Abstract

NSCLC (cancro do pulmão de células não pequenas) geralmente apresenta resistência ao tratamento paclitaxel. Identificar os elementos que regulam a resposta paclitaxel vai avançar os esforços para superar essa resistência em terapia NSCLC. Usando

in vitro

abordagens, demonstramos que a sobre-expressão do microRNA miR-337-3p sensibiliza células NCI-H1155 para paclitaxel e mímico que miR-337-3p tem um efeito geral sobre a resposta paclitaxel em NSCLC linhas de células, que podem fornecer uma estratégia adjuvante novo para o paclitaxel no tratamento de cancro do pulmão. Ao combinar

in vitro

e

in silico

abordagens, identificamos

STAT3

e

RAP1A

como alvos diretos que medeiam o efeito de miR-337- 3P, a sensibilidade de paclitaxel. Outras investigações mostraram que imitam o miR-337-3p também sensibiliza células para o docetaxel, um outro membro da família do taxano, e que os níveis de STAT3 estão significativamente correlacionados com a resistência de taxano em linhas celulares de cancro do pulmão, o que sugere que a expressão endógena STAT3 é um determinante de taxano intrínseca resistência no cancro do pulmão. A identificação de um miR-337-3p como um modulador da resposta celular a taxanos, e

STAT3

e

RAP1A

como alvos reguladores que medeiam esta resposta, define uma nova via de regulamentação modular a sensibilidade paclitaxel em células de câncer de pulmão, o que pode proporcionar novas estratégias adjuvantes juntamente com paclitaxel no tratamento de câncer de pulmão e também pode fornecer biomarcadores para prever a resposta de paclitaxel em NSCLC

Citation:. Du L, Subauste MC, DeSevo C, Zhao Z, Baker H, Borkowski R, et al. (2012) miR-337-3p e suas metas

STAT3

e

RAP1A

Modular taxano sensibilidade em não-pequenas células do pulmão. PLoS ONE 7 (6): e39167. doi: 10.1371 /journal.pone.0039167

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de fevereiro de 2012; Aceito: 17 de maio de 2012; Publicado: 18 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Compatível com parte pelo câncer pulmonar SPORE P50 CA70907 (JD Minna), R01 CA129632 (A. Pertsemlidis) do Instituto Nacional do Câncer, e Academic Excellence Grant EDUD-7824-021007-US (A. Pertsemlidis) da Sun Microsystems. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Hardware de computação de alto desempenho foi fornecida por um Excellence Grant Acadêmico da Sun Microsystems. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O paclitaxel é um agente de metas de microtúbulos inicialmente isolado da coníferas

Taxus brevifolia

– o teixo tem uma longa história de utilizações medicinais [1] – e é amplamente utilizada no tratamento de cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão. Para NSCLC, resistência ao paclitaxel é comum, com taxas de resposta de entre 21% a 24% [2], [3]. Mecanismos para tal resistência incluem a sobre-expressão de P-glicoproteína, alterações na composição da tubulina, e mutações em β-tubulina [4], [5], [6], [7]. Um estudo recente indica que um grande grupo de genes que codificam proteínas que pertencem a uma ampla gama de classes funcionais é potencialmente envolvidos na modulação da resistência paclitaxel no tratamento do cancro [8]. Identificar os mecanismos que regulam a expressão de genes-chave envolvidos na resistência paclitaxel vai avançar os esforços para superar essa resistência no tratamento de câncer de pulmão.

Estamos interessados ​​no envolvimento potencial de microRNAs (miRNAs) na modulação da resposta paclitaxel em tratamento do câncer de pulmão. miARNs são curtos, de 19 a 23 de ARN de nucleótidos encontradas em vários organismos que regulam a expressão de genes em grande parte por diminuição dos níveis de RNAs mensageiros-alvo [9], [10] e foram mostrados para desempenhar papéis importantes na regulação de uma ampla gama de processos patológicos, incluindo patogênese do câncer. níveis de miARN pode ser facilmente manipulado por meio de moléculas de ARN sintéticos. Um quimicamente estabilizada, molécula de ARN de cadeia simples complementar a um miARN alvo actua como um inibidor e diminui os níveis endógenos da miARN. Por outro lado, uma molécula de ARN de cadeia dupla com uma cadeia idênticas em sequência de um miARN madura actua como um imitador de miARN ocorrência natural e aumenta os seus níveis de expressão celular. Vários estudos exploraram os efeitos terapêuticos dos imita e inibidores de miARN e demonstraram o potencial destas classes de oligonucleótidos como agentes terapêuticos [11], [12], [13], [14], [15], [16].

