Abstract
A falta de tridimensional (3-D) de alto rendimento (HT) ensaios de rastreio destinados a identificar drogas invasão anti-câncer é um grande obstáculo na redução da mortalidade relacionada com o cancro, com a principal desafio sendo ensaio de padronização. Apresentado é o desenvolvimento de um novo ensaio de invasão 3-D com potencial HT que envolve em torno esferas de células-colagénio dentro de colagénio para criar um ambiente de 3-D, através do qual as células podem invadir. Padronização foi alcançado através da concepção de uma placa de 96 poços trabalhada para criar um local designado precisamente para as esferas de células-colagénio e usando dialdeído dextrano para inibir a contracção do colagénio, mantendo o tamanho e forma uniforme. Isto permite a leitura automático para determinação do efeito de compostos inibidores na invasão de células de cancro. A sensibilidade foi demonstrada pela capacidade de distinguir diversos níveis de invasividade de linhas celulares de cancro, e robustez foi determinada calculando o factor-Z. Um factor-Z de 0,65 foi obtido por comparação dos efeitos de DMSO e anticorpo anti-integrina β1, um reagente inibidor, na invasão de células cancerosas DU145, sugerindo este ensaio romance é adequado para a descoberta da droga em grande escala. Como prova de princípio, a biblioteca de compostos NCI Diversidade foi exibido contra as células cancerosas invasivas humanos. Nove compostos que exibem elevada potência e baixa toxicidade foram identificadas, incluindo DX-52-1, um composto anteriormente relatado para inibir a migração de células, um factor determinante de invasão do cancro. Os resultados indicam que esta plataforma inovadora HT é um simples, preciso e fácil de replicar ensaio de invasão 3-D para a descoberta de drogas anti-câncer
Citation:. Evensen NA, Li J, Yang J, Yu X, Sampson NS, Zucker S, et al. (2013) Desenvolvimento de um Invasion Ensaio de Alto Throughput tridimensional para Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE 8 (12): e82811. doi: 10.1371 /journal.pone.0082811
editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América
Recebido: 12 de setembro de 2013; Aceito: 06 de novembro de 2013; Publicação: 11 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Evensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte pelo Breast Cancer Foundation Baldwin e do Instituto Nacional do Câncer (1R01CA166936). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a metástase é a principal causa de morte em doentes com cancro, e um dos processos biológicos mais complexos em doenças humanas [1]. Um grande desafio para o desenvolvimento de fármacos anti-cancro que visam prevenir a metástase é a falta de instrumentos eficazes para a descoberta de fármacos. programas de descoberta de drogas têm-se centrado principalmente na triagem baseado em alvo, o que resultou em novas categorias de agentes farmacológicos, inibidores da cinase de tirosina e principalmente anticorpos monoclonais [2]. No entanto, uma vez que a maioria dos tipos de cancros desenvolver numerosas mutações durante a progressão tumoral [3], os clones individuais de células de cancro muitas vezes contornar compostos inibidores focados em moléculas individuais segmentados [4]. O fracasso para comercializar muitas descobertas de drogas por objectivo financiamento público está levando à necessidade de novas abordagens para acelerar o desenvolvimento de medicamentos para os cancros metastáticos. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas que podem ser utilizadas para a identificação de drogas eficazes que visem o fenótipo invasivo das células cancerosas, uma exigência na fase precoce de metástases [5], e a etapa posterior de recorrência do cancro devido a auto-sementeira a partir de micro /macro tumores metastáticos apareceu [6], é imperativo na conversão desta doença fatal para uma crónica.
segmentação eficaz da invasão de células do câncer requer uma tecnologia passível de imitar
in vivo
condições. Evidências crescentes demonstrou que tridimensional (3-D) de matrizes para a cultura de células de cancro mais estreitamente
In vivo
condições mimetizam, em comparação com as condições de cultura de células de 2-D. Portanto rastreio em condições de cultura 3-D oferece uma maior valor preditivo para a futura eficácia clínica de potenciais drogas e permite uma melhor otimização [7,8]. Atual 3-D de alto rendimento (HT) ensaios de rastreio está focado principalmente na identificação de compostos que inibem o crescimento do tumor e proliferação [9-15]. Têm sido feitas tentativas para desenvolver 3-D ensaios de invasão com capacidade HT [16-18]. No entanto, a utilização destes ensaios para a descoberta de invasão de células de droga anti-cancro tem sido impedidos, devido ao elevado custo do rastreio em grande escala [16,17], um requisito para a longos tempos de incubação (por exemplo, 3 a períodos de incubação de 5 dias ) para leituras de ponto final determinado por baixo sinal: rácios de fundo [17], procedimentos morosos [16,18,19], e /ou a falta de técnicas padronizados e automatizados para quantificar a invasão de células [20].
