Abstract

Fundo

p63 é um membro da família p53 que tem sido implicada na manutenção de células-tronco epiteliais compartimentos. Estudos anteriores demonstraram que p63 é regulada negativamente em cancros da bexiga músculo-invasivo, mas a relação entre a expressão da p63 e sobrevivência não é clara.

Metodologia /Principais Achados

Usamos PCR em tempo real para caracterizar expressão p63 e vários genes implicados na epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) em linhas celulares de cancro da bexiga humano (n = 15) e os tumores primários (n = 101). Nós correlacionados expressão do marcador do tumor com, específica doença em estágio (DSS) e sobrevida global (OS). A expressão de E-caderina e p63 estão directamente correlacionados com uma outra e inversamente com a expressão do mesenquimais marcadores Zeb-1, 2-Zeb, e vimentina. cancros da bexiga não-invasiva do músculo (Ta e T1) expresso uniformemente elevados níveis de E-caderina e p63 e baixos níveis dos marcadores mesenquimais. Curiosamente, um subconjunto de músculo-invasiva (T2-T4) tumores mantidos níveis elevados de E-caderina e p63. Como esperado, houve uma correlação altamente significativa entre a expressão do marcador de EMT e invasão do músculo (p 0,0001). No entanto, OS foi menor em pacientes com tumores músculo-invasivo que retidos p63 (p = 0,007).

Conclusões /Significado

Os nossos dados confirmam que os marcadores moleculares de EMT são elevados no músculo-invasivo cancros da bexiga, mas, curiosamente, a retenção do “epitelial” p63 marcador em tumores músculo-invasiva está associada a um pior resultado

Citation:. Choi W, Shah JB, Tran M, Svatek R, Marquis L, Lee IL, et ai. (2012) p63 expressão define um subconjunto letal de cancros da bexiga músculo-invasivo. PLoS ONE 7 (1): e30206. doi: 10.1371 /journal.pone.0030206

editor: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de julho de 2011; Aceito: 12 de dezembro de 2011; Publicado: 10 Janeiro, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Cancer Support Center Grant (CA016672) e do MD Anderson Cancer SPORE no Genitourinary (CA091846). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancros da bexiga desenvolver ao longo de duas “faixas” produzir tumores com diferentes características clínicas [1]. Um conduz à formação de tumores papilares com altas taxas de recorrência que raramente metastatizam ou podem causar a morte, enquanto que a outra conduz ao desenvolvimento de tumores não-papilar, músculo-invasiva, das quais um subconjunto progride rapidamente e é fatal. Actualmente, é impossível identificar prospectivamente os tumores músculo-invasivo letais; no entanto, evidências acumuladas sugerem que a característica de reprogramação molecular de um processo de desenvolvimento conhecido como epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é envolvido. cancros músculo-invasivo são caracterizados pela regulação negativa da E-caderina e p63, dois marcadores “epiteliais” uniformemente expressos em urotélio normal e em cancros não músculo-invasivo [2] – [5]. Estas mudanças são acompanhadas por supra-regulação de marcadores mesenquimais Zeb-1, 2-Zeb, vimentina, e MMP9, levando ao aumento da migração e invasão. Um papel para EMT em dirigir a progressão do cancro da bexiga e metástases é consistente com um grande corpo de evidência emergente em outros tumores sólidos, especialmente cancro da mama [6] – [8]. Além disso, a expressão forçada de reguladores EMT pode causar alterações que lembram aqueles observados em células-tronco cancerosas [8] – [10]. Como as células-tronco do câncer aparecem geralmente para ser resistentes à quimioterapia convencional, a ligação entre EMT e “stemness” fornece suporte adicional para a ideia de que EMT contribui para letalidade.

Nós iniciou o estudo para testar diretamente a hipótese de que marcadores EMT poderia identificar o subgrupo de tumores músculo-invasivo que apresentam comportamento clínico agressivo. Em linhas celulares de cancro da bexiga humanos, observou-se uma correlação direta entre E-caderina e p63, e uma correlação inversa entre esses marcadores e Zeb-1, Zeb-2 e vimentina, indicando que eles aglomeram em “epitelial” original e “mesenquimais “subconjuntos. Nossos dados confirmam que os marcadores mesenquimais (Zeb-1, Zeb-2, MMP, e vimentina) são expressos quase exclusivamente por tumores músculo-invasivo [11], [12], o subconjunto de cancro de bexiga com pior resultado. Curiosamente, os nossos dados demonstram também que dentro deste subconjunto músculo-invasivo, tumores p63 retenção (que parece ser um marcador de “epitelial”), visor significativamente pior sobrevivência do que os tumores do músculo-invasivo que exibem um fenótipo mais típico “mesenchymal”. Discutimos possíveis explicações para a ligação entre p63 e os resultados de sobrevivência pobres.