hsa-miR-337 (miR-337) é um locus de miRNA humana localizado na 14q32.2 cromossomo. miR-337-3p é altamente expressa em fibroblastos fetais normais imortalizadas pulmonares (IMR-90), e é detectável em células humanas imortalizadas epiteliais brônquicas (HBECs). A expressão de miR-337-3p em linhas de cancro de pulmão, no entanto, é geralmente mais baixa do que em linhas de células epiteliais de pulmão normal (Figura S1). predição desejado mostra que o miR-337-3p potencialmente regula a expressão de vários genes que têm sido implicados na tumorigénese. Descobrimos que miR-337-3p sensibiliza as células de câncer de pulmão ao tratamento paclitaxel, mas, inesperadamente, não afeta significativamente a viabilidade celular sozinho. Nós ainda utilizado

in vitro

e

in silico

abordagens para definir os alvos diretos de miR-337-3p que mediam seu efeito sobre a sensibilidade paclitaxel. Nós também exploraram a relevância potencial de miR-337-3p mímico e os seus alvos na determinação da sensibilidade de paclitaxel em um grande painel de linhas celulares de NSCLC, e preliminarmente explorado o potencial de miR-337-3p mímico como um adjuvante para o tratamento com paclitaxel

in vitro

em linhas celulares de NSCLC.

Materiais e Métodos

as linhas celulares

as linhas celulares utilizadas neste estudo foram obtidos a partir do Centro de Hamon para Therapeutic Oncology Research em UT Southwestern Medical Center. As linhas que começam com “NCI-H” foram estabelecidos no Instituto Nacional do Câncer [17], [18]. As linhas que começam com “HCC” e HBECs foram estabelecidas pelo Centro de Hamon for terapêuticas Oncologia Investigação da UT Southwestern Medical Center [19]. Todas as linhas celulares de cancro de pulmão foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). HBECs foram cultivadas em meio suplementado com Gibco® KSFM extracto de pituitária bovina e o factor de crescimento epidérmico humano recombinante (Life Technologies). Todas as linhas celulares eram ADN impressões digitais usando o sistema GenePrint PowerPlex 1,2 (Promega, Madison, WI) e confirmado contra bibliotecas de impressões digitais mantidos pela ATCC e o laboratório Minna /Gazdar, e testados quanto à contaminação utilizando o kit de detecção de e-Myco Mycoplasma PCR (Boca Scientific , Boca Raton, FL).

ensaios de viabilidade celular

Sensibilidade das linhas celulares de NSCLC a paclitaxel e docetaxel foi medido utilizando um protocolo padrão, tal como descrito em Zhou et al. [20]. Resumidamente, as células foram semeadas em formato de 96 poços, com paclitaxel adicionado em diferentes concentrações após 24 h, seguido de incubação com a droga durante 96 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o CellTiter 96® Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (MTS, Promega). O efeito de miR-337-3p e seus alvos foram determinados através de transfecção transiente de oligos quer imitar ou de ARNip de miR-337-3p segmentação genes específicos. Em geral, as células foram reversa-transfectadas com os oligos indicados em formato de 96 poços e cultivadas durante 72 h, seguido por incubação com drogas para adicional de 72 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o CellTiter 96® Aqueous Uma célula de solução Ensaio de Proliferação (MTS, Promega) ou a célula CellTiter-Glo Luminescent Viabilidade Assay (ATP, Promega).

