Abstract

Fundo

O câncer de ovário continua a ser uma das principais causas de morte em mulheres e desenvolvimento de novas terapias é essencial. Segundo mitocôndrias derivado activador de caspase (SMAC) tem sido descrito para sensibilizar para a apoptose. Nós exploramos a atividade pró-apoptótica de LBW242, um mímico de SMAC /DIABLO, em linhas celulares de cancro do ovário (células A2780 e A2780 sua resistente à quimioterapia derivado /ADR, SKOV3 e hey células) e em células de cancro do ovário primários. Os efeitos de LBW242 sobre linhas de células de cancro do ovário e células de cancro do ovário primários foi determinada por proliferação celular, apoptose e ensaios bioquímicos.

principais conclusões

LBW242 adicionado por si só induziu apenas um efeito pró-apoptótico moderada ; no entanto, fortemente sinergiza com necrose tumoral a apoptose relacionado com o factor indutor de ligando (TRAIL) ou fármacos anti-cancerígenos em induzir a apoptose de ambas as linhas celulares do cancro do ovário e células de cancro do ovário primárias. Estudos mecanísticos mostram que a apoptose induzida por LBW242 em células de cancro do ovário está associada com a activação de caspase-8. Em linha com este mecanismo, c-FLIP superexpressão inibe a apoptose LBW242 mediada.

Conclusão

LBW242 sensibiliza as células de cancro do ovário aos efeitos antitumorais de trilha e anticancerígenos drogas comumente usadas na clínica. Estas observações sugerem que a LBW242 mímica SMAC /DIABLO poderia ser de grande valor para o desenvolvimento de estratégias experimentais para o tratamento de câncer de ovário

Citation:. Petrucci E, Pasquini L, Bernabei M, Saulle E, Biffoni M, Accarpio F, et al. (2012) uma molécula pequena SMAC Mimic LBW242 Potencializa TRAIL- e droga anticâncer-Mediated morte das células do cancro do ovário. PLoS ONE 7 (4): e35073. doi: 10.1371 /journal.pone.0035073

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2011; Aceito: 09 de março de 2012; Publicação: 25 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Petrucci et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos subsídios da Saúde Ministério Italiano, Progetto Oncotecnologico a UT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é transtorno de várias etapas muito complexo que envolve a acumulação progressiva de alterações genéticas e epigenéticas, que em última análise, levar à transformação de células normais em células malignas exibindo as propriedades essenciais de câncer: resistência aos mecanismos apoptóticos, independência de sinais de crescimento , insensibilidade aos sinais de crescimento negativas, capacidades invasivos e metastáticos, potencial replicativo ilimitada e angiogênese sustentada [1]. Entre estas várias propriedades das células cancerosas, a resistência à apoptose certamente desempenha um papel muito relevante no desenvolvimento e progressão do tumor. A capacidade de células cancerígenas para escapar apoptose está relacionada com diversas propriedades bioquímicas destas células, e particularmente, com a sobre-regulação de genes anti-apoptóticos tais como certos membros da família Bcl-2 de proteínas e membros do inibidor de apoptose (IAP ) da família de proteínas [2]. Particularmente, três linhas de evidência apoiam um papel para as proteínas IAP em Câncer: (i) os níveis de proteínas de IAP, particularmente de XIAP, C-IAP1 e C-IAP2 expressão elevada, num certo número de tipos de cancro humano correlaciona com o grau do tumor e o prognóstico [ ,,,0],3]; (Ii) uma série de

in vitro

e

in vivo

estudos têm demonstrado que a regulação negativa de XIAP ou c-IAP1 por vários agentes resulta na sensibilização das células cancerosas por quimioterapia e gama irradiation- apoptose induzida [4]; (Iii) a região cromossómica 11q21-q23 contendo genes c-IAP1 e C-IAP2 é sujeito a amplificação cromossómica em vários tumores [3], [4].