Aqui, nós fornecemos um 3-D ferramenta de triagem romance gel de colágeno à base de esferóide invasão HT para identificar drogas que mostram as capacidades anti-invasão. Ao utilizar uma placa inovadora trabalhada, juntamente com dextrano dialde�o misturado com colágeno para evitar a contração, este romance ensaio de invasão 3-D permite a padronização e leitura automatizada, que são requisitos fundamentais para a triagem HT. Nós fornecemos evidências de que o nosso ensaio de invasão 3-D é reprodutível, eficaz, fácil e rápido de executar, e sensível o suficiente para identificar compostos que inibem a invasão da célula cancerosa. O potencial desses acessos ativos para ter um impacto positivo sobre os pacientes com câncer, impedindo a divulgação suporta o uso deste ensaio em programas de descoberta de drogas atuais.
Materiais e Métodos
Materiais
colágeno tipo I (tipo nativo extraído por ácido acético I colágeno de tendão de cauda de rato) e iodeto de propídio (PI) foram adquiridos de BD Bioscience Descoberta médico laboratorial. inibidor tecidual recombinante da metaloproteinase-2 (TIMP-2) e o anticorpo de domínio hemopexina anti-MT1-MMP foram adquiridos a Chemicon International, Inc. vector de ARNi-Ready pSIREN retro-Q para o silenciamento do gene específico e pQCXIP vector retroviral para a geração de células estáveis foram adquiridos a partir de Clontech. corante nuclear Hoechst foi adquirido de Invitrogen. O anticorpo anti-integrina β1 foi comprado de GE Healthcare. A estaurosporina, o paclitaxel, e dextrano (PM = 500000) foram adquiridos de Sigma.
Linhas de Células e Tratamento de Células
fibrossarcoma humano HT-1080, o cancro da próstata humano LNCaP, DU145, PC3 e, cancro epitelial da mama humana linhas celulares MDA-MB-231 foram adquiridos a partir de ATCC. As células LNCaP que expressam proteína verde fluorescente (GFP) ou MT1-MMP-GFP ADNc quiméricos foram previamente descrito [21]. As células foram mantidas em DMEM-elevado teor de glucose ou meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10% FBS e 1% de Pen /Strep. A SK-3
células Rd e formação mammosphere foram previamente descritos [22]. Resumidamente, estas células foram cultivadas em pratos de ultra-baixas de fixação (Corning) em suspensão com DMEM-F12 (Cellgro) suplementado com B27 (01:50, Invitrogen), EGF (20 ng /ml BD Biosciences), soro bovino a 0,4% albumina (Sigma) e 4 ug /ml de insulina (Sigma) [22].
3-D Ensaio celular Dispersão
Este ensaio foi realizado como anteriormente descrito [21]. Resumidamente, suspensões de células únicas de células LNCaP (4×10
4 células /ml) que expressam GFP ou MT1-MMP-GFP foram misturadas com colagénio do tipo I (2,5 mg /ml de concentração final). As culturas de células-colagénio em gel foram deixadas a solidificar em placas de 24 poços. Após solidificação, o meio completo foi adicionado com ou sem inibidores indicados. a capacidade das células de espalhamento foi monitorada sob um microscópio Nikon mais de 6 dias.
3-D multi células-Spheroid Invasion Ensaio
Para gerar agregados celulares, SK-3
células RD (1000 células /ml) foram cultivados em pratos de cultura de ultra-baixa aderência durante 12 dias. As esferas foram então transferidas para placas de 24 poços contendo colagénio de tipo I. Os esferóides foram então cultivadas incorporados durante 3 dias sob condições de hipóxia ou de normóxia. Para condições de hipoxia, as células foram incubadas com um conjunto BioSpherix ProOx C21 a 1% O
2 e 5% de CO
2. Para o método de esferóide com várias células utilizando contas de vidro microtransportador, as células que expressam LNCaP MT1-MMP-GFP foram cultivadas com os grânulos durante 24 horas com agitação. Os agregados de células com esferas foram então transferidas e embebidos em colagénio do tipo I e cultivadas durante mais 3 dias.