A citometria de fluxo

Células foram transfectadas com os oligos indicadas em placas de 6 poços, durante 48 h, seguido de tratamento com paclitaxel ou veículo durante um adicional de 16 h. Ambas as células destacadas e ligadas foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. As células foram lavadas uma vez com 1X PBS (tampão fosfato salino) e fixadas com 1X PBS contendo EDTA 1 mM e 85% de etanol a 4 ° C. Após 1 h, as células foram colhidas por centrifugação a 1400 rpm durante 5 min a 4 ° C. As células foram ressuspensas em 1X PBS, e tratadas com 50 ug /ml de iodeto de propídio e 100 ug /ml de RNase A durante 30 min a 37 ° C. dados relativos ao ciclo celular foram coletadas em um 500 fluxo Cytomics FC citômetro (Beckman Coulter, Brea, CA), com 20.000 eventos coletados por amostra. Os dados foram avaliados usando o software de análise de dados FlowJo, versão 9.1 (TreeStar, Ashland, OR).

RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

expressão miRNA foi medido em um ABI PRISM 7900 Sistema de Detecção de sequência utilizando TaqMan® microRNA Ensaios (Life Technologies) com expressão RNA RNU19 como um controlo interno para a normalização da carga de RNA. a expressão de ARNm foi medida usando ensaios de expressão de genes TaqMan® com expressão de ARNm de GAPDH como controlo interno. tempos de ciclo limiar (C

T) foram obtidos e a expressão do gene relativo foi calculado usando o método comparativo do tempo de ciclo.

Western blots

Os lisados ​​celulares foram preparados usando tampão NP-40. A concentração de proteína foi determinada usando o ensaio Pierce BCA (Thermo Fisher, Rockford, IL). Para electroforese, quantidades iguais de lisado celular foram resolvidas por SDS-PAGE e transferida para PVDF Immun-Blot membranas (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram bloqueadas e sondados com os anticorpos seguintes: anti-coelho ou anti-RAP1A STAT3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), ou de cabra anti-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Os anticorpos ligados foram detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) e visualizados por quimioluminescência aumentada (ECL) substrato (Thermo Fisher). mudanças relativas nos níveis de proteína foram quantificados por densitometria usando o software One Quantidade (Bio-Rad).

miRNA previsão alvo

Para identificar as metas regulatórias de miR-337-3p, foi utilizado o miRmate método desenvolvido no nosso laboratório, como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, o método recompensas complementaridade completa nas posições 2-8 do miARN (região da semente), desemparelhamentos e inserções na protuberância central nas posições 9-11 da miARN, alguma complementaridade na extremidade 3 ‘, e a composição específica na sequência posições 1 (a) e 9 (a ou C) do miRNA, de acordo com as conclusões de Lewis et al. [22].

ensaios de repórter de luciferase

O segmento do tipo selvagem (WT) 3’UTRs contendo os sites de destino previstos de

RAP1A

(NM_002884) e

STAT3

(NM_003150) foram clonados a jusante do ADNc de luciferase em PMIR-REPORT (Ambion, Austin, TX), um vector que contém ambos os cDNAs de luciferase e β-galactosidase sob o controlo dos sistemas de promotor /terminador de mamífero distintas. As construções mutantes (

RAP1A

MU e

STAT3

MU) com a posição 3 (2

nd nucleotídeos na sequência de sementes alvo) passou de G para A e a posição 1 (imediatamente 3 ‘para a sequência de semente) foi alterado de a a L, foram realizadas utilizando o QuikChange Kit de mutagénese dirigida ao local (Stratagene, La Jolla, CA). A actividade de luciferase e a actividade β-galactosidase foi medida usando o sistema de ensaio de luciferase e β-galactosidase Assay System (Promega), respectivamente.

expressão de ARNm de perfil

células NCI-H1155 foram transfectadas com miR- 337-3p mímica controle mímica ou negativo. O ARN total foi isolado utilizando miRvana ™ kit de isolamento de miARN (Ambion), marcado e hibridado com HumanWG-6 V3 BeadChips expressão (Illumina, San Diego, CA) utilizando protocolos padrão. As lâminas foram digitalizadas em um Illumina BeadStation e intensidades de sinal foram resumidas usando BeadStudio v3.3 (Illumina). subtração de fundo e normalização quantil foram realizadas utilizando o algoritmo MBCB [23].