IAP, e em particular C-IAP1, c- IAP2 e IAP ligada ao X (XIAP), funcionam para inibir a apoptose através da prevenção da activação de caspases-8 ou inibir a actividade de caspases-9 e -7, -3, respectivamente, [5], [6]. C-IAP1 e C-IAP2 possuem um domínio de ubiquitina ligase E3 que promove a degradação dependente de proteassoma de C-IAP1 e C-IAP2 [7]. A actividade do IAP é antagonizado pela SMAC /DIABLO (ativador segunda derivadas de mitocôndrias das caspases /inibidor direto da proteína de ligação de apoptose com baixa pi) que, após a saída da mitocôndria em resposta a apoptótica de disparo, sofre maturação e clivagem da sua N região -terminal, com a consequente exposição da sequência AVPI [8]. Este liga-se tetrapepetide XIAP e compete com os mesmos locais de ligação que estão envolvidos na interacção com as caspases [9]. Através deste mecanismo, SMAC /DIABLO impede a sequestração de caspases por IAP, facilitando, assim, a via apoptótica. Desde a sequência AVPI é capaz de promover a apoptose, os compostos capazes de imitar este tetrap�tido, conhecidos coletivamente como SMAC-miméticos, ter representado o objetivo dos esforços de investigação intensiva e vários destes agentes têm sido desenvolvidos durante estes últimos anos [10] – [15 ].

é importante notar que uma desregulação de IAP pode contribuir para o desenvolvimento do tumor, não só através de caspases inactivação, mas também através de mecanismos diferentes que não dependem da inactivação caspases. Assim, um estudo recente mostrou claramente que: XIAP contribui para a metástase

in vivo

e invasão celular

in vitro

, independentemente de caspases de ligação e inibição; XIAP em complexo com survivina dirige a activação de NF-kB para promover a invasão celular e metástase; C-IAP1 e C-IAP2 também estão envolvidas na invasão de células de cancro [16].

Assim, a inactivação de IAP, particularmente quando combinado com outros tratamentos (tais como fármacos quimioterápicos, ligandos de morte, incluindo o TNF-alfa e TRAIL ), resulta na morte da maioria das células de tumor, pelo menos sob condições de cultura de tecidos [11], [13], [16], [17]. Importante, a inactivação de IAP parece não ser prejudicial para as células normais. O conjunto destas observações tem apoiado o desenvolvimento de pequenos inibidores farmacológicos de IAPs que foram introduzidas na fase I de ensaios clínicos [5].

LBW242 é um peptidomimético segmentação IAPs recentemente relatado por Zawel e colegas de trabalho que compete com alta afinidade com a SMAC /DIABLO para ocupação da cavidade de ligação XIAP BIR3 [17]. Este composto mostrou-se capaz de induzir apoptose de vios tipos de culas incluindo o mieloma múltiplo, leucemia mielóide aguda, glioblastoma e melanoma [18] – [21].

Neste estudo, exploramos a capacidade de LBW242 para induzir a morte celular por apoptose de células de cancro do ovário adicionados isoladamente ou em combinação quer com TRAIL ou fármacos anti-cancerígenos. Os nossos resultados indicam que LBW242 melhora a sensibilidade de morte celular do cancro do ovário induzida tanto por TRAIL ou anticancerígenos drogas tais como topotecano através de um efeito relacionado com uma potenciação da activação de caspase-8. Estas observações suportam estudos futuros para investigar um possível papel da LBW242 no tratamento do câncer de ovário.

1A- A2780WT, A2780ADR, HEY e células SKOV3 foram cultivadas durante 48 horas, quer na ausência ou na presença de TRAIL (50 ng /ml) e, ou, na ausência ou na presença de concentrações crescentes de LBW242 (de 1 a 10? M) e no final da cultura determinou-se o número de células vivas. A diferença entre controle e TRAIL foi estatisticamente significativa: p = 0,001 para A2780WT e HEY; = p 0,01 para SKOV3; = p 0,05 para A2780ADR. células 1B- A2780WT e SKOV3 foram cultivadas como acima e após 48 h de cultura, a proporção de células em apoptose foi determinada pelo ensaio de ligação e iodeto de propide coloração Anexina-V. A percentagem de células apoptóticas foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados representam os valores médios observados em três experiências separadas. A diferença entre controle e TRAIL foi estatisticamente significativa:. P = 0,01 para ambas as células A2780WT e SKOV3

Métodos

declaração

Ética

Este estudo foi especificamente aprovado pelo Institutional Review Board do Istituto Superiore di Sanità e estava de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki II. O conteúdo informado escrito foi obtido de cada paciente.

