Abstract

andrógeno receptor (AR) via de sinalização continua a ser o alvo principal das novas terapias para o câncer de próstata resistente à castração (CRPC) . No entanto, a expressão de AR constitutivamente activa variantes a que falta a região carboxi-terminal em CRPC pode levar a uma terapia ineficácia. Estas variantes de AR são supostos para suportar o crescimento celular CaP em um ambiente com depleção de androgénio, mas o seu modo de acção ainda continua por resolver. Além disso, estudos recentes indicam que as variantes de AR constitutivamente activo são expressos em tumores da próstata primários e pode contribuir para a progressão do tumor. O objetivo deste estudo foi investigar o impacto das variantes AR constitutivamente ativas na expressão de marcadores de progressão tumoral. a expressão de N-caderina foi analisada em células LNCaP que sobre-expressam o tipo selvagem ou AR AR uma variante constitutivamente activa por qRT-PCR, Western blot e imunofluorescência. Mostrámos aqui pela primeira vez que a expressão de N-caderina foi aumentada na presença de variantes de AR constitutivamente activa. Estes resultados foram confirmados em células que sobre-expressam estas variantes C4-2B AR. Embora a expressão N-caderina é muitas vezes associada a uma baixa regulação da caderina-E, este fenômeno não foi observado em nosso modelo. No entanto, em adição ao aumento da expressão de N-caderina, uma regulação positiva da expressão de outros marcadores de mesenquimais, tais como

vimentina, caracol

e

ZEB1

foi observada na presença de variantes constitutivamente activa. Em conclusão, nossos achados destacar novas consequências de variantes AR constitutivamente activas sobre a regulação dos marcadores mesenquimais no cancro da próstata

Citation:. Cottard F, Asmane I, Erdmann E, Bergerat JP, Kurtz JE, Céraline J (2013 ) constitutivamente activa Expressão receptor andrógeno Variantes upregulate de mesenquimais marcadores em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (5): e63466. doi: 10.1371 /journal.pone.0063466

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 09 de janeiro de 2013; Aceito: 02 de abril de 2013; Publicado em: 02 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cottard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Universidade de Estrasburgo; o Ligue Contre Cancer le, o cancro do le Alsace Contre; ea Association pour la Recherche sur les Tumeurs Prostatiques (ARTP). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum em homens com mais de 50 anos de idade e a segunda causa de mortalidade masculina por câncer na Europa. Andrógenos sinalização desempenha um papel fundamental na CaP proliferação das células ou a sobrevivência [1], e a retirada de andrógeno continua a ser o principal tratamento para a recorrência local e andrógeno-dependentes metastático CaP. No entanto, o benefício desta terapia é transitória e todos os tumores em última instância, recorrer como resistente à castração PCA (CRPC).

eventos genéticos e splicing que afetam o gene (AR) receptor de andrógeno têm sido associados a CRPC. variantes de AR constitutivamente activa, sem a região carboxi-terminal que abrange o domínio de ligação ao ligando e a função de activação 2, pode contribuir para a progressão de CaP em resistência à castração. Estas variantes de AR constitutivamente activas resultar de codões de paragem prematuros devido a mutações nonsense como relatado para o ARQ640X [2], [3], [4], [5] ou a partir de splicing alternativo com a retenção de uma sequência exônico críptico como descrito por AR -V7 [4], [6], [7], [8],.

O papel de variantes de AR constitutivamente activas em CRPC tem sido demonstrado em vários estudos [7], [8], [11 ], [12]. A expressão destes AR truncado variantes é aumentada em cerca de 20 vezes em comparação com CRPC localizada CaP [9], e está relacionada com a capacidade das células CaP a crescer

in vitro

e

In vivo

na ausência de androgénio [7]. No entanto, os mecanismos moleculares exactos que levam a sua activação e o seu modo de acção em APC e CRPC permanecem obscuros.

estudos recentes sugerem que a AR variantes constitutivamente activa pode desempenhar um papel na progressão do tumor. De facto, embora essas variantes AR constitutivamente activas já são expressos em tumores da próstata primários, a sua expressão é tanto mais expressa em metástase óssea [8]. Além disso, a sua expressão está associada com um aumento de NFAT (factor nuclear de activada de células T) (1-proteína activadora) e a actividade de AP-1, dois factores de transcrição envolvidos na proliferação celular, migração e sobrevivência [13].

