 (39,68%) tumores. ERK1 foi localizada principalmente no citoplasma ou núcleo de câncer primário (Figura 1D, E e F).
Correlação entre TMPRSS4 Up-regulação e características clínicas de Câncer Gástrico
High expressão de TMPRSS4 correlacionados com a idade, o tamanho, a classificação de Lauren, profundidade de invasão, linfonodo e metástases à distância, estágio linfonodos regionais e estádio TNM (
P Art 0,05) (Tabela 1). expressão TMPRSS4 não se correlacionou com o sexo, localização do tumor, diferenciação, ou classificação histológica (
P Art 0,05). (Tabela 1)
Correlação entre Erk1 Up-regulação e Clínica características de Câncer gástrico
High expressão de ERK1 correlacionada com a idade, localização do tumor, o tamanho, profundidade de invasão, a diferenciação, a classificação de Lauren, linfonodo e metástases à distância, estágio linfonodos regionais e estádio TNM (
P
0,05) (Tabela 2). expressão ERK1 não se correlacionou com o sexo, ou classificação histológica (
P Art 0,05). (Tabela 2)
Correlação entre TMPRSS4 Expressão e Prognóstico
fase I, II e III tumores, a taxa de sobrevida de 5 anos em pacientes com alta expressão de TMPRSS4 foi significativamente menor do que em pacientes com baixa expressão (
P Art 0,05) (Figura 2). No estágio IV tumores, a expressão de TMPRSS4 não se correlacionou com a taxa de sobrevida em 5 anos (
P Art 0,05) (Figura 2)
0:. Negativa, 1: positivo.
Correlação entre Erk1 expressão e Prognóstico
na fase I, II e III tumores, a taxa de sobrevida de 5 anos em pacientes com elevada expressão de ERK1 foi significativamente menor do que em pacientes com baixa expressão (
P Art 0,05) (Figura 3). No estágio IV tumores, a expressão de ERK1 não se correlacionou com a taxa de sobrevida em 5 anos (
P Art 0,05) (Figura 3)
0:. Negativa, 1: positivo.
análise multivariada de clínicopatológicos Parâmetros e Prognóstico
Os fatores com possíveis efeitos prognósticos em carcinoma gástrico foram analisados por análise de regressão de Cox. O estudo revelou que linfonodo e metástases à distância (
P
= 0,005), estadiamento TNM (
P
= 0,005), expressão de TMPRSS4 (
P
= 0,000) e ERK1 (
P
= 0,000) foram fatores prognósticos independentes de doentes com carcinoma gástrico. No entanto, a idade, sexo, localização do tumor e tamanho, classificação histológica, a diferenciação do tumor, profundidade de invasão, a classificação de Lauren, e linfáticos regionais estágio nó não tinha valor prognóstico.
Associação entre Expressão da TMPRSS4 e Erk1
duzentos e quatro casos de câncer gástrico tinha baixa expressão de ambos TMPRSS4 e Erk1, e cento e quarenta e quatro casos de cancro gástrico teve alta expressão de ambos TMPRSS4 e Erk1. Houve correlação significativa entre TMPRSS4 e Erk1 (χ
2 = 155,1; P = 0,0001) (Tabela 3). Nós também detectou os resultados de pacientes gástricas TMPRSS4 positivo /Erk1-negativos, TMPRSS4 positivo /Erk1-positivo, TMPRSS4-negativo /Erk1-positivas e TMPRSS4-negativo /ERK1-negativos, e descobrimos que houve uma diferença significativa na comparações globais (χ
2 = 256,9; P = 0,000, Figura 4). O tempo médio de sobrevivência foi de 42,8 ± 2,23, meses para TMPRSS4 (+) /Erk1 (-) grupo, 27,9 ± 1,27 meses para TMPRSS4 (+) /Erk1 (+), 54,7 ± 0,72 meses para TMPRSS4 (-) /Erk1 (- ), 39,2 ± 3,19 meses para TMPRSS4 (-) /Erk1 (+), respectivamente
Discussão
das muitas moléculas envolvidas na carcinogênese e desenvolvimento do ser humano. tumores, as proteases têm sido extensivamente estudada como participantes importantes na carcinogénese de muitos tumores. Recentemente, muita atenção tem sido focada sobre o papel das proteases de tipo II da transmembrana serina (TTSPs) durante o desenvolvimento do tumor [15] – [16]. TTSPs são membros da família das proteases associada à superfície celular que medeiam uma variedade de funções celulares normais, bem como a invasão do tumor e metástases.