A2780WT, células A2780ADR e SKOV3 foram estavelmente transfectadas com um vector vazio (PINCO) ou com o vector contendo o ADNc de c-flip (FLIP) ea as células resultantes foram cultivadas, quer na ausência (controlo) ou na presença de LBW242 (10 uM) ou TRAIL (50 ng /mL) ou ambos estes agentes nas concentrações acima. A percentagem de células apoptóticas foi determinada por citometria de fluxo utilizando o ensaio de ligação a Anexina-V /PI. Os dados representam os valores médios ± SEM observada em três experiências separadas. Análise estatística: * = p 0,05; ** = P 0,01; *** = P . 0,001

Cultura celular

sensíveis a cisplatina humano do ovário epitelial linha celular de carcinoma A2780WT foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC); A linha de células resistente à adriamicina-A2780ADR, derivada a partir da sua parental A2780 linha celular de cancro do ovário, aplicando stepwise aumentos em concentrações de adriamicina foi obtida a partir da Colecção Europeia de Culturas de Células (ECACC). As células foram tratadas com A2780ADR 10 uM adriamicina cada 10 passagens. SKOV3 e hey linhas de células foram obtidas de ATCC.

A2780WT, A2780FLIP, A2780ADR, A2780ADR FLIP, as células FLIP SKOV3 e SKOV3 foram cultivados como relatado na Fig. 2, quer na ausência ou na presença de 40 uM zVAD-fmk ou zIETD-fmk e após 48 h de incubação, a percentagem de células apoptóticas foi determinada pelo ensaio de ligação de anexina-V /PI. Os resultados representam valores médios ± SEM observada em três experiências separadas.

As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 em avançada MEM com 3% de soro fetal de bovino (FBS, Euroclone, Milão, Itália), 50 UI /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, 50 ng /ml de gentamicina e 0,3 jig /ml de glutamina. As células foram rotineiramente verificados quanto à presença de micoplasma.

No painel C, tanto o comprimento total (FL) e a forma clivada (CF) da caspase-3 são mostrados. A imunotransferência de PARP mostra duas bandas, das quais as superiores corresponde a uma forma de comprimento completo da PARP e da banda inferior a uma forma clivada da PARP. Na Figura são relatados os dados representativos observados em um dos três experimentos realizados.

Isolamento e cultivo in vitro de células de cancro do ovário primárias

foram obtidas biópsias intra-operatórias a partir de 9 pacientes com câncer ovariano, afetadas por adenocarcinoma seroso, submetidos a cirurgia debulking para qualquer doença primária ou reincidente. O tecido tumoral foi dissociado mecanicamente com uma tesoura e uma suspensão de células tumorais foi obtido por digestão em meio de cultura de tecidos (RPMI 1640) contendo colagenase, desoxirribonuclease I e hialuronidase. A suspensão de células final do tumor foi verificada para a proporção de células tumorais por citologia padrão e a percentagem de células epiteliais por citometria de fluxo (determinado após coloração com Ber-EP4 mAb, Dakopatt, Copenaghen, Dinamarca). Resumidamente, para a avaliação de aliquotas de células de reactividade Ber-EP4 foram coradas 30 min a 4 ° C com 5 ug /ml de marcado com FITC Ber-EP4 mAb anti-, lavadas e analisadas para a emissão de fluorescência utilizando um citómetro de fluxo Becton Dickinson. aliquotas de células de tumor (1 × 10

6 células) foram plaqueadas em placas de 25 cm

3 frascos de cultura de tecido em 10 ml de meio de cultura celular contendo 10% de soro fetal de vitelo. Após 1 dia de

in vitro

cultura, as células não-aderentes (contendo restos de tecido e células mortas) foram removidos e foi adicionado meio fresco para a cultura e, em seguida, incubadas durante mais 24 horas, quer na ausência ou na a presença de TRAIL, ou LBW242 ou ambos os reagentes. Ao fim de 24 horas de células de cultura foram confluentes. culturas tumorais continha pelo menos 80% de células tumorais.