H3>
células cancerosas (8×10
7 células /ml ) foram misturados com um volume igual de 3 mg tipo neutralizada /ml de colagénio I sobre gelo, seguido pela adição de solução de dialdeído dextrano (final de 0,25% do volume total). A mistura de células-colagénio foi então salpicado para os pits, no centro de cada poço de uma placa de 96 poços. O tamanho ideal do poço em cada poço é de 2 mm de diâmetro e requer 4.18 mm
3 (l) [4 /3πr³, r = 1 mm] da mistura de células-colagénio para criar um ponto esférico dentro do poço. Após a solidificação dos pontos de células-colagénio a 37 ° C, uma camada de tipo I de colagénio neutralizado (80 ul, 1,5 mg /ml de concentração final) foi adicionada para cobrir os hemisférios de células-colagénio. Após uma incubação de 10 minutos a 37 ° C, o complexo de invasão de células montado foi coberta com 80 uL de meio com inibidores adicionados ou veículo.
Observação de células invadidas
células cancerosas foram coradas com Invaded tanto a Hoechst 33342 (25 ug /ml) para a coloração nuclear de células totais e PI (2,5 ug /ml) para a coloração de células mortas seguido por lavagem extensiva com PBS. Invasão das células cancerosas foi então examinado por microscopia fluorescente. Para automatizar a quantificação de células invadidas, foram obtidas imagens de contraste de fase e Hoechst para toda a placa. Um limiar da imagem de contraste de fase de um controle (não tratado ou tratado com veículo) poço da placa de 96 poços foi ajustada com base na diferença de contraste entre o exterior eo interior do poço para criar duas camadas binários. A camada binário fora do poço foi copiado para formar uma região de interesse (ROI), o qual foi, em seguida, aplicado às imagens Hoechst. As células invadidas dentro da ROI foram então contados automaticamente utilizando contagem de objecto. Isso foi feito usando NIS-Elements Br 3.2 Software.
A oxidação de dextrano ao Formulário dialdeido Dextran
2,5 g de dextrano foi dissolvido em 100 ml DIH
2O. periodato de sódio (NalO
4) (1,65 g) foi adicionado durante 18 horas de incubação, com agitação, à temperatura ambiente. Para parar a reacção, foi adicionado 1 ml de etileno glicol. A solução foi dialisada com DIH
2O durante 3 dias, liofilizadas e reconstituídas com DIH
2O para uma concentração final de 2,5% de dextrano dialdeído.
Protease Ensaio
Total de actividade proteolítica celular foi determinada utilizando um kit de detecção fluorescente (Sigma). Em resumo, os lisados celulares foram incubadas durante 20 horas a 37 ° C com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com substrato de caseína. Os lisados foram ácido tricloroacético (TCA) precipitado. Os sobrenadantes contendo fragmentada FITC-caseína foram então combinadas com tampão de ensaio e a sua intensidade de fluorescência foi medida com excitação a 485 nm e emissão a 535 nm, utilizando um SpectraMax Gêmeos EM (Molecular Devices) leitor de placa fluorescente.
Análise estatística
Student não pareado frente e verso t-teste foi utilizado para avaliar as diferenças com valor de p 0,05 considerado estatisticamente significativo. Os dados recolhidos foram apresentados como média ± DP para todas as análises de três experiências independentes. GraphPad Prism 5 software foi utilizado para esta análise.
