Abstract

Compreender as bases moleculares de chemoresistance é vital para projetar terapias para restaurar chemosensitivity . Em particular, metadherin (MTDH) foi demonstrada ter um papel crítico na quimiorresistência. Sobre-expressão de MTDH correlaciona-se com mau resultado clínico em câncer de mama, neuroblastoma, carcinoma hepatocelular e câncer de próstata. MTDH também é altamente expresso em cancros do endométrio avançada, uma doença para a qual são urgentemente necessárias novas terapias. No presente estudo, enfocamos o benefício terapêutico do esgotamento MTDH em células de cancro do endométrio para restaurar a sensibilidade à morte celular. As células foram tratadas com uma combinação de factor de necrose tumoral-α relacionada ligando indutor de apoptose (TRAIL), que promove a morte das células malignas do tracto reprodutor humana e histona desacetilase inibidores (HDAC), que foram mostrados para aumentar a sensibilidade apoptose de células cancerosas para TRAIL-induzida. Os nossos dados indicam que a depleção de MTDH em células de cancro do endométrio resultou na sensibilização de células que eram previamente resistentes em resposta ao tratamento com TRAIL combinatória e o inibidor de HDAC LBH589. MTDH knockdown reduzida a proporção de células em S e aumentou prisão celular em G2 /M, em células tratadas com LBH589 sozinho ou em combinação com LBH589 TRAIL, o que sugere que as funções MTDH ao ponto de controlo do ciclo celular para realizar a resistência. Usando a tecnologia de microarray, foram identificados 57 genes alvo a jusante de MTDH, incluindo calbindina 1 e galectina-1, o que pode contribuir para a resistência à terapêutica mediada por MTDH. Por outro lado, em células MTDH empobrecido, a inibição da fosforilação de AKT PDK1 e, juntamente com o aumento da expressão de XIAP e degradação Bim correlacionados com sensibilidade aumentada à morte celular em resposta a TRAIL e LBH589. Estes resultados indicam que a segmentação ou esgotar MTDH é uma avenida potencialmente nova para reverter a resistência à terapêutica em pacientes com câncer endometrial

Citation:. Meng X, Brachova P, Yang S, Xiong Z, Zhang Y, Thiel KW, et ai. (2011) Knockdown de MTDH sensibiliza células de câncer endometrial to Cell indução de morte por morte receptor do ligando TRAIL e HDAC Inibidor LBH589 co-tratamento. PLoS ONE 6 (6): e20920. doi: 10.1371 /journal.pone.0020920

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2010; Aceito: 16 de maio de 2011; Publicação: 08 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grant R01CA99908 para KKL, e em parte pelo Departamento de Obstetrícia e Ginecologia Fundo de Desenvolvimento Research, a pesquisa Institutional Grant Número IRG-77-004-31 da American Cancer Society para XM, administrada através do Centro de Câncer Holden Comprehensive na Universidade de Iowa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

um problema comum com a terapia do cancro é o desenvolvimento de resistência, e uma melhor compreensão dos percursos subjacentes envolvidos com resistência à droga pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias para superar essa resistência. Um gene recentemente descoberto, metadherin (MTDH, também conhecido como AEG-1 ou LYRIC) surgiu como um mediador potencialmente importante da progressão do tumor, metástase, e resistência a quimioterapias [1], [2], [3], [4] . MTDH é proposto para promover a progressão do tumor através da integração de múltiplas vias de sinalização, incluindo ras, myc, Wnt, PI3K /Akt e NF-kB em vários tipos de células cancerosas [4], [5], [6], [7] , embora o mecanismo pelo qual MTDH controla estes eventos de sinalização não é clara. Neste estudo, nós investigamos o papel de MTDH no câncer de endométrio e sua inibição como um mecanismo para superar a resistência aos medicamentos.

O interesse inicial em MTDH como factor de chemoresistance surgiu como consequência da NCI60 dados farmacogenómicas, que encontrou que o número de cópias do ganho de genômica em 8q22 é um evento decisivo na chemoresistance [8]. Um estudo anterior relatou que metástase ganglionar está significativamente associado com número de ganhos de cópia no 8q22-q23 em cancros do endométrio [9]. Até agora, MTDH é o único gene conhecido em 8q22 que tem sido demonstrado que se correlacionam com os resultados clínicos pobres em pacientes com tumores sólidos [8].