N-caderina, que pertence à superfamília caderina, está localizado nas junções aderentes em endoteliais ou células mesenquimais do sistema nervoso, e está envolvido em progressão tumoral [14], [15]. Com efeito, a expressão de N-caderina é aumentada na maioria dos cancros e promove a migração de células tumorais, invasão e sobrevivência [14]. O aumento da expressão de N-caderina está também associada com a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um fenómeno caracterizada por uma diminuição de marcadores epiteliais, tais como a E-caderina e um aumento dos marcadores de mesenquimais, tais como vimentina ou N-caderina [16], [17 ], [18], [19]. Estas alterações moleculares e celulares desempenham um papel importante em células tumorais difusão em locais secundários [20], 21.

Mais recentemente, estudos têm demonstrado que a castração-resistente PCA é associado a uma regulação positiva da expressão de N-caderina em modelos celulares, bem como xenoenxertos de APC e de amostras clínicas CRPC [22], [23], [24]. Além disso, os anticorpos monoclonais contra o N-caderina foram mostrados para retardar o aparecimento da resistência a castração e para reduzir o crescimento de xenoenxertos de CRPC [23]. Tomados em conjunto, estes dados mostram que há uma correlação entre a expressão de N-caderina e resistência à castração. No entanto, os mecanismos moleculares em que a expressão de N-caderina é aumentada em CRPC permanecem desconhecidos.

O objetivo deste trabalho foi o de mostrar uma possível ligação entre a presença de variantes AR constitutivamente activa e a expressão de marcadores de progressão tumoral. Mais particularmente, nós nos concentramos sobre o impacto das variantes AR constitutivamente ativas na expressão de N-caderina e outros marcadores mesenquimais. No presente estudo, nós mostramos que o

N-caderina

, bem como

vimentina

,

CARACOL

e

ZEB1

está regulada na presença de variantes AR constitutivamente activas em CaP.

Materiais e Métodos

cultura celular

o carcinoma da próstata linha celular LNCaP humana, clone FGC ea linha de células 22Rv1 (ECACC, Salisbury, Reino Unido) foi mantida em meio RPMI-1640 completo contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, França) e 1 mM de piruvato de sódio (Invitrogen, Fisher Scientific, França).

linha celular C4-2B (ViroMed Laboratories, Minnetonka, MN, EUA) foi mantida em meio DMEM suplementado com 20% de Ham F12, 10% de FCS, 100 U /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina, 5 ug /ml de insulina, 13,65 pg /mL de triiodo-tironina, 4,4 ug /ml de apo-transferrina humana, 0,244 mg /ml de d-biotina e 12,5 ug /ml de adenina (Sigma- Aldrich, França).

Plasmids e transfecção

Para experiências de imunofluorescência, o receptor de andrógeno tipo selvagem (AR) (AR-WT) ea constitutivamente ativa AR Q640X e AR Q670X [25] variantes foram ligados a EGFP como previamente descrito [2], [3]. Para análise da expressão gênica e Western-blot, PE-ARWT, PE-ARQ640X e PE-AR-V7 plasmídeos foram construídos através da inserção do cDNA AR correspondente entre os locais NheI e BamHI em pEGFP-C3.

Para transfecções , o JetPEI

TM reagente de transfecção (Polyplus transfecção, Ozyme, França) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante. As células LNCaP foram semeadas em placas de 10 cm a 1 x 10

6 células /prato ou na placa de 6 poços a 2 x 10

5 /poço. Três dias mais tarde, o meio foi mudado e as células foram transfectadas com 10 ug do plasmídeo indicado utilizando 20 ul de reagente de transfecção JetPEI para placas de 10 cm ou com 3 ug de plasmídeo utilizando 6 ul de JetPEI por placa de 6 poços. O meio foi mudado após 48 h e as células foram incubadas até 9 dias de acordo com as experiências. O meio foi mudado a cada dois dias e para além incubações 4 dias pós-transfecção, as células foram incubadas na presença de 400 ug /mL de geneticina (Invitrogen, France).