Resultados
Limitações da Invasão atual Ensaios dificultando HT Capacidades de Triagem
Actualmente utilizados ensaios de invasão 3-D são baseados em células de monitoramento espalhando capacidade e pode ser montado de várias maneiras. No entanto, todos eles carecem de atributos-chave necessários para a capacidade de triagem HT. Por exemplo, alguns ensaios não é possível distinguir entre inibidores de proliferação celular e invasão. Nestes tipos de ensaios, as células individuais incorporado em matrizes, tais como colagénio de tipo I, são examinadas quanto à sua comportamento invasivo com base no seu padrão de crescimento espalhamento seguinte proliferação. Na Figura, um 1A, células LNCaP, uma linha celular de cancro da próstata humano menos invasiva, que expressam estavelmente tipo membrana uma metaloproteinase de matriz (MT1-MMP) fundida com uma proteína fluorescente verde (GFP) (MT1-GFP) apresentaram um padrão de crescimento de espalhamento, indicativo de um comportamento invasivo, em comparação com células de controlo que GFP em vez formados um agregado de células de dentro do gel. Isto é consistente com relatos prévios que demonstram que MT1-MMP pode induzir a invasão de tipos de células não-agressivas [23]. No entanto, tanto a invasão de células e proliferação são necessários para formar o padrão de crescimento dispersa e existe uma falta de padronização impedindo leitura automatizada. Por isso, este ensaio de dispersão de células individuais não é adequado para a descoberta de drogas anti-cancro HT especificamente destinado a segmentação de invasão do cancro.
A) a. De uma única célula de ensaio de espalhamento: Individual, células LNCaP isoladas foram misturados com colágeno e examinados diariamente. -MT1-GFP expressando células gradualmente apresentado um padrão de crescimento espalhamento após 6 dias em cultura, em comparação com o crescimento do agregado de células que expressam GFP. b. ensaio de dispersão agregado: SK-3
células rd foram cultivadas por 12 dias para formar mammospheres, transferidos e incorporados em colágeno, e depois cultivadas sob normóxia ou hipóxia. Um padrão disperso foi observado após 3 dias em condições de hipoxia. c. Microtransportador grânulo ensaio de espalhamento: MT1-GFP expressando células LNCaP foram cultivadas com os grânulos durante 24 horas, em seguida, transferidos e incorporados em colagénio. células invadidas foram vistos como um padrão disperso no dia 3. As barras de escala = 20 uM. B) Avaliação da capacidade de invasão de células de cancro usando novo ensaio de invasão 3-D: células LNCaP que expressam controlo de vector (a) ou MT1-MMP (b), as células PC3 cancro da próstata humano (C), e DU145 células (d) foram suspensos em colagénio , pontilhada para dentro do poço de uma placa de 96 poços, e cobertas com colagénio, seguido por meios de comunicação. Após 18 h de incubação, PC3 e DU145, bem como células que expressam LNCaP MT1-MMP, mostrou aumento do número de células invadidas em comparação com células de controlo do vector de LNCaP. Barra de escala = 50 uM.
De forma a evitar estes obstáculos, o método esferóide de várias células [20] foi introduzido, o que tem sido reconhecido como tendo potencial para ser utilizado como um ensaio de invasão HT. No entanto, como demonstrado através da utilização de SK-3
células RD cultivadas sob condições hipóxicas, que é conhecido por aumentar o tráfico de MT1-MMP na superfície celular [22], a formação de esferóides até ao ponto final de avaliação de invasão requer cultura de longo vezes, tendo geralmente 6 a 12 dias, e carece de uniformidade de tamanho (Figura 1A-b). Para evitar a variação de tamanho, pérolas microtransportadoras vidro com tamanhos idênticos podem ser utilizados como suportes para a formação de esferóides [24], como mostrado na Figura 1A-C, utilizando células que expressam LNCaP MT1-GFP. No entanto, a localização das pérolas contendo células após a transferência para uma matriz não pode ser tornada uniforme. Embora estes ensaios podem ser utilizados para a invasão de células de câncer de monitoramento, tempos de longo prazo e uma falta de padronização e automatizado capacidades de leitura dificultar a sua utilização como ferramentas de triagem HT.