In vitro

e

in vivo

chemoresistance análises confirmaram que MTDH knockdown sensibiliza vários tipos de tumores – incluindo o cancro da mama, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata, e neuroblastoma- a múltiplos agentes de quimioterapia, tais como 5- fluorouracilo (5-FU), cisplatina, paclitaxel, doxorrubicina e [1], [10], [11]. No entanto, a capacidade de knockdown MTDH para sensibilizar células para terapias específicas, que têm vindo a simbolizar o futuro da terapêutica do câncer, ainda não foi explorada.

Relacionados com -α

fator de necrose tumoral (TNF) apoptose indutores ligante (TRAIL), recentemente surgiu como uma estratégia terapêutica alvo promissor em diversos tipos de câncer devido às suas características pró-apoptóticos [12], [13]. Como um membro da família de TNF, TRAIL activa especificamente vias apoptóticas extrínsecos em células cancerígenas ligando-se a receptores de morte. Importante, TRAIL promove selectivamente a apoptose das células tumorais, mas não tem nenhum efeito sobre as células normais do trato reprodutivo humanos incluindo os do endométrio, ovário, colo do útero, trompas de Falópio ou [13]. Algumas células cancerosas são resistentes a apoptose induzida por TRAIL [14], [15], [16], por conseguinte, os regimes combinatórias foram adoptadas para restaurar a sensibilidade [13], [17]. Em diversos estudos, os inibidores da histona-desacetilase (HDAC) têm sido demonstrados para aumentar ainda mais a sensibilidade à morte celular por apoptose induzida por TRAIL [18], [19], [20], [21]. Infelizmente algumas células cancerosas permanecem resistentes a TRAIL combinados e tratamento com inibidor HDAC [22], e novas abordagens para restaurar a sensibilidade a estas terapias específicas são necessárias.

Foi examinado o efeito de esgotar níveis MTDH em restaurar a sensibilidade à TRAIL- com base terapias direcionadas. Os dados aqui relatados demonstram que regula MTDH ciclo celular e sobrevivência celular em resposta ao tratamento com inibidores de HDAC e TRAIL, o que sugere que MTDH é um alvo terapêutico promissor para aumentar a eficácia de TRAIL e inibidor de HDAC tratamento combinatória.

resultados

expressão MTDH é elevada em linhas celulares de cancro do endométrio e tecidos

MTDH foi altamente expressos ao nível da proteína em todas as seis linhas celulares de cancro do endométrio testados (RL95, AN3CA, KLE, Ishikawa, e Hec50co ECC1, Figura 1A). Em tecidos endometriais de doentes do cancro, expressão MTDH foi elevada em comparação com endométrio normal (Figura 1B). Especificamente, a expressão de 80 kDa e MTDH putativos isoformas 50-55 kDa MTDH foram significativamente mais elevadas em amostras de cancro do endométrio, incluindo papilar serosa, sarcoma, e adenocarcinoma, enquanto MTDH não foi detectada em tecidos endometriais normais (Figura 1B). Uma vez que não foi detectada em MTDH tecido endometrial normal, foi apagado para o LKB1 supressor de tumor como um controlo (Figura 1B). A expressão aumentada de MTDH citoplasmática em adenocarcinoma do endométrio e MTDH nuclear em alguns cancro endometrial metastático foi também observada em tecidos de cancro do endométrio como mostrado na Figura 1C por imuno-histoquímica com um anticorpo específico para MTDH. XIAP e FLIP são duas proteínas pró-sobrevivência associados com a via apoptótica extrínseca induzida pelo receptor de morte [12]. Estudámos, portanto, se existe uma correlação entre a expressão de proteínas pró-sobrevivência XIAP e FLIP com expressão MTDH. Enquanto expressão de MTDH e XIAP não se correlacionou, nós detectar uma correlação com a expressão FLIP (Figura 1B). O aumento da expressão de MTDH em todas as células cancerosas e tecidos examinados sugere que ela pode desempenhar um papel na carcinogénese do endométrio