Transdução de A2780WT, células SKOV3 e A2780ADR

A2780WT, células SKOV3 e A2780ADR que expressam quer o vector vazio PINCO-GFP (PINCO) ou o vetor PINCO-GFP contendo a c-FLIP

L (FLIP) gene humano foram obtidos como descrito anteriormente [22]. As células transduzidas foram analisadas rotineiramente para a expressão de GFP usando um citómetro de fluxo e para c-FLIP

G expressão por Western blotting.

avaliação apoptose por anexina V-coloração

Depois de tratamentos com drogas, células foram ressuspensas em 200 ul de solução de coloração (Anexina-V contendo fluoresceína e iodeto de propídio em tampão Hepes, Anexina-V-FITC Apoptosis Detection Kit, Pharmingen, San Jose, CA, EUA). A seguir à incubação à temperatura ambiente durante 15 min., As células foram analisadas por citometria de fluxo. Anexina-V se liga às células que expressam fosfatidilserina sobre a camada externa da membrana celular, e iodeto de propídio cora o ADN celular de células com uma membrana celular comprometida. Isto permite a discriminação de células vivas (não coradas quer com fluorocromo) a partir de células apoptóticas (coradas apenas com anexina V) e células necróticas (coradas com ambos Anexina-V e iodeto de propídio).

A quantificação de apoptose e de células análise do ciclo de células activadas por iodeto de propidio /fluorescência

As células foram colhidas com tripsina, lavadas, incubadas primeiro com um tampão detergente tetracloridrato de espermina contendo tripsina para digerir as membranas celulares e citoesqueleto, em seguida, com um tampão citrato contendo um inibidor de tripsina e ribonuclease a para inibir a actividade da tripsina e de digerir o ARN e, finalmente, ressuspensas em 400 ul de iodeto de propídio (PI) solução (50 ug /ml de PI, 0,1% de Triton X-100, e citrato de sódio a 0,1% em PBS) (Ciclo Além disso ADN coloração Kit, Becton Dickinson, EUA). As células foram depois analisadas por citometria de fluxo utilizando um software dedicado para a análise do ADN (software ModFit LT, Verity Software House, Topsham, ME, EUA). As células com teor de DNA subdiploid foram quantificados para determinar a percentagem de células contendo ADN apoptótico, fragmentado.

Reagentes utilizados para induzir a apoptose de células tumorais

células de cancro do ovário foram pré-incubadas com um pan-caspase inibidor, N-benziloxi-carbonil-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zVADfmk) ou N-benziloxi-carbonil-Ile-Glu (OMe) Thr-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zIETDfmk), (ambos a partir de Sigma, St Louis, EUA) antes da adição de vários compostos que estimulam a apoptose.

os anticorpos monoclonais agonistas para TRAIL-R1 (mapatumumab) e TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) são anticorpos totalmente humanos de isótipo IgG1 [23 ], [24] e foram generosamente fornecidos pela Genome Ciências Humanas (Rockville, MD, EUA).

O tratamento com fármacos anti-cancerígenos

Em alguns experimentos células de câncer de ovário foram incubadas com alguns medicamentos anticancerígenos comumente utilizados na terapia do cancro do ovário: cis-diamineplatinum cloreto de (II) (CPLAT); paclitaxel (Taxol); Topotecano Hydrichloride hidratado (TOPO); O etoposido (ETOPO); Cloridrato de Doxorubicina (Doxo). Todas estas drogas foram adquiridos a partir do Sigma Co (St. Louis, EUA) e foram adicionados

In vitro

em duas doses: uma dose baixa correspondente ao nível de pico média no plasma observados durante as infusões de drogas para os doentes de cancro (ou seja, 1,67 uM para CPLAT; 2,45 ^ M para o taxol; 0,21 ^ M; 8,5 uM para ETOPO;. 0,17 uM para Doxo) e uma dose mais elevada, correspondendo a uma dose de cinco vezes mais elevada do que a dose baixa

Análise Western blot

os extractos celulares totais obtiveram-se as células a lise num tampão contendo HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, EGTA 2 mM, 0,5% de NP-40, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM, 2 ug /ml de leupeptina, 2 ug /ml de aprotinina, NaF 25 mM, e 10 mM de Na

3VO

4. Após incubação durante 30 min em gelo, os lisados ​​de proteína foram limpas de detritos por centrifugação a 10.000 g durante 10 min. A concentração de proteína no sobrenadante solúvel, foi determinada utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, VA, EUA).