Criação de uma Quantitative 3-D ensaio de invasão de Avaliação Cancer celular Invasion
Reconhecendo a necessidade de um ensaio HT 3-D que testa a capacidade invasiva de células com um tempo mais rápido de execução, foi desenvolvido um ensaio de invasão 3-D baseada gel de colágeno rápido. Para demonstrar a capacidade do nosso ensaio para detectar diferenças na capacidade invasiva de vários tipos de células cancerosas, linhas celulares de cancro de próstata humana em níveis variáveis de agressividade, incluindo androgénio independentes (DU145 e PC3) e linhas de células dependentes (LNCaP), bem como MT1 -MMP expressando células LNCaP, foram examinadas. As células cancerosas indicados foram combinadas com o tipo nativo neutralizado I colágeno, pontilhada para o centro de cada poço de uma placa de 96 poços, e deixou-se solidificar, em última análise, formando uma célula-colagénio pontos /hemisfério com um limite distinto e forma. Seguindo a solidificação, os hemisférios células-colagénio foram embutidos dentro de uma camada de cobertura do tipo neutralizado I colágeno e deixou-se solidificar. Os meios foram então adicionados a cada poço e as células foram deixadas a invadir no interior da matriz circundante durante 18 horas. Como mostrado na Figura 1B, as células DU145 e PC3 metastáticos mostrou aumento do número de células invasivas salientes para além do limite de células-colagénio original, enquanto que as células LNCaP que expressam ADNc de controlo de vector não conseguiu exibir invasão celular. Além disso, o efeito da expressão de MT1-MMP na invasão celular foi facilmente determinada por um aumento no número de células invadidas em MT1-MMP que expressam células LNCaP, em comparação com células de controlo do vector (Fig 1Ba . B).
De forma a comparar directamente o nosso ensaio de invasão 3-D inovadora para a 3-D ensaio de dispersão de células actualmente utilizado, o efeito inibidor do inibidor tecidual da metaloproteinase-2 (TIMP-2, um inibidor endógeno de MT1- MMP) [25] e o anticorpo anti-PEX (dirigido contra o domínio hemopexina MT1-MMP) [26] sobre MT1-GFP invasão de células LNCaP induzida foram testados. Para o ensaio de invasão 3-D novo, as células foram criadas tal como descrito para a Figura 1B com a adição quer de TIMP-2 ou o anticorpo anti-PEX para o meio de cultura celular. A quantificação de células invadidas revelou 61% e 76% de redução de MT1-GFP invasão celular induzida por TIMP-2 e o anticorpo anti-PEX, respectivamente (Figura 2A). O ensaio de dispersão de células de 3-D, mostrado na Figura 2B, demonstra qualitativamente a inibição da invasão de células de MT1-GFP induzida por meio do tratamento com qualquer um dos anticorpos de TIMP-2 ou o anticorpo anti-PEX. Esta comparação indica que, embora estes ensaios de dispersão fornecer dados qualitativos claros, demonstrando invasão de células de cancro, eles não são adequados para programas de descoberta de drogas que requerem HT resultados quantitativos, que o nosso ensaio pode fornecer
A B) Comparação do novo ensaio de invasão 3-D e 3-D ensaio de dispersão de células: O efeito de IgG de controlo (coelho, 10 ug /ml), inibidor de tecido da metaloproteinase-2 (TIMP-2) (10 nM), ou anticorpo de domínio anti-MT1-MMP-hemopexina (anti-PEX Ab) (10 ug /ml) na invasão de células de LNCaP induzida por MT1-GFP foi avaliada através do ensaio de 3-D invasão (a) e ensaio de dispersão de células a 3-D ( B). Um padrão de crescimento invasivo foi fotografado no dia 1 (A) e no dia 6 (B), respectivamente. TIMP-2 e do anti-PEX Ab diminuiu a dispersão a capacidade das células invasivo /de MT1-GFP células que expressam. Barra de escala = 20 mm. C) a inibição dose-dependente de cancro da mama humano MDA-MB-231 de células por anticorpos anti-integrina β1: MDA-MB-231 a invasão de células foi examinada utilizando o ensaio de invasão 3-D na presença do anticorpo anti-integrina β1 em diferentes concentrações contra IgG de controlo. células invadidas foram examinados microscopicamente (painel da esquerda) e contadas (painel da direita). As barras representam a média + DP.
Para determinar a eficácia do nosso ensaio, um ensaio de resposta à dose foi realizada utilizando MDA-MB-231, uma linha celular de cancro da mama invasivo, e um anticorpo anti-integrina β1, que é conhecido por inibir migração de células, um passo chave para a invasão de células de cancro. A inibição dependente da dose da invasão de células MDA-MB-231 após tratamento com o anticorpo anti-integrina β1 foi facilmente quantificada (Figura 2C). Colectivamente, estes dados demonstram a capacidade do ensaio de invasão 3-D novo para facilmente, de forma eficaz, e avaliar quantitativamente o fenótipo invasivo de várias células de cancro, bem como os efeitos das drogas na capacidade de invasão.