(A) Expressão de MTDH foi detectada em todas as seis linhas celulares de cancro do endométrio testados:. RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H (Ishi), a KLE e Hec50 células. (B) Expressão de MTDH foi detectado em tecidos do endométrio a partir de dois indivíduos normais, pacientes com quatro papilares serosos, três pacientes com adenocarcinoma, e dois doentes com sarcoma do endométrio. A expressão do LKB1 gene supressor de tumor e dois genes anti-apoptóticos, XIAP e FLIP, também foi detectada por transferência Western nas mesmas amostras. (C) a expressão MTDH foi detectada por coloração imuno-histoquímica utilizando o espectro da doença (progressão do cancro endometrial) arranjo de tecido com mais de 50 amostras de tecidos endometriais de benigno a câncer. (I) o tecido endometrial normal, (ii) de baixo grau de adenocarcinoma do endométrio, (iii) adenocarcinoma do endométrio de alto grau, e (iv) metastática do cancro do endométrio para a cavidade abdominal. ampliação original, × 400.

Knockdown de MTDH reduz a formação de colónia

Devido à expressão elevada de MTDH nas várias linhas celulares de cancro do endométrio e amostras de cancro do endométrio humanos, o próximo examinou o potencial tumorigénico do MTDH no Tipo II linha de células de cancro do endométrio Hec50co usando uma RNA curto hairpin (shRNA) específico para MTDH. Uma redução de 3,49 vezes na expressão do gene foi detectado por MTDH quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) em células MTDH Hec50co shRNA-transfectados em comparação com o controlo scrambled shRNA células transfectadas (Tabela S1). Depleção de MTDH diminuiu a formação de colónias de células que expressam de forma estável MTDH shRNA comparação para controlar shRNA (Figura 2A, B). Estes resultados foram confirmados usando três construções shRNA alvo diferentes regiões do MTDH. Um fenótipo semelhante também foi observado em cima knockdown de MTDH em Ishikawa H Tipo I células cancerosas endometrial, indicando que a expressão elevada MTDH é geralmente necessário para a formação de colónias de câncer endometrial.

células Hec50co foram transfectadas com o controle ou vetores de expressão MTDH shRNA . As colónias (A) formados por células Hec50co MTDH shRNA-transfectadas ou de controlo são mostrados após a transfecção de shRNAs e após selecção com 2 ug /ml de puromicina para a 3 semanas. (B) Quantificação da formação de colónias relativa no controle versus células Hec50co MTDH knockdown.

Identificação de genes regulados por MTDH em linhas celulares de cancro endometrial

Para identificar genes a jusante mediando a tumorigênico efeitos de MTDH em linhas celulares de cancro do endométrio, um oligonucleótido micromatriz Affymetrix (matriz gene humano 1,0 ST) foi utilizado para detectar os genes expressos diferencialmente em células Hec50co estavelmente transfectadas quer com MTDH shRNA ou um shRNA controle (dados têm sido depositados em GEO, GSE26134) . Depleção de MTDH por knockdown resultou em pelo menos duas vezes a alteração de 57 genes (Figura 3A) a expressão do gene. Vários destes genes foram escolhidos aleatoriamente para confirmar as mudanças por qRT-PCR (Figura 3B).

(A) mapa de calor de mudança de duas vezes da expressão do gene (tal como determinado a partir dos dados de matriz de Affymetrix) entre o controlo e MTDH knockdown células Hec50co. (B) as mudanças de expressão do gene foram validados por qRT-PCR para os genes indicados identificados no microarray (* p 0,05). (C) A expressão e /ou a fosforilação das proteínas indicadas foram examinados em células que expressam de forma estável, quer Hec50co shRNA controlo ou MTDH shRNA. PDK1 total e β-actina foram utilizados como controlos de carga. (D, E) Expressão de PIP3 foi detectada no controlo (D) ou knockdown MTDH células (E) Hec50co por PIP3 coloração imuno-fluorescente.