Resultados

expressão de marcadores de EMT em conjuntos de dados de expressão de genes publicados

Em primeiro lugar, examinaram a expressão de marcadores de EMT em dois conjuntos de dados de perfis de expressão gênica publicamente disponíveis [13], [14]. Em ambos, agrupamento hierárquico não supervisionado distinguido superficial da doença muscular invasiva [13], [14]. Os tumores superficiais expressa níveis mais elevados de “epitelial” marcador de E-caderina do que os tumores músculo-invasivo; Por outro lado, os tumores músculo-invasivo expressaram níveis mais elevados de marcadores “mesenquimais” (Figura 1A-B)

A B: Todos os genes marcadores de EMT com diferenças significativas na expressão (P 0,001) em 2 conjuntos de dados independentes disponíveis publicamente. Um cDNA microarray em casa com 10368 sondas foi usado em um [13]. A plataforma HU-133A Affymetrix foi usado em B [14].

Relações entre marcadores EMT em linhas celulares de cancro da bexiga humana

A seguir, mediu a expressão de marcadores de EMT em 15 de bexiga linhas celulares de cancro por quantitativa PCR em tempo real. Os resultados sugerem a existência de 2 subconjuntos dicotômicas de tumores, uma mostrando um padrão de “epitelial”, caracterizado pela expressão de E-caderina e p63; o outro, caracterizado pela expressão de marcadores “mesenchymal” Zeb-1, 2-Zeb, e vimentina (Figura 2A-B). A quantificação de ambas mRNA de p63 (Figura 2B) e proteína (dados não mostrados), os níveis demonstrou-se exclusivamente expressa pelos, “epitelial” linhas de células-E-caderina positiva, e que a expressão das isoformas ΔN-p63 excedidos expressão da TA isoformas -p63 por várias ordens de grandeza (Figura 2B). Contrariamente às nossas expectativas, os níveis de MMP2 e MMP9 não estavam intimamente associados com EMT em nossas linhas de células (Figura 2C); No entanto, o pequeno número de linhas de células para as quais os MMPs foram elevados impactos o significado desta observação. Importante, estudos anteriores concluíram que “mesenchymal” células de cancro da bexiga são como grupo altamente invasiva e resistente à radiação e terapia dirigida por EGFR [11], [12], [15] – [17], sugerindo que eles podem possuir características biológicas desfavoráveis .

(A), a expressão de ARNm da e-caderina, Zeb-1, 2-Zeb e vimentina foram medidos por quantitativa PCR em tempo real. Uma correlação inversa entre a E-caderina e Zeb-1 /Zeb2 foi observada entre as linhas de células. (B) a expressão de ARNm de p63 total e TAp63 ΔN-p63 isoformas foram medidos por iniciadores específicos das isoformas. (C) a expressão do mRNA relativo de MMP2 e MMP9 em células de cancro da bexiga. Os dados apresentados são a média ± SEM de amostras em triplicado.