Impacto de androgénios sobre a expressão de N-caderina

células LNCaP foram semeadas em placa de 6 poços em meio completo e foram transfectadas, como descrito anteriormente. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio foi alterado para fenol livre de RPMI-1640 vermelho suplementado com 5% revestido com dextrano-carvão FCS (DCC-FCS) e com a concentração indicada de di-hidrotestosterona (DHT) (Sigma-Aldrich, França) ou veículo (etanol).

Para o experimento, com MDV3100 células LNCaP transfectadas foram incubadas em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de DCC-FCS contendo a dose e de DHT indicado 100 nM MDV3100 (enzalutamida, Selleck Chemicals, Euromedex, França) ou veículo (sulfóxido de dimetilo, DMSO). Para confirmar os efeitos de androgénios sobre a expressão de N-caderina, 22Rv1 células foram cultivadas em meio RPMI-1640 com 100 nM ou 1 fiM MDV3100, ou DMSO.

células LNCaP separação de células foram semeadas em

10cm pratos no 1 × 10

6 células /prato e foram transfectadas com pEGFP-ARWT ou pEGFP-ARQ640X. Quatro dias após a transfecção, as células foram tripsinizadas e classificados graças à fluorescência verde (EGFP) com um separador de células de BD FACSAria-II (BD Biosciences, Le Pont de Claix, França). O ARN total foi extraído a partir de EGFP negativo (não transfectadas) e as células positivas para EGFP transfectadas () e foi usada para analisar a expressão do gene por qRT-PCR.

Quantitative real-time PCR

total celular o ARN foi extraído a partir de linhas de células utilizando o ensaio de NucleoSpin® ARN II (Macherey-Nagel, França) de acordo com o procedimento do fabricante. As concentrações e a pureza do RNA foram quantificadas medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm (GeneQuant Pro, GE Healthcare, França). A transcrição inversa foi realizada a partir de 400 ng ou 1 ug de ARN utilizando RT Omniscript ensaio (Qiagen, Courtaboeuf, França). ARN foram diluídos em 13 uL e desnaturado a 65 ° C durante 5 minutos. Adicionou-se uma mistura de reacção 7 mL contendo 1 × modelo RT, 0,5 mM de cada dNTP, 1 | iM de oligo dT, inibidor de RNase e 10U 4U Omniscript Reverse Transcriptase, e a reacção foi incubada 1 h a 37 ° C. A reacção foi parada por aquecimento a 93 ° C durante 5 minutos.

N-caderina

,

E-caderina

,

vimentina

,

CARACOL

,

TWIST1

, e

ZEB1

os níveis de mRNA foram quantificados utilizando PCR em tempo real LightCycler com 480 (Roche Applied Science, Meylan, França). Para as reacções de PCR, 5 uL LightCycler® 480 SYBR Green I Mestre (Roche Molecular Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e 1 uL iniciadores específicos (Tabela 1) (Qiagen, QuantiTect iniciadores, Courtaboeuf, França) foram misturados com 4 pL de 1: 5 diluição ADNc. Os resultados foram normalizados utilizando gene housekeeping

β-actina

ou

PBGD

(porfobilinogênio deaminase) (Qiagen, QuantiTect Primer). especificidade da amplificação foi verificada por análise de curva de fusão e pela migração de electroforese. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas 3 vezes. A quantificação relativa foi usada para determinar a mudança no nível de expressão de dobragem pelo método ΔΔCt. Cada valor é expresso como a média ± SEM ΔΔCt. Os resultados foram analisados ​​com o teste t de Student e