de dados a partir da matriz indicada MTDH que regula a expressão de genes envolvido na invasão, junções apertadas, assim como quimiorresistência (Tabela S1 e S2). Por exemplo, a galectina-1 (LGALS1) e calbindina 1 (Calb1) foram células Hec50co acentuadamente regulada para baixo no ARNm (Figura 3B) e os níveis de proteína (Figura 3C) no MTDH shRNA-transfectadas. Calb1 e galectina-1 são dois genes a jusante MTDH putativos que podem regular o metabolismo do fosfatidilinositol, que é parte da via PI3K /AKT de sinalização normalmente regulada positivamente em cancro do endométrio [23]. Também examinamos as mudanças na expressão genética em células de câncer endometrial Ishikawa H em resposta ao silenciamento MTDH e observou alguma sobreposição com genes que estavam alterados em células Hec50co (Tabela S3 e S4).

A seguir, buscou compreender como MTDH regula a via PI3K /Akt. A expressão de galectina-1 é sobre-regulada em diversos tipos de tumores e é relatado para mediar a invasão tumoral e metástases por aumento da expressão da metaloproteinase de matriz MMP-9 e MMP-2 e promover a reorganização do citoesqueleto de actina [24]. Consistente com um estudo anterior em que a sobre-expressão de MTDH promove a activação da via PI3K /AKT em neuroblastoma [7], foi detectada uma inibição dos componentes da via de sinalização /AKT de PI3K em células Hec50co com MTDH empobrecido em comparação com o controlo (Figura 3C) . Especificamente, uma redução dramática na PDK1 fosforilação em S241 e fosforilação de AKT em ambos T308 e S473 ocorreu em células MTDH knockdown, embora nenhuma alteração significativa no nível da proteína total foi detectada PDK1 (Figura 3C). Além disso, como mostrado na Figura 3D e E, uma redução dramática no nível de PIP3 foi detectada em células Hec50co com MTDH shRNA, em comparação com células de controlo com shRNA. Estes resultados demonstram que MTDH pode ativar as vias pró-sobrevivência de PI3K /AKT via aumento da regulação do PIP3.

knockdown MTDH sensibiliza células para terapias direcionadas

Para superar a resistência às terapias, HDAC inibidores tais como LBH589 têm sido usados ​​para restaurar a apoptose induzida por TRAIL em vários tipos de cancros [18], [19]. Hec50co células foram previamente mostrado ser resistentes a apoptose mediada por TRAIL [13]. Por conseguinte, para testar a influência de MTDH na sensibilidade à TRAIL nestas células, que trataram células Hec50co com ou sem MTDH (controlo vs knockdown MTDH) combinado com TRAIL e tratamento LBH589 durante três dias e, em seguida, examinou a viabilidade celular. Comparado com shRNA mexidos células Hec50co transfectadas, knockdown MTDH estável moderadamente aumentado a sensibilidade das células Hec50co à terapia agente único (ou LBH589 ou TRAIL sozinho, Figura 4A, B). No entanto, como mostrado na Figura 4B, uma indução mais dramática ocorreu em sensibilidade de MTDH estável células Hec50co knockdown com a combinação de LBH589 e TRAIL. Estes dados sugerem que a expressão MTDH é um factor importante subjacente resistência ao regime combinado.

(A) indução de morte celular por LBH589 como um agente único, foi detectada em células de controlo Hec50co knockdown ou MTDH. Após 3 dias, a morte celular foi determinada pelo método WST-1. (B) A morte celular resultante de diferentes concentrações de TRAIL (5 a 50 ng /ml) sozinhos ou em combinação com 5 nM LBH589 foi analisada no controlo ou MTDH knockdown células Hec50co.

reguladores envolvidos na apoptose mediada por MTDH morte celular

Para estudar o mecanismo molecular da morte celular em células MTDH knockdown, a expressão de proteínas associadas com a apoptose (ambos os factores pró-apoptóticos e anti) foram testados em células de controlo e MTDH knockdown após única tratamento (LBH589 ou TRAIL) ou após o tratamento combinado (LBH589 e TRAIL). O tratamento de combinação não aumentou a expressão dos receptores de TRAIL e DR5 DR4. Além disso, não houve alterações na expressão de genes anti-apoptóticos Bcl-XL, MCL-1, ou FLIP no controle MTDH e células Hec50co knockdown após o tratamento combinatória (Figura 5).