Correlação de expressão com o conteúdo motivo 3’UTR

A correlação entre as alterações na expressão de genes induzidos por miR-337-3p mais -expression e motif conteúdo de suas 3’UTRs foi analisada utilizando sylamer (https://www.ebi.ac.uk/enright/sylamer), que calcula os valores de p cumulativos e hipergeométricas associados com ocorrências de palavras pequenas em uma seq ranking de maiores sequências, neste caso ocorrências 7-mer em todo o conjunto de RefSeq 3’UTRs, e por meio de regressão linear tal como aplicadas nos miReduce [24], [25]. Para este último, cada motivo contida nos 3’UTRs é considerada linearmente para contribuir para o perfil de mudança de dobragem, e miReduce iterativamente calcula os motivos que mais contribuem. O coeficiente de regressão para cada motivo pode ser positiva ou negativa, dependendo se a interacção resulta numa supressão ou activação da expressão do gene alvo. No caso de sobre-expressar um miARN, esperamos que os transcritos contendo motivos complementares para a sequência de semente microARN ser reduzida, a expressão, de modo que o motivo terá um coeficiente de regressão negativa.

de fase inversa matriz Proteína (RPPA)

lisados ​​de proteína foram preparadas utilizando tampão de lise quente (2% de SDS; 0,06 M de Tris-Cl, pH 6,8; 5% de glicerol) com inibidores de proteinase e da fosfatase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ; Santa Cruz Biotechnology) e β-mercaptoetanol adicionada de fresco. Os lisados ​​foram desnaturados por ebulição durante 5 min com os sobrenadantes obtidos por centrifugação a 13000 rpm durante 7 min a 4 ° C. Antes arraying em lâminas, os lisados ​​de proteína foram filtradas através de placas de filtro de 96 poços com 25 mm membranas de poros (Phenix pesquisar produtos, Candler, NC) para remover agregados. Quantidades iguais de lisados ​​foram dispostas em triplicado em ONCYTE® AVID

TM nitrocelulose lâminas de cinema (Grace Bio-Labs, Bend, Oregon) usando um SpotArray

TM24 sistema de impressão Microarray (PerkinElmer, Waltham, MA) sob 55-60 % de umidade. Para imuno-coloração, as lâminas foram incubadas em primeiro lugar à TA em ReBlot Além disso solução suave (Merck Millipore, Billerica, MA) durante menos de 7 min para relaxar a estrutura da proteína e, em seguida, lavado em tampão de TBS-T, em seguida, incubadas em tampão de bloqueio Pierce SEA BLOCK (Thermo Fisher), bloquearam-se com avidina e biotina (Dako, Glostrup, Dinamarca), e incubadas ou com STAT3 (Merck) ou pSTAT3 (S727, Cell Signaling Technology) de anticorpo, a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundário biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 30 min, seguido por blotting com Qdot 655 conjugado com estreptavidina (Life Technologies) durante 30 min. As lâminas foram digitalizadas com um ProScanArray Microarray Scanner (PerkinElmer). os níveis de expressão da proteína foram quantificados utilizando software e normalizados para diferenças de carga de proteína utilizando Sypro rubi ™ (Life Technologies) sinais de manchas de proteínas obtidos sobre uma lâmina impressa separada no mesmo lote MicroVigene ™ (Vigene Tech, Carlisle, MA).

miARN perfil de expressão de espécimes tumorais

10-20 uM secções em série de 249 amostras de espessura NSCLC cirurgicamente ressecado (172 incluindo adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas 76) foram obtidos utilizando um criostato Leica e homogeneizadas utilizando um homogeneizador Omni TH (Omni International, Kennesaw, GA). O ARN total foi isolado utilizando Reagente TRI (Life Technologies) e quantificado usando um espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher). qualidade RNA foi determinada em um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Para a análise de microRNA, as amostras foram marcadas usando o Labeling completa miRNA e Kit Hib e hibridado com Agilent miRNA Humano microarray versão 3 chips (Agilent Technologies), que contém as sondas para 866 humana e 89 microRNAs virais humanas baseado em miRBase v12.0 (https://microrna.sanger.ac.uk). As hibridações foram realizadas em câmaras SureHyb aço inoxidável (G2534A), a 55 ° C durante 22 h, após o que as matrizes foram lavadas e examinadas usando um Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). Os níveis de expressão de miRNA foram extraídos utilizando o software Feature Extraction (Agilent Technologies) e processados ​​com o bioconductor [26] pacote AgiMicroRna para corrigir para o fundo, remover o controle e as sequências não-detectáveis, e normalizar quantil e resumir os dados.