Padronização da Desenvolvido invasão Ensaio
Como demonstrado, os obstáculos mais comuns no desenvolvimento de telas HT 3-D são a padronização e leitura automatizada. Embora nosso ensaio é simples e rápido, a homogeneidade tamanho e posicionamento do hemisfério células-colagénio criar um obstáculo para esses critérios. A fim de padronizar e permitir a automatização, uma placa de 96 poços trabalhada com um poço 2 mm de diâmetro (4.18 mm
3) no centro de cada poço foi concebido (Figura 3A). O poço é de tamanho uniforme e localização dentro de cada poço, permitindo a padronização do ensaio de invasão 3-D e leitura automatizada controlada pelo Elements NIS (Nikon) software de imagem junto com um palco motorizado.
A) Diagrama esquemático (painel superior) do ensaio de invasão 3-D com a placa utilizado ferramentas: (a) a mistura de células-colagénio é pontilhada para os 2 mm de poços de diâmetro no centro de cada poço da placa de 96 poços trabalhada, criar esferas que ocupam um volume de 4,18 milímetros
3; (B) salientes hemisférios células-colagénio são cobertos com colágeno; (C) meio contendo compostos é adicionado e a placa é incubada durante 18 horas; e (d) células invadidas além poço limite são contadas. Os pontos pretos representam células. Diagrama sem escala. Uma imagem de uma secção de uma placa trabalhada com uma cova no centro de cada poço é mostrado (painel inferior). B) Inibição da contracção do colagénio através de dextrano dialdeído: células HT1080 foram misturadas com colagénio com ou sem a adição de dextrano dialdeído antes da sobreposição com colagénio. imagens de contraste de fagos foram tomadas no tempo 0 e 18 horas (painel esquerdo, Barra de escala = 250 pm) e 18 horas na placa trabalhada (painel da direita, Barra de escala = 100 pm). As setas vermelhas indicam a borda dos pits. pontas de seta vermelha indica a borda das esferas de células-colagénio. C) O contraste de fase e imagens fluorescentes das células HT1080 invadidos na placa trabalhada corados com Hoechst corante. Barra de escala = 100 pm. D) quantificação automatizada: Ambos contraste de fase e imagens fluorescentes (a b) de células HT1080 seguintes invasão foram adquiridas usando uma Nikon TE da década de 2000 controladas pelo software de imagem NIS Elements. Um limiar da imagem de contraste de fase do primeiro poço foi ajustado com base no contraste para criar duas camadas, uma binários no interior do poço (realçado a preto) e um lado de fora do poço (em destaque na rosa) (C). A camada exterior binário poço (área de rosa), a foi copiado para formar uma região de interesse (ROI), o qual foi, em seguida, aplicado à imagem Hoechst (d). As células invadidas dentro da ROI foram então contados automaticamente com as células contadas aparecer uma coloração púrpura (e).
de uma limitação comum o uso de um gel à base de colagénio para a cultura de células em 3-D é contracção devida à remodelação de fibrilas de colagénio por vários tipos de células [27,28] que altera o tamanho global do o gel de células-colagénio. Para demonstrar isto, fibrossarcoma humano HT1080 hemisférios de células-colagénio foram fotografadas no tempo 0 e 18 horas. Os hemisférios de células-colagénio contraído, diminuindo significativamente o diâmetro de 0 a 18 horas e, portanto, impedindo uma quantificação precisa de invasão de células para além do parâmetro do poço (Figura 3B, painel superior). Para ultrapassar esta situação, a adição de dextrano dialdeído, que tem a capacidade para reticular o colagénio [29], foi avaliada. dextrano dialdeído foi misturado com a mistura de células-colagénio HT1080 antes salpicando em cada poço. Tal como mostrado na Figura 3B (painel inferior), a adição de dextrano dialdeído inibiu significativamente a contracção do colagénio e mantido o tamanho original e os hemisférios limite de células-colagénio. Não se observou qualquer efeito inibidor na invasão de células de cancro.