Controle ou MTDH knockdown Hec50co as células foram tratadas durante 24 horas com veículo de controlo, 20 nM LBH589, 25 ng /ml de TRAIL ou TRAIL LBH589 e nas concentrações anotadas. Os lisados ​​foram recolhidos. Expressão de DR4, DR5, e relacionadas a apoptose caspase-3, caspase-8, PARP-1, BID, FLIP, XIAP, Bim, MCL-1 e BCL-XL foi analisada por Western blot.

Curiosamente, o pró-apoptótica de BH3-Bim única proteína foi regulada em células não tratadas MTDH Hec50co knockdown em comparação com células de controlo (Figura 5), ​​o que indica que a depleção de MTDH sozinhos pode levar à indução de factores pró-apoptóticos. Quando as células Hec50co de controlo foram tratados com isoladamente ou em combinação com TRAIL LBH589, expressão de Bim aumentada. Em contraste, a expressão de Bim foi significativamente reforçada em MTDH knockdown células Hec50co sem qualquer tratamento, enquanto que o tratamento com qualquer um LBH589 ou TRAIL melhorada ainda mais a expressão do BIM. No entanto, a expressão Bim foi ligeiramente reduzida em células MTDH knockdown após co-tratamento com LBH589 e TRAIL.

Nas células de controlo, modificações pós-translacionais de XIAP ocorreu após tratamento com LBH589, como demonstrado por uma espécie mais elevada migração, e redução de ambos total e modificado XIAP foi detectado apenas com LBH589 TRAIL e tratamento de combinação (Figura 5). Este efeito foi acentuado quando MTDH foi derrubado, de tal forma que nós detectamos uma redução maior no XIAP modificação pós-tradução em MTDH knockdown células Hec50co em comparação com células de controlo após LBH589 e tratamento TRAIL. Além disso, a indução significativa de clivagem de caspase-8, caspase-3 e PARP-1 foi detectado após um único tratamento com TRAIL ou LBH589, ou a combinação em MTDH knockdown células Hec50co em comparação com células de controlo. Também foi observada redução do Bid em células MTDH knockdown tratados com a combinação de LBH589 e TRAIL. Colectivamente, estes dados demonstram que knockdown de MTDH pode aumentar a apoptose induzida por TRAIL extrínseca e LBH589, e o principal mecanismo é através de aumento da regulação do Bim. Down-regulação do XIAP e subsequente activação de caspase-8 e caspase-3, bem como substratos a jusante, como PARP-1 também ocorre.

regulação checkpoint do ciclo celular por MTDH

A fim de determinar o mecanismo preciso pelo qual MTDH confere resistência a TRAIL e tratamento LBH589, nós próxima investigou o papel da MTDH no controle do ciclo celular. De controlo e MTDH knockdown células Hec50co que não foram tratados ou tratados com TRAIL sozinho tinham perfis semelhantes do ciclo celular (Figura 6A). Em contraste, o tratamento com o inibidor de HDAC em LBH589 células sem MTDH resultou numa maior proporção de células persistentemente na fase G2 /M. Quando as células knockdown Hec50co MTDH foram tratados com tanto LBH589 e TRAIL, uma proporção menor de células estavam em fase S e um aumento da proporção de células foram presos em G2 /M (Fig. 6A). Estes dados mostram que MTDH tem um papel significativo na regulação do checkpoint do ciclo celular no contexto de TRAIL combinatória e tratamento com inibidor de HDAC.