A- HEY células foram incubadas durante 24 h quer na ausência ( controlo) ou na presença de LBW242 (30 uM) ou de cisplatina (CPLAT em 1,6 ou 8 uM) ou paclitaxel (taxol a 2,5 ou 12,5 ^ M) ou topotecano (TOPO a 0,2 ou 1 uM) ou etoposido (ETOPO em 8 ou 40? M) ou doxorrubicina (Doxo a 0,17 ou 0,85 mM) por si só ou em combinação com LBW242 e analisados ​​para a indução da morte celular por citometria de fluxo. Os dados representam os valores médios ± SEM observada em três experiências separadas. Análise estatística: * = p 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,001. B – HEY células foram incubadas durante 24 h na presença de concentrações crescentes de LBW242either na ausência (controlo) ou na presença de cisplatina (1,6 uM) ou paclitaxel (2,5 uM) ou topotecano (0,2 uM) e analisados ​​para a indução de morte celular por citometria de fluxo. Os dados representam o valor médio ± SEM observada em três experiências separadas. As diferenças entre o controle e topotecano (p = 0,001), controle e Paclitaxel (p = 0,001) e controle e Cisplatina (p = 0,05). Foram todas significativas

A- LBW242 potencia o efeito pró-apoptótica de cloridrato de topotecano, um inibidor da topoisomerase I. A2780WT PINCO e FLIP (

painéis superiores

) e SKOV3 PINCO e FLIP (

painéis de fundo

) as células foram incubadas durante 24 h, quer na ausência (controlo) ou na presença de qualquer DMSO 0,01% ou zVAD-fmk 40 mM, cloridrato de topotecano 1? M, TRAIL 50 ng /ml ou LBW242 + zVAD-fmk, LBW242 + cloridrato de topotecano, TRAIL + zVAD-fmk, TRAIL + cloridrato de topotecano, cloridrato de topotecano + zVAD-fmk, LBW242 + TRAIL, LBW242 + TRAIL + zVAD-fmk, LBW242 + cloridrato de topotecano + zVAD-fmk e analisados ​​para a indução da apoptose por citometria de fluxo. Os dados representam os valores médios ± SEM observada em três experiências separadas. Em A7280 WT PINCO e em células SKOV3 Pinco LBW242 + TOPO induziu uma proporção de células mortas mais elevadas do que a observada com qualquer LBW242 (p = 0,05) ou TOPO (p = 0,05). B e C – Avaliação de caspases-8 a activação em células A2780 e A2780ADR incubadas quer na ausência (controlo) ou na presença de LBW242 ou de topotecano ou de ambos LBW242 e topotecano. A caspase-8 actividade em células intactas foi medida utilizando um substrato específico fluorigênico caspases-8. resultados originais a partir de uma análise representativa são apresentados em B, enquanto os valores médios ± SEM de as percentagens de células que são visualizadas de caspase-8 de activação são relatadas em C. A percentagem de células que exibem activada caspases-8 foi superior, tanto para as células de WT e de ADR em LBW242 do que em células NT (p = 0,05) e em LBW242 + TOPO do que em LBW242 ou células tratadas-TOPO (p = 0,05)

Anticorpos

Anti. -caspase -9, -3 foram adquiridos da Upstate (Upstate Biotechnology Lake Placid NY, EUA e R D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA); Anti-XIAP e anti-Bcl-2 foram adquiridos a BD Pharmigen (BD Pharmigen, San Diego, EUA); anti-survivina e anti-PARP foram adquiridos a partir de R D System (R D System Inc., Minneapolis, MN); anti-FADD foi comprado de BioSource (BioSource, Camarillo, CA, EUA); anti-c-flip (NF6 clone) e anti-c-IAP foram adquiridos da Alexis (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, EUA); anti-actina de Oncogene (Oncogene Research Products, Cambridge, MA), foi utilizado como controle de carga.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o Programa Pad Graph. Todos os parâmetros foram registados como médias ± SEM. Para comparar diferenças entre os grupos, robusto ANOVA foi realizada. Os valores P relatadas foram em frente e verso. Um valor de P inferior a 0,05 indicava significância estatística. análise de isobolograma foi realizada utilizando o programa de software CalcuSyn (Biosoft, MO, e Cambridge, Reino Unido). Um índice de combinação (CI) inferior a 1,0 indica sinergia, um um IC de 1,0 indica atividade aditivo [25].