p

-valor 0,05 foi considerado significativo

Western Blot

As células foram lisadas em tampão contendo Tris 10 mM. -HCl pH 7, NaCl 140 mM, MgCl2 3 mM, 0,5 × Igepal, 5 mM de DTT, 1 × inibidor de fosfatase, e um inibidor de protease ×. A concentração de proteína para cada amostra foi quantificada usando o BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EUA) de acordo com o procedimento do fabricante. Uma quantidade de 15 ug a 100 ug de proteínas totais foi carregado em 7,5% SDS-PAGE. Após migração e transferência para uma membrana de nitrocelulose, as membranas foram saturados com PBS /0,1% de Tween /2% de ECL e incubadas a 4 ° C durante a noite com 0,1 ug /mL monoclonal de ratinho anti N-caderina (catálogo n °. 610920, BD Biosciences, França) ou 1 ug /mL de anticorpo monoclonal anti AR (catálogo n ° 554225, BD Biosciences, França.) anticorpo. β-actina (0,2 ug /mL) (catálogo n °. SC-47778, Tebu-bio, França) foi utilizada como controlo interno. Após lavagens, os imunocomplexos foram detectados com 0,2 ug /ml conjugado com HRP de cabra anti-rato (catálogo n °. Sc-2005, Tebu-bio, França), ou 0,5 ug de anticorpos secundários /mL de rato anti-rato IgG2a (catálogo n ° 553391, BD. Biosciences, França), e finalmente reveladas pela quimiluminescência (Immobilon

TM Ocidental, Millipore, Molsheim, França).

imunofluorescência coloração

Lab-Tek lâminas de câmara II (2 poços) foram revestidos com meio de LNCaP durante duas horas e 1 × 10

5 células LNCaP /poço foram semeadas. As células LNCaP foram transfectadas com 2 ug de pEGFP-WT, pEGFP-ARQ640X ou pEGFP-ARQ670X 3 dias mais tarde e incubou- se durante 4 dias. As células LNCaP foram lavadas em PBS e fixadas com paraformaldeído a 2%. As células foram bloqueadas e permeabilizadas por Triton 0,1% /1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) /PBS durante 30 min à temperatura ambiente. As culturas foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho de 2,5 ug /mL de anti N-caderina (catálogo n °. 610920, BD Biosciences, França) ou anticorpo isotípico (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França) a 4 ° C durante a noite. Após lavagem em PBS, as células LNCaP foram incubadas com 2 ug /mL de Alexa Fluor cabra 568-conjugado anti-rato (Invitrogen, Fisher Scientific, França) durante 1 h e os núcleos foram coradas com 0,1 ug /ml, solução de DAPI durante 20 min a 30 ° C. As imagens foram capturadas com o microscópio de fluorescência Leica LAS AF6000 usando software LAS AF (Leica).

Resultados

variantes do receptor de andrógeno constitutivamente activa upregulate N-caderina expressão em células de câncer de próstata

variantes AR constitutivamente activa têm sido associados com CRPC. Além disso, alguns estudos mostraram que CRPC também está associada com uma regulação positiva da expressão de N-caderina [22], [23]. Nós investigamos se variantes AR constitutivamente ativos regular a expressão de N-caderina nas células APC.

N-caderina

nível de ARNm foi determinada por qRT-PCR em células LNCaP que sobre-expressam constitutivamente activa do AR Q640X ou Ar-V7, ou o AR-WT como controlo (Figura 1).

N-caderina

expressão permaneceu inalterada em células LNCaP superexpressão AR-WT comparados com os controles. Curiosamente,

N-caderina

expressão foi aumentado por uma dobra em 8000 na presença de ARQ640X e AR-V7 (Figura 1A-B). Estes dados foram confirmados em células C4-2B (Figura S1) e ao nível da proteína em células LNCaP (Figura 1C). Além disso, uma experiência ao longo do tempo revelou que os níveis da proteína N-caderina foram consistentemente aumentou de dia-3 após transfecção de células de LNCaP com ARQ640X (Figura 1D).

A). a expressão de N-caderina foi avaliada por qRT-PCR em células LNCaP que sobre-expressam constitutivamente activa do AR Q640X ou Ar-V7, ou o AR-WT e em células transfectadas com o plasmídeo vazio (C3). As células foram cultivadas em meio completo durante 9 dias após a transfecção. células LNCaP parentais foram utilizados como controle. eixo Y representa a mudança vezes relativamente comparado com o controle (células LNCaP parentais).

β-actina

foi utilizado como o controlo de normalização endógena. A expressão relativa é apresentada como a média ± SEM de três experiências independentes. Cada amostra é comparada um por um, dois cauda teste t não emparelhado.