perfis do ciclo celular (A) foram determinados no controlo ou MTDH knockdown células às 24 horas Hec50co após o tratamento com 20 nM LBH589, 25 ng TRAIL /ml, ou LBH589 e TRAIL em combinação. A percentagem de células em G1, foram determinadas fases S e G2 /M. (B) A mudança de Aurora A, Aurora B, p21, acetilação da histona H3 em lisina 9, histona H3 fosforilação em serina 10 e H3 total de histona foi avaliada por transferência de Western após 24 horas de tratamento com os reagentes indicados. H3 histona total foi utilizado como um controlo de carga. (C) Um modelo para o mecanismo elucidado pelo qual knockdown de MTDH aumenta a morte celular por TRAIL eo LBH589 inibidor HDAC. MTDH knockdown diminui a fosforilação de PDK1 e AKT seu substrato, o que resulta em aumento da expressão da proteína pró-apoptótica BIM. expressão de XIAP é regulada negativamente em resposta à LBH589 combinadas e tratamento TRAIL, libertando assim a inibição mediada XIAP de caspase-3 e -8 activação. Colectivamente, a regulação destas vias promove a morte celular por apoptose.

Para investigar o mecanismo pelo qual MTDH regula o ciclo celular, expressão de reguladores do ciclo celular foi medido. Aumento de Aurora A, no nível de proteína foi observada em células MTDH knockdown, em comparação com células de controlo (Figura 6B). Quando MTDH knockdown células Hec50co controlo e foram expostos a LBH589, houve um aumento da Aurora A, Aurora B, a acetilação de histona H3 em lisina 9, fosforilação de histona H3 na serina 10, e independente de p53 sobre-regulação de p21 WAF1, o inibidor de cinases dependentes de ciclina (Figura 6B). Curiosamente, o tratamento com TRAIL resultou num decréscimo substancial na fosforilação da histona H3, o que correspondeu a uma diminuição na percentagem de células na fase G2 /M, em comparação com células não tratadas. Globalmente, estes dados implicam um novo papel para MTDH na regulação pontos de verificação do ciclo celular.

Discussão

Embora MTDH tem sido associada tanto à metástase e resistência à quimioterapia em vários tipos de cancros [1], [ ,,,0],25], o mecanismo de função biológica e de MTDH é em grande parte desconhecida. Depleção de MTDH pode aumentar os efeitos de agentes quimioterapêuticos tais como doxorrubicina, paclitaxel e 5-FU [10], [11]. Aqui nós relatamos que a expressão de MTDH é altamente elevados em tecidos câncer de endométrio em comparação com endométrio normal. Nossos dados demonstram que a depleção de MTDH com um shRNA específica também pode aumentar a sensibilidade celular à terapias específicas, incluindo a LBH589 inibidor HDAC, TRAIL e um regime de combinação com ambos os agentes. Como representado na Figura 6C, identificámos o mecanismo potencial pelo qual knockdown de MTDH aumenta a morte celular em resposta ao tratamento com TRAIL e o inibidor de HDAC LBH589. Especificamente, as células sem MTDH diminuiu a fosforilação de PDK1 e AKT seu substrato, o que por sua vez estimula a expressão da proteína pró-apoptótica BIM. LBH589 e tratamento TRAIL combinado resulta numa regulação negativa de XIAP, permitindo, assim, a activação de caspase-3 e -8. Estas alterações moleculares resultar em morte celular por apoptose em células sem MTDH. Nossos dados sugerem, portanto, que a resistência mediada por MTDH ocorre através da ativação de pró-sobrevivência vias de sinalização e, potencialmente, pela regulação aberrante de postos de controle do ciclo celular.

Usando uma abordagem de microarray, foram identificados vários genes candidatos que são regulados diferencialmente em células falta (MTDH shRNA) ou expressando (controle shRNA) MTDH. De particular interesse foram calbindina 1 (CALB1) e galectina-1, duas proteínas que tenham sido previamente ligados a vias de sinalização pró-sobrevivência. CALB1 é uma proteína de ligação ao cálcio com quatro domínios de ligação do cálcio activa. CALB1 foi relatado para interagir com monofosfatase de mio-inositol (Impa) usando exibição em fagos e para induzir a actividade Impa até 250 vezes [26], [27]. Impa é uma enzima que desfosforila monofosfato de mio-inositol, mio-inositol-1,3-difosfato, e mio-inositol-1,4-difosfato de gerar livre mio-inositol, que desempenha um papel importante na morte celular programada [28]. A galectina-1, uma proteína de ligação de beta-galactosidase, é fortemente expresso numa variedade de cancros humanos e foi mostrado desempenhar um papel na sinalização de PI3K e activação de Akt [29]. Em células de glioblastoma, knockdown de galectina-1 prejudica a capacidade de estimulação insulin-like growth factor (IGF1) para elevar os níveis PIP3 celulares (Perry et al., 2010, AACR 101