Resultados

LBW242 melhora a morte celular mediada por TRAIL de linhas de células de cancro do ovário

em nossos estudos anteriores que mostraram o efeito pró-apoptótica de SMAC /DIABLO composto mimético 3 em linhas celulares de cancro do ovário A2780WT e sua A2780DDP homólogo resistentes e A2780ADR [26]. No presente estudo, investigamos o efeito de outro mimético SMAC /DIABLO, LBW242, em modelos de câncer de ovário. Em primeiro lugar, exploramos a proliferação celular num ensaio de dose-resposta de LBW242 sozinho e em combinação com TRAIL (Fig. 1A). O A2780WT linha de células (

parte superior do painel esquerdo

) foi apenas ligeiramente inibida em seu crescimento por LBW242 adicionado sozinho; No entanto, o tratamento combinado de LBW242 com TRAIL resultou em uma inibição sinérgica do crescimento das células marcadas. O mesmo tipo de sensibilidade foi observada para linha de células HEY (

painel inferior

esquerda). análise isobolograma confirmou actividade anti-tumoral sinérgica de LBW242 além de TRAIL (para A2780WT CI = 0,77 e HEY CI = 0,80). A interacção sinérgica dos LBW242 e TRAIL em A2780WT e HEY linhas celulares pode ser intuitivamente visualizado através da representação gráfica de dados de crescimento celular utilizando medições no LBW242 0 uM com e sem TRAIL como 100% e todas as medições subsequentes expressas em relação ao seu próprio controlo (ver Fig. S1). Esta figura revela uma redução adicional em número de células causada pela adição de LBW242 na parte superior do que a induzida por TRAIL sozinho (Fig. S1).

As barras cinzentas representam valores médios ± SEM. células cancerosas do ovário isolados a partir de biópsias de tumores foram cultivadas durante 24 horas, quer na ausência ou na presença de LBW242 (10 uM) ou de TRAIL (50 ng /mL) ou ambos os agentes com as concentrações acima.

Painel inferior na

direita: A proporção de células mortas foi superior em LBW242 ou TRAIL ou LBW242 + células do que as células no controle não-tratadas (0,01 p = Além disso, a percentagem de células mortas foi menor em LBW242 + TRAIL que em TRAIL ou células tratadas com LBW242 (para ambos os p = 0,05).

Painel inferior na

esquerda: O número de células foi significativamente menor no LBW242 + TRAIL do que em TRAIL ou células tratadas com LBW242 (para ambos p = 0,05)

o A2780ADR e SKOV3 (

painéis da direita) as linhas celulares foram os mais sensíveis ao efeito inibidor de LBW242 na proliferação de células, que foi moderadamente aumentado por adição de TRAIL. análise de isobolograma mostrou um efeito aditivo de LBW242 mais TRAIL em inibir o crescimento destas linhas de células (por A2780ADR IC = 0,97; para SKOV3 IC = 1,0).

Os mesmos tratamentos foram realizados em A2780WT e linhas de células SKOV3 a avaliar o efeito de LBW242 sobre a percentagem de células apoptóticas (Fig. 1B). As células foram A2780WT pouco sensíveis aos tratamentos individuais com LBW242 ou TRAIL sozinho, mas muito sensíveis ao tratamento combinado (IC = 0,70). células SKOV3 foram sensíveis ao efeito pró-apoptótica de LBW242, mas pouco sensíveis a TRAIL; a adição combinada das duas drogas aumentou ainda mais a taxa de apoptose (IC = 0,79) (Figura 1B).

Estes dados indicam que:. linhas celulares de cancro do ovário são sensíveis aos efeitos LBW242, particularmente no tratamento combinado com TRILHA; LBW242 exerce uma actividade aditiva ou sinérgica anti-tumor com TRAIL em linhas celulares de cancro do ovário.