NS: não significativo * P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001

. B). Transferência de Western mostrando a expressão de AR nas células LNCaP transfectadas e transfectadas não. C). Análise de imunotransferência da expressão de N-caderina nas células LNCaP transfectadas 4 e 9 dias após a transfecção. D). A análise cinética da expressão de N-caderina por Western Blot em células LNCaP que sobre-expressam AR Q640X de 2 a 9 dias após a transfecção. β-actina foi utilizado como controlo de carga.

Para confirmar estes dados de transfecção transiente, uma análise de separação de células foi realizada após a transfecção LNCaP para demonstrar que a expressão de N-caderina foi restrita a células que expressam um constitutivamente AR ativa.

N-caderina

expressão foi analisada em EGFP negativo (culas n transfectadas) ou EGFP (células transfectadas) positivos fracções por qRT-PCR. Consistente com resultados acima,

N-caderina

expressão era indetectável em ambos os EGFP- frações negativas e positivas seguintes LNCaP transfecção com pEGFP-ARWT. No entanto, após a transfecção com pEGFP-ARQ640X,

N-caderina

expressão foi aumentado em células positivas para EGFP sobre-expressam o AR constitutivamente activo, mas não na fracção negativa EGFP (Figuras 2A-B). Estes resultados foram confirmados por análise de imunofluorescência mostrando uma rotulagem N-caderina exclusivamente em células positivas para EGFP que expressam uma variante constitutivamente activa de AR (Figura 2C).

células LNCaP foram transientemente transfectadas com pEGFP-ARWT ou plasmídeo pEGFP-ARQ640X e foram classificadas após 4 dias. UMA).

N-caderina

expressão foi analisada por qRT-PCR em EGFP positivo (transfectada) e EGFP negativo (não transfectadas) fracções. B). nível do receptor de androgénio (AR) foi analisada por Western blot para verificar a pureza de cada fracção depois da separação de células. C). Análise por imunofluorescência de N-caderina expressão (fluorescência vermelha) em células LNCaP transfectadas com (fluorescência verde) etiquetadas-EGFP AR-WT, AR Q640X ou AR Q670X plasmídeo de expressão. Ampliação:. × 20

Em conjunto, estes dados sugerem fortemente que as variantes AR constitutivamente ativos regular a expressão de N-caderina nas células CaP

Os andrógenos regulam negativamente a expressão de N-caderina induzida por. constitutivamente receptor de andrógeno ativo variantes

um estudo recente relatou que variantes AR constitutivamente ativos pode exigir um AR de longa-metragem (AR-FL) para ativar genes-alvo endógenas. Para explorar o efeito da endógena AR-FL presente em células LNCaP na capacidade de variantes de AR constitutivamente activa para induzir a expressão de N-caderina, células LNCaP que sobre-expressam AR-WT ou uma variante constitutivamente androgénio foram incubadas na presença de 100 nM de DHT ou veículo, e N-caderina de expressão foi analisada por qRT-PCR. De acordo com os nossos resultados anteriores, há a expressão de N-caderina foi observada em células que sobre-expressam WT-AR. Curiosamente, um decréscimo de 1,4 vezes no nível de expressão de N-caderina foi observada quando as células que sobre-expressam AR Q640X ou Ar-V7 foram cultivadas na presença de 100 nM de DHT em relação ao veículo (Figura 3A). Além disso, esta repressão N-caderina mediada por androgénio foi dependente da dose (Figura 3B). Estes resultados sugerem que as variantes do receptor de androgénio constitutivamente activos não requerem AR-FL para sobre-regular a expressão de N-caderina. No entanto, activado DHT-AR-FL parece antagonizar os efeitos de variantes do receptor de androgénio constitutivamente activas sobre a expressão de N-caderina (Figura 3C). Para verificar esta hipótese, o MDV3100 anti-andrógeno romance foi utilizado para inibir activado DHT-AR-FL em células LNCaP transfectadas. Como esperado, observou-se um aumento significativo da expressão de N-caderina nas células LNCaP que sobre-expressam variantes de AR, na presença de 100 nM MDV3100 (Figura 3D). Estes resultados foram também confirmados em células resistente à castração 22Rv1, que se sabe expressarem ambas AR-FL e variantes de AR constitutivamente activa. Um aumento de 2 vezes no nível de ARNm de N-caderina foi observada quando as células foram cultivadas durante 22Rv1 4 dias na presença de 100 nM e 1 uM do MDV3100 anti-androgénio (Figura S2).