st abstrato reunião anual 301). Os nossos dados indicam que MTDH mediada por sobre-regulação de galectina-1 e CALB1 pode ser o mecanismo pelo qual MTDH estimula um aumento nos níveis de PIP3, activando assim a via de PI3K /AKT /mTOR. Esta via desempenha um papel importante na carcinogénese do endométrio, ou pela mutação de PTEN ou por outros mecanismos, a activação constitutiva é a regra. A nossa identificação da expressão excessiva de MTDH que conduz ao aumento dos níveis PIP3 fornece ainda outra explicação possível para a elevada actividade de PI3K e AKT frequentemente encontrados nos cancros do endométrio.

Inibição da MTDH foi mostrada para aumentar a morte celular induzida pela LBH589 e tratamento de combinação TRAIL (Figura 4). TRAIL pode induzir a apoptose extrínseca via directa ligação com receptores de morte. No entanto, enquanto TRAIL podem induzir selectivamente a apoptose em células de cancro do endométrio, não pode induzir a apoptose em tecidos endometriais normais com a mesma concentração. Além disso, a concentração de TRAIL (200 ng /ml) necessária para induzir apoptose em células de cancro do endométrio é muito maior do que aquela previamente usada para células de outros tumores sólidos (por exemplo, 25-50 ng /mL no cancro pancreático) [13], [ ,,,0],30]. Isso indica potencial de resistência de base para TRAIL no câncer de endométrio, que poderia estar ligado a expressão alta MTDH. Para vencer a resistência, vários agentes quimioterapêuticos ou inibidores segmentados que têm sido relatados para aumentar a sensibilidade à apoptose induzida por TRAIL têm sido utilizados em regimes combinatórias [12]. Aqui demonstramos que o LBH589 inibidor HDAC pode aumentar caspase-8 activação mediada por TRAIL e subsequente morte celular extrínseca em células de câncer de endométrio. Knockdown de MTDH pode estimular ainda mais clivagem de caspase-8 induzida por LBH589, TRAIL, ou a combinação dos dois. Um aumento na XIAP modificação pós-tradução, uma redução no total de XIAP, e a indução do gene de pró-Bim apoptose foi observada nas células tratadas só com o LBH589. Perda de Bid foi observado em células knockdown MTDH após o tratamento LBH589 e TRAIL combinação, o que é provavelmente devido à ativação Bid via clivagem. A descoberta de Bim diminuiu com o mesmo tratamento foi um tanto inesperado. No entanto, os nossos dados na Figura 3 indicam que MTDH knockdown regula negativamente a Akt, que podem inicialmente resultar em elevada expressão de BIM. Medida que as células progridem através de apoptose, proteínas menos estáveis ​​podem ser sujeitos a degradação. Uma vez que as células MTDH knockdown aceleraram a morte celular em resposta ao tratamento de combinação (Figura 4), é possível que a redução na Bim é um reflexo do rápido retorno da proteína.

em resposta ao tratamento LBH589 sozinho ou com TRAIL , os dois efeitos principais de MTDH knockdown no ciclo celular foram uma diminuição na percentagem de células em S e um aumento concomitante na percentagem de células em G2 /M, em que as células parecem ser preso. Ao nível celular, no entanto, knockdown MTDH sozinho na ausência de terapia não afectou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular canónica. Por exemplo, LBH589 melhorada significativamente histona H3 acetilação em lisina 9 (Figura 6B) que pode permitir que a activação da transcrição do gene p21 [31]. No entanto, a modificação H3 não foi afetada pela shRNA knockdown de MTDH. degradação mediada por proteassoma de Aurora A, Aurora B e C-FLIP foi relatado para ser responsável pelo aumento na sensibilidade a TRAIL por tratamento com inibidor de HDAC em algumas células cancerosas [15], [32]. No entanto, não houve mudanças significativas em Aurora A e níveis B ou c-FLIP foram observadas em células de câncer de endométrio tratados com LBH589 em nossos estudos.