As experiências realizadas utilizando provas anti-TRAIL-R1 (mapatumumab) ou R2-anti-TRAIL (mAbs) LEXATUMUMAB desde que agonística este último um adicionado em conjunto com LBW242 induziu uma alta taxa de apoptose de todas as quatro linhas celulares de cancro do ovário aqui estudados (dados não mostrados).

c-FLIP

G superexpressão inibe o efeito pró-apoptótico de LBW242

em estudos anteriores foi demonstrado que, sob a estimulação de TNFa, a caspase-8 é uma protease essencial apoptótica da morte celular induzida pelo antagonista de IAP [27] – [30]. Para explorar um possível papel da caspase-8 ativação da morte celular LBW242 mediada, usamos linhas de células estavelmente transfectadas com c-FLIP

L (FLIP A2780WT, FLIP A2780ADR e SKOV3 FLIP), natural caspase-8 inibidor. células A2780WT, A2780ADR e SKOV3 expressam baixos níveis de c-FLIP, c-FLIP

L, sendo a única isoforma detectável nestas células (Fig. 2 e Fig. S2). Em contraste, como é de esperar, FLIP A2780WT, FLIP A2780ADR e SKOV3 FLIP expressam elevados níveis de c-FLIP

L (Fig. 2 e Fig. S2). C-FLIP

S foi indetectável em todas estas linhas celulares (Fig. S2).

Painel Notavelmente, em A2780WT, as células de ADR e SKOV3 (Fig. 2,

esquerdo

s

) transfectadas com vector vazio (PINCO), o único tratamento com LBW242 ou TRAIL induz um efeito apoptótico moderada, enquanto que o tratamento combinado de LBW242 com TRAIL induz um aumento notável na morte celular. Nessas células superexpressando c-FLIP

L (Fig. 2,

painel direito

s

) o efeito do tratamento LBW242 sozinho ou em combinação com TRAIL é altamente inibida, apoiando assim a hipótese de que SMAC /DIABLO mimético pode actuar através da indução de uma via de activação de caspase-8

Para este fim as células também foram tratados com um inibidor da pan-caspase zVAD ou com um inibidor específico da caspase-8, zIETD.; na Fig. 3, a percentagem de morte celular foi reportado. Como esperado zVAD protege as células do efeito apoptótico de ambos os tratamentos simples ou combinadas, o que indica envolvimento na activação da caspase BPN 242 + morte celular mediada por TRAIL. Além disso, é possível notar que o efeito de zIETD é comparável à de zVAD, indicando, portanto, um papel chave da caspase-8 de activação sob a acção combinada de LBW242 e tratamentos TRAIL (Fig. 3,

painel

s

).

LBW242 adicionado em conjunto com TRAIL induziu activação de caspase-8

análises bioquímicas foram realizadas por meio da investigação da expressão de diferentes proteínas envolvidas na via apoptótica em A2780WT PINCO, A2780ADR PINCO, SKOV3 PINCO e FLIP A2780WT, A2780ADR FLIP e linhas celulares FLIP SKOV tratados como acima mencionado. Na Fig. 4 A, B e C, após 24 h de tratamentos, é possível observar que os níveis de XIAP não são afectados por LBW242. Este resultado está em linha com estudos anteriores que mostram que LBW242 inibe a atividade de XIAP, sem afectar a sua expressão [17] – [21]. Como esperado com base em relatórios anteriores [17] – [21], LBW242 downmodulates drasticamente os níveis de c-IAP1, um fenómeno claramente visto em todas as linhas celulares, incluindo aqueles com superexpressão de c-FLIP

L. O tratamento de linhas celulares de cancro do ovário com LBW242 induziu um efeito sobre a expressão de c-IAP2 muito diferente do que a observada para c-IAP1. De facto, 24 h de exposição das células a um LBW242 induzida upmodulation clara dos níveis de c-IAP2 (Fig. 4), de acordo com um relatório anterior [31]. Como é de esperar, c-FLIP

G superexpressão não alterou o efeito da LBW242 sobre os níveis de C-IAP2 (Fig. 4). Por outro lado, TRAIL induziu um aumento moderado de C-IAP2, um achado em linha com estudos anteriores [32]. Nomeadamente, c-FLIP superexpressão impedido o efeito estimulador de TRAIL nos níveis de C-IAP2 (Fig. 4). O tratamento combinado com LBW242 e TRAIL resultou em um upmodulation acentuada dos níveis de C-IAP2 (Fig. 4). Além disso, LBW242 não conseguiu induzir qualquer caspase-8, caspase-9 ou caspase-3 de activação, uma vez que pode ser inferida a partir da ausência de qualquer redução significativa da pro-caspase-8, -9 e -3 níveis e da aparência da caspase activa fragmentos clivados (ver Fig. 4 a a C e a Fig. S3). De acordo com estes resultados, LBW242 falharam em induzir a clivagem de PARP, um alvo sensível de activada de caspase-3 (Fig 4A a C).