Para determinar se esse design inovador é capaz de leitura automatizada, uma combinação da placa trabalhada invasão, um estágio microscópico automatizado (Prior Scientific, Inc.), e software de imagem (Nikon, NIS-Elements) foi utilizada . Após 18 horas de incubação, as células HT1080 foram coradas com o corante Hoechst coloração nuclear seguido de aquisição de imagem. Ambos contraste de fase e coraram-nucleares de células HT1080 imagens foram tiradas para cada poço; uma imagem representativa é mostrada na Figura 3C. Um limiar da imagem de contraste de fase foi ajustado com base na diferença de contraste entre o interior do poço e fora do poço (área de invasão) para criar camadas binários. A camada binária definida fora da área do poço, em seguida, foi copiado para formar uma região de interesse (ROI), o qual foi, em seguida, aplicado à imagem Hoechst. O número de células dentro da ROI, ou área de invasão, foi então contado automaticamente (passos descritos na Fig. 3DA-E). Usando a Nikon 10x (0.25 NA) e uma lente objectiva platina motorizada instalado num microscópio Nikon TE2000s invertido, o varrimento de toda uma placa de 96 poços com 4 imagens por poço poderia ser completada dentro de 6 minutos (dados não apresentados). A capacidade de adquirir rapidamente e analisar dados permite a triagem de muitos compostos num curto período de tempo, que é necessário para rastreios HT.
Para determinar a robustez, ou factor Z [30], do nosso ensaio de invasão 3-D, os efeitos de DMSO e o anti-anticorpo de integrina β1 tratamento da invasão de células DU145 ou MT1-GFP expressando células LNCaP foram testadas. O factor de Z foi descrito por Zhang como Z = factor de 1-3xSSD /R (SSD: soma dos desvios padrão; R: valor absoluto da diferença entre controlos positivos e negativos), com um valor do factor de Z entre 0,5 e 1,0, indicando que o ensaio é fiável [30]. Os dados recolhidos em 5 dias diferentes foram analisados utilizando a equação de factor de Z (dados não mostrados). Um factor-Z de 0,65 e 0,72 de células DU145 e células LNCaP que expressam MT1-GFP, indicando, respectivamente, foi calculado que o nosso ensaio de invasão 3-D satisfaz os critérios de um excelente ensaio de rastreio para HT. Em conjunto, estes dados demonstram a capacidade do nosso ensaio de invasão 3-D a ser utilizado como uma ferramenta de rastreio de drogas anti-HT invasiva.
determinação simultânea de compostos que inibe a invasão celular do cancro daqueles que são citotóxicos
a capacidade para segregar entre os compostos que inibem a invasão de células de cancro e os que induzem a morte celular com a tela inicial iria contornar a necessidade de um ecrã secundário de citotoxicidade, reduzindo o custo e aumentando a eficiência global. Por co-coloração os hemisférios de células-colagénio com Hoechst e iodeto de propídio (PI), o número total de células invadidas e o efeito citotóxico do fármaco pode ser determinada simultaneamente. Para avaliar esta abordagem, as células HT1080 que expressam ADNc de GFP foram tratadas com DMSO, o anticorpo anti-integrina β1, estaurosporina (STS), um inibidor de quinase conhecida por induzir a apoptose [31,32], ou o paclitaxel (Taxol), um fármaco quimioterapêutico que estabiliza microtúbulos e inibe a divisão celular, levando à morte celular [33,34]. Após 18 horas, as células HT1080 GFP DMSO tratado mostrou invasão para a matriz de colagénio em torno de coloração com PI mínima, indicativa de baixa citotoxicidade (Figura 4A). Em contraste, as células tratadas com anticorpo anti-integrina β1 havia diminuição da capacidade invasiva, mas um nível semelhante de coloração de PI (Figura 4B). O tratamento com STS causou um aumento significativo na morte de células, como evidenciado por coloração intensa PI, e as células exibido invasão celular ab-rogado (Figura 4C). O taxol, um droga de acção mais lento, causou uma redução significativa na invasão de células com um modesto aumento na morte celular (Figura 4D). Estes dados demonstram a capacidade do ensaio para a segregar as drogas que apenas inibem a invasão de células de drogas que bloqueiam a invasão de células do cancro devido a um efeito citotóxico. células
HT1080 que expressam GFP foram montados no ensaio de invasão 3-D na presença de (A) DMSO, (B), anticorpo anti-integrina β1 (5 ug /ml), (C) estaurosporina (STS) (500 nM), ou (D) paclitaxel (Taxol, 1 uM) durante 18 horas. As células foram coradas com Hoechst e iodeto de propídio (PI) por 30 minutos, seguida por exame microscópico. Diminuição da invasão de células é observada após tratamento com anticorpo anti-integrina β1, STS, e o taxol. No entanto, STS e o taxol apresentam níveis mais elevados de coloração de PI, indicativas de morte celular aumentada. Números nos cantos superiores direito representam o número total de células invasoras (imagens Hoechst) ou células que morreram depois de invadir (imagens PI) dentro do campo. Barra de escala = 100 mm.