A). As células LNCaP foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 5% de DCC-FCS e 100 nM de DHT ou veículo (EtOH). a expressão de N-caderina foi analisada por qRT-PCR em células LNCaP de 4 dias após a transfecção com AR-WT ou o constitutivamente activa AR Q640X ou Ar-V7 plasmídeo de expressão. B). nível de expressão de N-caderina nas células LNCaP foi investigada por qRT-PCR 4 dias após a transfecção com o plasmídeo de expressão de AR Q640X na presença de diferentes concentrações de DHT (10 nM, 25 nM e 50 nM) ou veículo. C). a expressão de N-caderina induzida por variantes de AR constitutivamente activa (variantes de AR) foi regulada negativamente quando as células LNCaP foram cultivadas na presença de DHT. Nossa hipótese é que endógena AR-FL presente em células LNCaP e variantes AR poderia agir de forma diferente. Neste modelo, estimulou-DHT endógena AR-FL reprime a expressão de N-caderina ao passo que as variantes de AR regular positivamente a sua expressão. D). células LNCaP que sobre-expressam WT-AR, AR Q640X e AR-V7 foram cultivadas em meio de DCC-FCS suplementado com 100 nM de DHT e na presença de 100 nM de MDV3100 ou DMSO como controlo, durante 3 dias. a expressão de N-caderina foi analisada por qRT-PCR 4 dias após a transfecção, e foi normalizada para

β-actina

. O método ΔΔCt foi usada para calcular a expressão relativa e cada valor foi reportado como a média ± SEM de ΔΔCt.

NS: Não significativo * P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001

Todos juntos, estes dados sugerem que ativou-DHT AR-FL. poderia competir com o receptor de androgénio constitutivamente activa para regular a expressão de N-caderina.

variantes do receptor de androgénio constitutivamente activa estão associados com a expressão de marcadores mesenquimais

é amplamente conhecido que, em células tumorais, a expressão de marcadores mesenquimais está associada com uma sub-regulação de marcadores epiteliais. Colocámos a hipótese de que a sobre-regulação da expressão de N-caderina observada na presença de variantes de AR constitutivamente activas é acompanhada por uma diminuição da expressão de E-caderina. Para testar esta hipótese, foi analisada a expressão de E-caderina em LNCaP transfectadas com ARQ640X, AR-V7 ou do tipo selvagem plasmídeo de expressão de AR, ou do plasmídeo vazio como controlo.

E-caderina

níveis de mRNA em células LNCaP sobre transfecção com ARQ640X ou AR-V7 plasmídeo de expressão não mostraram qualquer diferença significativa em comparação com os controles (Figura 4A). Estes resultados foram confirmados por análise de Western blot (dados não mostrados), sugerindo que a expressão de variantes de AR constitutivamente activas em PCA é associada com um aumento acentuado da expressão de N-caderina, mas não está correlacionada com uma diminuição da regulação de E- caderina.

células LNCaP foram transfectadas com o ARWT, ARQ640X ou Ar-V7 plasmídeo de expressão ou do plasmídeo vazio (C3). UMA).

E-caderina

, B).

vimentina

, C).

TWIST1

, D).

CARACOL Comprar e E).

ZEB1

níveis de expressão foram analisados ​​por qRT-PCR em dia 9 após a transfecção. Para cada amostra, os níveis de expressão foram normalizados para

PBGD

ou

β-actina

e classificado como valor relativo para a linha celular parental de LNCaP. Os valores são apresentados como a média ± SEM de ΔΔCt.

NS: Não Significativo * P 0,05, ** P 0,01 e *** P 0,001

. F). Transferência de Western que mostra a evolução da expressão ZEB1 em células LNCaP que sobre-expressam variantes de AR constitutivamente activa. Immunoblot de 100 ug de extractos de proteína total. β-actina foi utilizada como controle de carga.