resultados de

sobre-expressão de miR-337-3p sensibiliza células NCI-H1155 para paclitaxel e melhora induzida por paclitaxel G

2 /M detenção

para examinar o efeito do miR- 337-3p sobre a sensibilidade de paclitaxel em células de cancro de pulmão, utilizou-se o miR-337-3p mímico (Dharmacon) para aumentar os níveis de miR-337-3p em células NCI-H1155, uma linha celular de cancro do pulmão caracterizadas como moderadamente resistente ao paclitaxel numa Anterior estudo [8]. Como mostrado na Figura 1A, o miR-337-3p sobre-expressão significativamente sensibiliza células para o tratamento com paclitaxel, diminuindo o IC

50 – definida como a concentração que conduz a uma diminuição de 50% da viabilidade das células – a partir de 27,27 nM (95% CI 25,97-28,90) com oligo controle para 14,60 nM (IC 95% 14,08-15,15) com miR-337-3p mímica (p 0,0001). A seguir testou a dependência da dose do efeito de miR-337-3p na sensibilidade paclitaxel e a viabilidade das células por transfecção de células NCI-H1155 com diferentes concentrações de quer o miR-337-3p oligo mímica ou de controlo, seguido por tratamento com 16 nM de paclitaxel ou transportador. Como mostrado na Figura 1B, o miR-337-3p mímico significativamente sensibiliza células a paclitaxel em relação ao oligo controlo, em concentrações tão baixas como 0,5 nM (p = 0,0168), mas não diminui significativamente a viabilidade celular na ausência de paclitaxel a concentrações ainda tão alta quanto 200 nM. Para avaliar adicionalmente a regulação da resposta de paclitaxel por miR-337-3p, examinámos o efeito de inactivação de miR-337-3p na sensibilidade paclitaxel em células H1155. Como mostrado na Figura 1C, a inactivação de miR-337-3p por inibidor de miR-337-3p diminui significativamente a resposta de H1155 de tratamento com paclitaxel, com a viabilidade celular relativa crescente por 17,81 ± 5,31% (p 0,0001), relativamente ao controlo oligos.

(a) efeito dose-dependente do paclitaxel na viabilidade celular na presença ou ausência de miR-337-3p mímica. A viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de MTS. (*, P 0,05; **, p 0,01; ***, p 0,001; NS, não significativo) (B) A viabilidade celular como uma função da concentração de oligonucleótido na presença ou ausência de paclitaxel. A viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de concentração de ATP. (C) Efeito de knockdown miR-337-3p com inibidor de miR-337-3p (50 nM) sobre a sensibilidade paclitaxel em células H1155. É mostrada a viabilidade celular relativa na presença de 16 nM de paclitaxel normalizado para controlar os oligos. (****, P 0,0001) (D) análise do ciclo celular como uma função da superexpressão de paclitaxel e o tratamento de miR-337-3p. A fracção de células em G

1, S e G

2 fases foi estimada utilizando o modelo de pragmática Watson, com a relação de G

2 a G

fracções de 1 para paclitaxel células tratadas normalizados para que observada para condições de controle (R = [G

2 /G

1]

paclitaxel /[G

2 /G

1]

transportador).

os taxanos que se ligam à subunidade β de tubulina e inibem a dinâmica normais de desmontagem de microtúbulos, levando a microtúbulos estabilizados e paragem prolongada de células em G

2 /H de fase do ciclo celular e, eventualmente, a morte celular [27 ], [28]. Comparou-se o efeito de miR-337-3p sobre-expressão do ciclo celular, com ou sem tratamento com paclitaxel, em um ponto de tempo (16 h) antes de paclitaxel apoptose induzida significativa. Tal como mostrado na Figura 1D, na presença de paclitaxel, mímica miR-337-3p induz um dramático L