Quando LBW242 foi adicionado em conjunto com TRAIL marcadamente potenciado o efeito deste ligando morte na caspase-8 e caspase-3 de activação e sobre a clivagem de PARP em células A2780 WT, A2780 ADR e SKOV 3 linhas de células transfectadas com os vectores vazios, mas não nos que sobre-expressam c-FLIP

L (Fig. 4 a a C) . É importante notar que a activação da caspase-8, desencadeada por TRAIL e principalmente por LBW242 + TRAIL, conduz ao Bid degradação, conseguindo-se assim a activação da via intrínseca apoptótica (Fig. 4 A a C). degradação lance foi quase completamente prevenida pela c-FLIP superexpressão (Fig. 4 A a C).

LBW242 melhorou o efeito pró-apoptótica de fármacos anticancerígenos em células de cancro do ovário

O tratamento médico padrão de câncer de ovário envolve em primeira instância, o uso de platina e anticancerígeno taxol drogas. Portanto, parece de interesse para avaliar um possível efeito cooperativo de algumas drogas anticancerígenas, tais como cisplatina, taxol, topotecano, doxorubicina e et opôs ido em combinação com LBW242. Deste modo, numa primeira série de experiências foram tratados HEY células com cisplatina ou paclitaxel ou topotecano ou etoposido ou doxorrubicina, adicionado em duas doses, uma dose clínica mais baixo correspondente à dose de pico observados durante a infusão destas drogas para os doentes de cancro e de 5 vezes dose mais elevada supraclínicas, sozinho ou em combinação com uma dose de planalto LBW242 (30 uM). Os resultados deste estudo demonstram claramente que LBW242 era capaz de potenciar os efeitos citotóxicos de todas estas drogas (Fig. 5a). análise de isobolograma mostrou actividade sinérgica anti-tumoral de LBW242 mais Cisplatina (IC = 0,82) ou com paclitaxel (IC = 0,70) ou mais Topotecano (0,72) ou mais Etoposido (IC = 0,73) ou com doxorubicina (p = 0,78). Numa segunda experiência testou-se a capacidade de várias doses de LBW242 para aumentar a citotoxicidade induzida por uma dose clínica de cisplatina, taxol ou topotecano. Esta experiência mostrou que LBW242 de uma forma dependente da dose o aumento da resposta citotóxica para essas drogas, alcançar os efeitos máximos a 20-30 uM dosagens (Fig. 5B). análise de isobolograma mostrou actividade anti-tumoral mais sinérgica de LBW242 Topotecano (IC = 0,70) ou o Taxol (IC = 0,71) ou cisplatina (IC = 0,82).

Com base nestes resultados, num segundo conjunto de experiências, nós concentramos nossa atenção sobre a capacidade de LBW242 para melhorar os efeitos de topotecano, um medicamento usado no tratamento do câncer de ovário e conhecido como um potencial caspase-8 ativador [33].

na Fig. 6A é possível observar que o Topotecan exerce um efeito pró-apoptótico acentuada quando adicionado em combinação com LBW242 e TRAIL em células Pinco A2780WT; a morte celular de células de tumor causado por estes agentes, quando utilizados em combinação é muito inibida pelo pan-caspase zVAD-fmk inibidor e, por conseguinte, é mediada principalmente através da activação da caspase.

Em células FLIP A2780WT a indução de apoptose desencadeada por a associação entre LBW242, TRAIL e topotecano é quase completamente inibida, o que sugere um papel importante da caspase-8 na indução da morte de células de tumor (Fig. 6A)

.

Estas observações foram confirmadas em SKOV3 e PINCO FLIP células SKOV3 (Fig. 6A). Um papel para as caspases-8 a activação na morte induzida por Topotecano de células de cancro do ovário foi ainda apoiada por experiências de quantificação da activação de caspases-8.