Também investigamos se a expressão AR constitutivamente ativo em células PCA é associada com outros marcadores mesenquimais. Os níveis de expressão de

vimentina Comprar e fatores de transcrição

TWIST1, ZEB1

e

CARACOL

foram determinadas por qRT-PCR no dia-9 após LNCaP células transfecção com ARQ640X ou AR-V7 plasmídeo de expressão, o plasmídeo de tipo selvagem AR ou o vector vazio como controlo (Figura 4B-e).

vimentina

expressão foi aumentado em um 2,5 e 1,5 vezes em células LNCaP com superexpressão ARQ640X e AR-V7, quando comparados com os controles, respectivamente (Figura 4B).

Embora TWIST1 é conhecida por induzir

expressão N-caderina

em APC, não houve diferença significativa nos níveis de mRNA de

TWIST1

foi observado (Figura 4C). No entanto, as variantes AR constitutivamente ativos levou a um aumento estatisticamente significativo de

CARACOL

e

ZEB1

níveis de mRNA (Figura 4D, E). ZEB1 regulação positiva foi também confirmado a nível de proteína (Figura 4F).

Discussão

A sinalização AR é muito importante para a proliferação e sobrevivência de células cancerosas da próstata. A via AR permanece ligada durante a progressão de CaP no sentido de uma doença resistente à castração e o aparecimento da RA constitutivamente activa variantes a que falta o domínio de ligação ao ligando é agora considerada como um evento importante na CRPC. Apesar de alguns estudos sugerem que as variantes de AR constitutivamente activas têm um impacto sobre a progressão do tumor, a sua função permanece até agora não resolvido.

Neste estudo, demonstrámos que o N-caderina é regulado positivamente em células LNCaP que expressam constitutivamente activa variantes de AR, mas não em células que sobre-expressam um LNCaP AR de comprimento completo. Estes dados sugerem, pela primeira vez que as variantes de AR constitutivamente activos podem induzir a expressão de N-caderina. Esta descoberta deve ser ligado com estudos recentes reportando uma correlação entre CRPC e N-caderina upregulation [22], [23], [24]. Consistente com estes estudos, os nossos dados sugerem que a AR constitutivamente activa variantes de sinalização pode ser um mecanismo que conduz a expressão de N-caderina em CRPC.

Estes resultados novamente realçar a ligação entre a via de sinalização de AR e a expressão de N-caderina. Estudos recentes sugerem que a AR regula negativamente a expressão de N-caderina [22], [23]. Com efeito, N-caderina está associada com a regulação positiva de uma diminuição da expressão de AR em xenoenxertos de CaP resistente à castração [23]. Além disso, a regulação positiva de N-caderina observado nas células LNCaP-19 resistente à castração pode ser invertido na presença de androgénios [22], [26], [27]. De acordo com estes dados, que demonstraram que os androgénios foram associadas com uma expressão de N-caderina diminuiu no nosso modelo que sobre-expressam uma variante do receptor de androgénio constitutivamente activa. Estes resultados sugerem que as variantes de AR constitutivamente activas AR-FL e pode actuar de forma diferente (Figura 3C). Por exemplo, estimulou-DHT AR-FL pode recrutar co-repressores e, por sua vez, reprime

N-caderina

expressão. Além disso, AR constitutivamente ativa variantes falta da região carboxi-terminal pode se comportar de forma diferente e induzir

N-caderina

expressão. Além disso, as variantes de AR constitutivamente activas AR-FL e podiam competir uns com os outros para regular a expressão de N-caderina. Consistente com esta hipótese,

gene N-caderina

contém um conjunto de elementos de resposta de andrógenos (ARE) repete no intron 1 [28].

No entanto, as variantes AR constitutivamente ativos também poderia controlar indiretamente

N-caderina

expressão. Por exemplo, no cancro da próstata,

N-caderina

expressão foi associada com uma translocação nuclear de TWIST1 [29]. Embora nossos dados não mostraram nenhuma diferença significativa no

TWIST1

níveis de mRNA, variantes AR constitutivamente ativos pode melhorar a translocação nuclear de TWIST1, o que poderia, por sua vez induzem

expressão N-caderina

após a ligação com o E- caixa de dentro do primeiro intrão do

N-caderina

.