Este é o primeiro relatório sobre o impacto do MTDH sobre a resistência em terapia direcionada para o câncer endometrial . Para estes estudos, optamos pela combinação de LBH589 e TRAIL por causa do impacto desses agentes nas vias pró-apoptóticos. Nós demonstramos aqui que knockdown de MTDH sensibiliza as células para a morte programada das células através de um mecanismo que envolve a inibição de PDK1 e Akt fosforilação, aumento Bim, e redução de XIAP. Portanto, podemos direcionar MTDH para aumentar a sensibilidade, não só para quimioterapia, mas também agentes direcionados que funcionam através da morte celular programada. Estes dados fornecem evidências convincentes de que, por downregulating MTDH no câncer de endométrio, podemos ampliar as vias pró-apoptóticos e resposta à terapia.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

endometrial normal tecidos e tecidos endometriais de câncer de endométrio foram coletadas com o consentimento dos pacientes sob a Universidade de Iowa institucionais Review Boards protocolo aprovado. Obtivemos o consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos neste estudo.

linhas celulares e Cultura celular

linhas celulares de cancro do endométrio Humanos Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H, e KLE foram mantidas tal como descrito anteriormente [33]. As células foram cultivadas em meio DMEM contendo soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina (todos da Gibco BRL, Carlsbad, CA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar. Para gerar um modelo de knockdown MTDH, células Hec50co foram transfectadas com ARN MTDH SH ou o controlo não-silenciamento shRNA construções de acordo com as instruções do fabricante (Origene, Rockville, MD). clones de células individuais resistentes a puromicina foram expandidas e submetidos a triagem para a expressão MTDH por transferência de Western.

endometriais tecidos e disposições do tecido

tecidos endometriais normais e tecidos endometriais de câncer de endométrio foram coletadas pela Universidade de Iowa Hospitais e Clínicas. A matriz de tecido espectro da doença endometrial (progressão do cancro endometrial) (UT 801) foi comprado de US Biomax, Inc. (Rockville, MD).

Os reagentes, anticorpos e Western Blotting

TRAIL recombinante humana (apoptose induzindo o ligando relacionado com TNF) foi adquirido a R D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). LBH589 foi comprado de Selleck (Houston, TX). Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-MTDH e anticorpos anti-β-actina foram da Sigma (St Louis, MO, EUA); e anti-caspase-3, caspase-8, DR4, DR5, Bim, Bid, FLIP, XIAP, p21, PARP-1 p-AKT S473, p-AKT T308, PDK1, p-PDK1 S204, histona 3, p -histone três anticorpos serine10 e histona 3 lisina 9 acetilação foram de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA). Os lisados ​​proteicos de células inteiras foram preparados e analisados ​​por transferência de Western como previamente descrito [34].

Matriz Expressão e Análise de RT-qPCR

O ARN total foi isolado a partir de knockdown MTDH e controlar de células de cancro do endométrio linhas (em triplicado biológicos para controle e células MTDH knockdown) usando o

mir

Vana miRNA kit de isolamento (Ambion, Austin, TX) e cDNA foi gerado usando o High-Capacity cDNA Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Um gene humano gama 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) foi interrogado utilizando os triplicados biológicos no Facility DNA do núcleo da Universidade de Iowa, e Partek Genomics Software Suite (Partek Inc, St. Louis, MO) foi usado para gerar valores de expressão do gene. Todos os dados são Miame complacente e os dados em bruto foi depositado em um banco de dados GEO Miame queixa, conforme detalhes no site https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. O número de acesso para as células Hec50co é GSE26134 e para as células Ishikawa H é GSE27828. Vários genes a jusante MTDH foram escolhidos aleatoriamente para validar os dados de microarray utilizando iniciadores TaqMan e as sondas (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) para análise RT-PCR quantitativo.