TMPRSS4 é um TTSP que tem sido conhecido por ser sobre-regulada em diversos cancros, especialmente em cancros pancreáticos e da tiróide [4], [17], e a expressão de TMPRSS4 tem sido correlacionada com o potencial metastático de cancro pancreático [3]. TMPRSS4 é necessária e suficiente para a linha celular de cancro de pulmão humano NCI-H322, a linha de células de adenocarcinoma do cólon Colo205, HCT15 e a linha celular de cancro colorrectal para realizar a migração e invasão [18]. O estudo revelou que a expressão de TMPRSS4 em lesões cancerosas gástricas estavam intimamente associados com a idade, tamanho do tumor, localização do tumor, profundidade de invasão, invasão de vasos, linfonodo e metástases à distância e estágio TNM. A expressão de TMPRSS4 correlacionou-se significativamente com o prognóstico do câncer gástrico. Em fases I, II e III, as taxas de sobrevivência de 5 anos de pacientes com alta expressão de TMPRSS4 foi significativamente menor do que os pacientes com baixa expressão. No estágio IV, expressão TMPRSS4 não se correlacionou com a taxa de sobrevida em 5 anos. Além disso análise multivariada sugeriu que a profundidade da invasão, linfonodo e metástases à distância, estágio TNM, e up-regulação da TMPRSS4 foram indicadores prognósticos independentes para câncer gástrico. A sobre-expressão de TMPRSS4 tem um papel crítico na difusão de longo prazo induzida por radiação e a metástase de carcinoma hepatocelular residual, facilitando a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [19]. Expressão de TMPRSS4 em tumores com carcinoma de células escamosas (SCC) histologia foi encontrado para ser significativamente maior do que aqueles com adenocarcinoma (AC) histologia. As curvas de Kaplan-Meier demonstrou que altos níveis de TMPRSS4 foram significativamente associados com a sobrevida global reduzida nos pacientes com histologia SCC, ao passo que nenhuma correlação foi encontrada para a histologia AC [20].
Erk1 envolvidos na carcinogênese através da regulação vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação e a progressão do ciclo celular em resposta a uma variedade de sinais extracelulares. factor de crescimento derivado de hepatoma está envolvido no processo de carcinogénese gástrica e promove a proliferação e metástases através de Erk1 2 activação /[21]. ERK1 como um mediador importante da sinalização de ácido lisofosfatídico levando a sobre-regulação de uma esf ingosina-quinase (SphK1) e ponto de SphK1 e produção de esfingosina-1-fosfato como potenciais alvos terapêuticos no cancro gástrico [22]. A interacção entre FVIIa e TF induz activação do receptor 2 activado pela protease, assim, desencadeia a via de ERK1 /2 e IkB-α /NF-kB de transdução de sinal para regular a expressão do gene de IL-8, TF, e caspase-7, e, finalmente promove a proliferação de células SW620 e migração [23]. A expressão de ERK1 em câncer gástrico e seu significado clínico não são compreendidos. O estudo foi examinar a expressão de ERK1 em 436 espécimes cirúrgicos de câncer gástrico por imuno-histoquímica. O estudo demonstrou que a elevada expressão de proteína foi detectada em Erk1 173 (39,68%) tumores. alta expressão de ERK1 correlacionada com a idade, localização do tumor, o tamanho, profundidade de invasão, a diferenciação, a classificação de Lauren, linfonodo e metástases à distância, estágio linfonodo regional, estágio TNM e mau prognóstico.
Nós expressão TMPRSS4 reanalisadas em amostras de câncer de estômago e sua correlação com a expressão Erk1. Encontramos uma correlação positiva entre TMPRSS4 e expressão Erk1, sugerindo que TMPRSS4 podem estar envolvidos na carcinogênese, a progressão e metástase de câncer gástrico através da promoção da proliferação celular pela ativação Erk1.