2 /H prisão, com uma normalizado L

2 /L

uma relação de R = 4,38, em relação a R = 2,48 para o oligo de controlo, P = 2,34 para miR-337-5p mímico, e R = 2,31 para a transfecção simulada, enquanto que o miR-337-3p não afecta a distribuição do ciclo celular na ausência de paclitaxel.

os resultados anteriores indicam que o miR-337-3p modula a sensibilidade paclitaxel em células NCI-H1155, melhorando especificamente prisão célula na L

2 /H de fase do ciclo celular, sem afectar significativamente a sobrevivência celular por si só.

análise de arranjo de expressão indica que muitas das metas previstas de miR-337-3p está regulada para baixo ao nível do ARNm por miR-337-3p sobre-expressão

a fim de pesquisar exaustivamente para o destino genes que medeiam o efeito de miR-337-3p sobre a sensibilidade de paclitaxel de células NCI-H1155, que perfilada expressão de genes por microarrays para identificar transcritos que são regulados negativamente pelo miR-337-3p sobre-expressão, uma vez que cada vez mais provas que mostra miARNs regular a expressão do gene alvo através de níveis de ARNm decrescentes [29]. A magnitude de miR-337-3p sobre-expressão (Figura 2A) é comparável com as diferenças na expressão endógena observados em diferentes tecidos e entre IMR-90 fibroblastos pulmonares fetais e HBECs (Figura S1). Uma vez que a maioria dos estudos recentes suportam a complementaridade perfeita entre a 7-meros na região de semente (que abrange as posições 1-8) de um miARN maduro, com sequências na 3’UTR do ARNm transcrito como um determinante crítico da interacção entre um miARN alvo e um gene [30], [31], que avaliou a correlação entre expressão e conteúdo motivo de transcritos de mRNA com base na ocorrência de 7-meros em suas 3’UTRs. Tal como mostrado na Figura 2B, significativamente mais dos 1.211 genes que contêm o 7-mero UAUAGGA complementar à sequência de miR-337-3p semente – bases 2-8, considerado como o mais forte determinante de miARN: interacção alvo – diminuição na expressão do aumento (p = 1,37 × 10

-2), entre os quais 32 genes diminuir ≥2 vezes e apenas 3 genes aumentam ≥2 vezes (Figura 2D). Em contraste, números aproximadamente iguais dos 19.262 genes que não contenham a diminuição de 7-mer e aumento da expressão. Além disso, figuras 2C e 2D mostram que entre os 16.384 motivos 7-meros que ocorrem nos 3’UTRs de transcritos de ARNm humanos, vários estão sobre-representados nas 3’UTRs de genes que diminuíram em células transfectadas transitoriamente com miR-337-3p imitar relação a um mímico controle negativo (Figura 2C), com apenas 10 motivos que mostra uma correlação negativa significativa entre os níveis de expressão de mRNA e sua presença em 3’UTRs (Figura 2D). 5 dos motivos correspondem à região a semente de um miARN conhecida (miR-337-3p), incluindo um motivo correspondente às bases de 2-8 e 4 correspondendo às posições 1-7 e 2-7, de acordo com recente trabalho sobre a região de sementes jogos [30], [31]. Curiosamente, descobrimos que um motivo (GUAGGAA) contém um G: U pares de bases na posição 7, sugerindo que os determinantes de alvos de miRNA podem incluir não-Watson: Crick complementaridade. A Figura 2E mostra que, embora muitos dos genes alvo identificados pelos motivos 5 sobreponham, os motivos adicionais 4 identificar alvos exclusivos. No geral, os resultados acima mostram que um número significativo de genes contendo putativos locais alvo miR-337-3p são down-regulada por miR-337-3p no nível de mRNA e destacar o valor de uma pesquisa abrangente de alvos de miRNA baseado em 7- mer complementaridade com a região da semente.