Estas hipóteses merecem ser estudados em mais estudos para entender como constitutivamente variantes AR ativos regular

N-caderina

expressão.

neste estudo, também mostraram que variantes AR constitutivamente activos foram associados com um aumento da expressão de marcadores mesenquimais como

vimentina

,

CARACOL Comprar e ZEB1. Estes resultados são consistentes com um estudo recente, que mostrou um aumento de marcadores mesenquimais em tumores de doentes tratados com a terapia de privação de androgénio [24]. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que as variantes de AR constitutivamente activa pode estar associada com o processo de EMT. No entanto, esses marcadores não são consistentemente associada a EMT. Por exemplo, caracol confere resistência à apoptose de células tumorais expostas a radiações ionizantes e drogas genotóxicos, e permite que as células do peito se tornem células de iniciação do tumor [30], [31], [32], [33], [34].

a expressão de marcadores mesenquimais aqui relatados na presença de variantes de AR constitutivamente activas não foi associado com uma regulação negativa da E-caderina no nosso modelo. A correlação inversa entre a regulação positiva N-caderina e downregulation E-caderina é ainda debatida. Com efeito, McKeithen e colegas, e mais recentemente Tiwari e colegas relataram um co-expressão de ambos os E- e N-caderinas em células tumorais [35], [36]. Nestes estudos proteína E-caderina exibe uma localização subcelular diferente. Além disso, a regulação positiva N-caderina relatado após a castração em células LNCaP-19 não é acompanhada por uma diminuição da expressão de E-caderina em

in vitro cultura de células

[22]. No entanto, a regulação negativa esperada de E-caderina neste modelo é observado apenas em tumores ortotópicos após a castração, mas não em subcutâneas LNCaP-19 tumores, sugerindo um papel importante do ambiente circundante da próstata para E-caderina downregulation [22]. Além disso, uma correlação inversa entre a expressão induzida por castração N-caderina e a regulação negativa da E-caderina tem sido documentada em LAPC9 e LuCaP35 modelos subcutâneos xenoenxertos [23], [24]. No entanto, esta cadherins interruptor não foi relatada em dois estudos sobre tumores da próstata clínicos humanos, a partir de pacientes com ou sem terapia de privação de andrógeno [22], [24].

Mais estudos são necessários para compreender as consequências funcionais de N-caderina e outros marcadores mesenquimais regulação positiva na presença de variantes de AR constitutivamente activa. a expressão de N-caderina é amplamente associados com a progressão do tumor, nomeadamente devido ao seu papel na migração e invasão. Com efeito, N-caderina favorece a migração das células cancerosas através de reorganização do citoesqueleto e formação lamelip�ios [14]. Além disso, promove a migração de células cancerosas, que estabelece interacções homofílicas com os tecidos vizinhos, como o tecido do estroma ou endotélio [37], [38]. a expressão de N-caderina está também associada com a sobrevivência em células de cancro da próstata e células de melanoma. Com efeito, a expressão de N-caderina pode activar o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt, para inactivar as proteínas pró-apoptóticas e para induzir um aumento das proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 [39], [40]. Finalmente, um estudo recente mostrou que a N-caderina pode mediar a angiogénese através da indução de expressão de proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), através da via PI3K /AKT [41].

Existe presentemente um grande interesse no modo de de acção de variantes de AR constitutivamente activas em CRPC. Neste estudo, nós mostramos pela primeira vez que a AR constitutivamente ativa variantes induzir a expressão de N-caderina e outros marcadores mesenquimais em CaP. Estes resultados suportam a hipótese de que essas variantes AR constitutivamente activas poderia contribuir para disseminação sistêmica de células APC, e reforçam a importância para atingir essas variantes AR em CaP.

Informações de Apoio

Figura S1.

a expressão de N-caderina foi regulada positivamente em células C4-2B na presença de variantes de AR constitutivamente activa.