Validação da Capacidade HT do 3-D Invasion Ensaio
Como prova de princípio, a biblioteca de compostos Instituto Nacional do Câncer Diversidade Set II, contendo 1974 compostos estruturalmente diversos, foi rastreada utilizando linha celular de cancro da mama MDA-MB-231. Os compostos foram adicionados às cavidades numa concentração final de 10 uM. DMSO, que é o veículo, e o anticorpo anti-integrina β1 foram utilizados como controlos negativos e positivos, respectivamente. visitas positivas foram determinadas com base num limiar de 50% de inibição da invasão. Com base nisso, 24 resultados positivos foram encontrados, nove das quais foram confirmadas como sendo 25% citotóxica através de um ensaio MTT (Figura 5A e dados não mostrados). Um destes sucessos foi um composto anti-migratório conhecido, o análogo quinocarmycin DX-52-1 [35], proporcionando mais provas de que o nosso ensaio pode identificar com êxito compostos capazes de inibir a invasão de células de cancro (Figura 5B).
A) O NCI Diversidade Conjunto II Composto biblioteca foi testada usando o ensaio de invasão 3-D e células MDA-MB-231, resultando em 24 resultados positivos, 9 dos quais eram inibidores mas não citotóxico. B) Um quinocarmycin analógico, DX-52-1 foi positivamente identificado como um composto anti-invasiva. Imagens representativas são mostradas para controlo de DMSO e DX-52-1 (10 uM) após 18 horas de incubação. invasão celular ab-rogado e baixa citotoxicidade foram observadas em células tratadas com DX-52-1. Números nos cantos superiores direito representam o número total de células invasoras dentro do campo. Barra de escala = 100 pm. migração câmara C) Transwell foi realizada com células MDA-MB-231 tratadas com DMSO ou DX-52-1 durante 18 horas. Imagens representativas de membranas (8 um de tamanho de poro) são mostrados no painel esquerdo. A quantificação da migração das células é mostrada no painel direito. DX-52-1 células tratadas tinham menor capacidade migratória. As barras representam a média + DP. D) de detecção do ensaio fluorescente de protease (Sigma) realizada com lisados celulares de MDA MB-231 tratadas com DMSO ou DX-52-1 durante 18 horas. Não se observou qualquer efeito na actividade proteolítica sobre o tratamento com DX-52-1. As barras representam a média + DP. ** Refere-se a
p Art 0,01.
Devido ao facto de a meta de identificação é útil para prever os efeitos secundários e optimizar os candidatos de chumbo, é importante dispor de ensaios a jusante que podem ajudar a elucidar o possível mecanismo (s) de acção dos resultados positivos . Desde a invasão requer atividades tanto migratórias e proteolíticas, o próximo passo vital é distinguir entre essas duas propriedades celulares. Utilizando-DX 52-1 como um exemplo, utilizou-se o ensaio de migração câmara convencional Transwell e um ensaio de protease não específica (Sigma). Como mostrado na Figura 5C D, DX-52-1 revogada significativamente a migração de células MDA-MB-231, mas não teve nenhum efeito significativo nas actividades da protease. Estes dados indicam que a inibição do comportamento invasivo das células MDA-MB-231 por DX-52-1 é devida a uma redução da capacidade migratória, que é suportada por relatórios anteriormente publicados [35].