(a) os níveis de expressão de miR-337-3p após 72 h a transfecção de células NCI-H1155 com 50 nM de miR-337-3p mímico como medido por qRT-PCR. (B) Histograma de alterações no nível de expressão de mRNA como uma função de miR-337-3p sobre-expressão. As barras no show preto frequências relativas de log observada

2 mudanças dobra para todos os genes, enquanto os bares em vermelho mostram a distribuição de genes com 3’UTRs contendo pelo menos um 7-mer correspondente à semente de miR-337-3p região. (C) A trama paisagem significado para a 7-meros em todos os genes, ordenadas por alteração na expressão, a partir de mais diminuída para mais aumentada, mostrando 7-meros que são altamente enriquecida no 3’UTRs de genes que estão diminuídos em expressão. (D) Correlação entre a expressão de mRNA e conteúdo motivo da 3’UTRs induzidas por miR-337-3p sobre-expressão. Mostram-se: (1) o motivo 7-mer, destacada para mostrar complementaridade para miR-337-3p, (2) o coeficiente de regressão, (3) o valor de p, (4) o número de genes que contêm o motivo, (5 ) miARN a que corresponde o motivo, com as posições de nucleótidos totalmente complementares com as sequências realçadas na coluna 1 apresentados dentro de parêntesis, e o número de genes que (6) diminuição na expressão ou (7) aumento da expressão por vezes ≥2 . Na coluna 6, o número de genes que contêm o motivo listados, mas não contêm a sequência alvo semente de miR-337-3p canónica, é dado em parênteses. (E) proporcional de Venn diagrama, mostrando a relação entre os genes que diminuem ≥2 vezes na expressão e que contêm um ou mais dos cinco 7-meros correspondentes às sequências madura miR-337-3p.

STAT3

e

RAP1A Quais são os alvos diretos que medeiam o efeito de miR-337-3p na sensibilidade paclitaxel

Entre os genes regulada por miR-337-3p ,

RAP1A Comprar e

STAT3

, que são regulados negativamente em 60% e 63% em miR-337-3p sobre-expressão, respectivamente, são ambos previstos para ser alvos diretos de miR- 337-3p (Figura 3A) e estão potencialmente envolvidos na regulação da sensibilidade de paclitaxel. Para validar essas interações, construímos vetores repórter de luciferase contendo os 3’UTRs tipo selvagem de

STAT3

e

RAP1A

e dos correspondentes 3’UTRs controle com mutações nos primeiro e terceiro nucleotídeos do alvo sequências de locais (Figura 3A), que foram mostrados para ser crucial para perturbar interacções miARN alvo: [22]. Tal como mostrado na Figura 3B, o miR-337-3p sobre-expressão diminuiu significativamente a actividade de luciferase em células que expressam o tipo selvagem 3’UTRs, em comparação com nenhum 3’UTR ou mutadas 3’UTRs, demonstrando que o miR-337-3p interage directamente com específica sites nos 3’UTRs de

STAT3

e

RAP1A

. A Figura 3C mostra que o efeito de miR-337-3p sobre os níveis dos dois genes de expressão de ARNm é acoplado com a sub-regulação dos níveis de expressão de proteína endógena em células H1155. Examinámos ainda mais o efeito de sobre-expressão de miR-337-3p sobre os níveis de STAT3 e RAP1A em H1993, uma linha de células NSCLC que é definido como o paclitaxel-resistente, com um indefinido IC

50. Tal como acontece com as células H1155, miR-337-3p também sub-regula os níveis de STAT3 e RAP1A em ARNm e os níveis de proteína em células H1993, como mostrado na Figura 3D. Estes resultados sugerem que miR-337-3p tem um efeito regulador geral sobre STAT3 e expressão RAP1A em células de câncer de pulmão.

(A) miR-337-3p e sua interação prevista com sites de destino em

RAP1A Comprar e

STAT3

. São mostradas as estruturas e sequências do miRNA: interações alvo para miR-337-3p e os 3’UTRs de

RAP1A

e

STAT3

, e a energia livre previsto de hibridização. A sequência de semente é destacada em vermelho. Bases alterados por mutagénese dirigida ao local estão sublinhados. ensaio de repórter (B) da luciferase. células NCI-H1155 foram co-transfectadas com os oligos indicados e os vectores repórter de luciferase. actividades de luciferase e β-galactosidase foram medidos após 72 h, com a actividade da luciferase normalizada para a actividade de p-galactosidase. (C) A expressão do

RAP1A

e

STAT3

níveis de mRNA e proteína após 72 h de transfecção de células NCI-H1155 com 50 nM de miR-337-3p, 25 nM de ARNsi dirigido contra cada de os genes ou oligonucleótidos de controlo negativo. São mostrados os resultados médios qRT-PCR de três transfecções independentes e imagens de Western blot representativos e quantificação das intensidades de banda. (D)

RAP1A

e

STAT3

mRNA e expressão de proteínas em células NCI-H1993. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P . 0.001

A fim de avaliar se

STAT3

e

RAP1A

mediar o efeito de miR-337-3p na sensibilidade paclitaxel, nós derrubado cada gene individual e ambos juntos. A Figura 4A mostra que o knockdown de

STAT3

e

RAP1A

aumentou a sensibilidade das células NCI-H1155 para o tratamento com paclitaxel, em comparação com os oligos controlo, mas não afectou significativamente a sobrevivência celular na ausência de paclitaxel . A combinação dos dois siRNAs na metade da concentração leva a uma maior diminuição da viabilidade celular do que o observado apenas com tanto siRNA (p = 0,017 para

RAP1A Comprar e p = 0,041 para

STAT3

), o que sugere que o knockdown combinada tem um efeito sinérgico sobre a resposta de paclitaxel (Figura 4B). Além disso, a Figura 4C mostra que knockdown de

STAT3

ou

RAP1A

aumenta significativamente a G

2 /M detenção sob paclitaxel tratamento, em comparação com oligos de controlo, com normalizada G

2 /G

1 rácios de R = 3,02 e R = 3,70, respectivamente, em relação aos R = 1,93 para os controles e comparáveis ​​para R = 4,37 para a transfecção com o miR-337-3p mímica.

( a) Efeito do knockdown de

RAP1A

e

STAT3

expressão por siRNA na viabilidade das células na presença e ausência de paclitaxel. Mostrados em vermelho é a viabilidade celular em 16 nM paclitaxel normalizados para a viabilidade no portador como uma função de concentrações crescentes de siRNAs contra

RAP1A

ou

STAT3

. Mostrado em preto é a viabilidade celular na ausência de paclitaxel. (B) Efeito do knockdown combinado de

RAP1A

e

STAT3

na sensibilidade paclitaxel. É mostrada a viabilidade celular relativa na presença de 16 nM de paclitaxel normalizado para controlar os oligos. (C) Queda da STAT3 e RAP1A aumenta

2 /H prisão induzida por paclitaxel G como medido por citometria de fluxo. A razão (R) da L

2 a G

1 sub fracções induzidas por tratamento com paclitaxel foi determinado como anteriormente. (D) A viabilidade celular como uma função da concentração de oligo (miR-337-3p mímico de controlo negativo ou imitador) na presença de cucurbitacina. *, P . 0,05

A evidência crescente suporta a aplicação de inibidores da STAT3, como cucurbitacina, como agentes terapêuticos no tratamento de vários cancros. Portanto, testaram o efeito de miR-337-3p sobre-expressão na resposta de células NCI-H1155 ao tratamento com cucurbitacina, a citotoxicidade dos quais é, pelo menos parcialmente, com base na inibição da actividade de STAT3 [32], [33]. Como mostrado na Figura 4D, mímica miR-337-3p sensibiliza células para cucurbitacina, diminuindo o IC

50 de 1,14 jiM (IC de 95% 1,03-1,28) a 0,37 | iM (95% CI 0,33-0,42) (p 0,0001), indicando que a segmentação ambos

expressão STAT3

com a ativação mímica e STAT3 miR-337-3p com cucurbitacina tem um efeito sinérgico sobre a sobrevivência da célula cancerosa, e sugerindo que miR-337-3p também pode servir como um adjuvante para inibidores da STAT3.

miR-337-3p sensibiliza linhas celulares de paclitaxel-sensíveis e resistentes a paclitaxel, bem como aqueles a partir de diferentes subtipos histológicos

de modo a testar a generalidade dos efeitos do