expressão EMT marcador em um novo tumores conjunto bexiga

Em seguida, mediram a expressão gênica de marcadores EMT por RT-PCR em vesical primário cancros (n = 101, Tabela 1). Consistente com os dados públicas (Figura 1) e outros relatórios [11], [12], os dados de PCR em tempo real, revelou que os tumores superficiais expressaram níveis mais elevados de marcadores epiteliais de E-caderina e p63, ao passo que os tumores de músculo-invasiva expressaram níveis mais elevados de mesenquimal marcadores (vimentina, Zeb1, Zeb2, MMP2, MMP9) (Figura 3 A e B). Como mostrado na Figura 3, tumores superficiais como um grupo expresso de forma mais consistente de E-caderina e p63 [3], [4], [18] – [23] do que os tumores do músculo-invasiva (p-valor 0,0001, Figura S1A) . Da mesma forma para a linha de células de dados, ΔN-p63 foi a principal isoforma de p63 presente no tecido do tumor primário (Figura 3C). Por outro lado, os tumores músculo-invasivo mais freqüentemente expressa os marcadores mesenquimais (Zeb-1, Zeb-2, vimentina) do que os tumores superficiais (todos os três valores p 0,0001, Figura s1b). Como tínhamos observado em linhas celulares, expressão da caderina-E foi diretamente associado com a expressão da p63 (Spearman rho coeficiente de correlação = 0,32, p = 0,0028) e inversamente com a expressão de Zeb-1 (rho = -0,37, p 0,0001) , Zeb-2 (rho = -0,48, p 0,0001), e vimentina (rho = -0,49, p 0,0001). Por outro lado, apesar de MMP2 e MMP9 também foram expressos em níveis mais elevados nos tumores músculo-invasivo em comparação com tumores superficiais (ambos os valores de p 0,0001, Figura S1C), não observamos como fortes correlações entre a expressão de MMP2 e MMP9 e expressão da p63 em qualquer do conjunto global de tumores (Rho de Spearman = -0,17, p = 0,08, entre p63 e MMP9, e rho = -0,24, p = 0,01 entre a p63 e MMP2), ou no sub-grupo de pacientes músculo-invasivo (rho = -0,15, p = 0,21, entre p63 e MMP9, e rho = -0,23, p = 0,065 entre p63 e MMP2). No entanto, uma forte correlação inversa entre a E-caderina e MMP9 e MMP2 ainda foi mantida (rho = -0,46, p 0,001 com MMP9, rho = -0,38, p 0,001 com MMP2) na totalidade do grupo, e as mesmas associações foram observados em pacientes musculares-invasiva (rho = -0,45, p 0,001 com MMP9; rho = -0,39, p = 0,002 com MMP2).

(a) Expressão de marcadores núcleo EMT-e-caderina relacionada (e-caderina, p63, Zeb-1, e Zeb-2) em 101 tumores primários da bexiga foi avaliada por quantitativa PCR em tempo real. (B) A expressão de MMP2, MMP9, e vimentina. (C) A expressão da TAp63 e ΔN-p63 num subconjunto representativo das amostras. Todas as amostras em cada figura são mostrados na mesma ordem.

p63 Superior e MMP9 estão associados com OS adversos em pacientes com doença muscular invasiva

Finalmente, correlacionados a expressão do marcador de EMT como medido por RT-PCR com a sobrevivência. Uma vez que, como um grupo, os doentes com tumores superficiais sobrevivem mais tempo do que aqueles com tumores músculo-invasiva, a expressão de um fenótipo de EMT caracterizada por perda de E-caderina e p63 foi associada com um prognóstico pobre, em grande parte como um resultado da capacidade de estratificar pacientes entre doença superficial e músculo-invasiva (dados não mostrados). No entanto, quando confinados ao subconjunto músculo-invasiva de tumores, verificou-se que a retenção de expressão de p63 foi associada com resultado negativo (Figura 4A-B). O ponto de corte para a elevada p63 1,60 foi obtido utilizando análise de árvore de regressão. Especificamente, p63 elevada foi associada com uma sobrevida média significativamente pior de 8 meses (95% intervalo de confiança de 4, 140 meses), enquanto os pacientes com baixos níveis de p63 tinha um OS mediana melhoria de 27 meses (IC 95% de 17, 85 meses, log-rank p = 0,007). As análises dos resultados para os resultados de DSS foram semelhantes aos resultados para OS. p63 elevado foi associado com um DSS mediana de 8 meses com um intervalo de confiança de 95% de (19, 140) meses, enquanto os pacientes com baixos níveis de p63 tinha um DSS mediana melhoria de 41 meses (95% CI: 19, 140 + meses , log-rank valor p = 0,004). Mesmo neste grupo músculo-invasiva, a manutenção de p63 estão directamente correlacionados com a expressão de marcadores epiteliais (RHO E-caderina = 0,34, p = 0,006), e inversamente com marcadores mesenquimais (vimentina: rho = -0,35, p = 0,0047; zeb -1: rho = -0,36, p = 0,003; e Zeb-2: rho = -0,39, p = 0,0014; respectivamente). Curiosamente, retenção de p63 em pacientes classificados como tendo tumores T1 também foi associado com resultados desfavoráveis ​​significativas sobrevivência. Pacientes com doença T1 com maiores níveis de p63 tinha uma sobrevida média de 58 meses, ao passo que não houve mortes relacionadas com a doença em pacientes com baixos níveis de p63 neste subconjunto (dados não mostrados).

Todos os p- os valores fornecidos são 2 faces, utilizando o teste de log-rank. A: p63 elevada foi associada com resultados adversos em pacientes com músculo-invasivo cancro (OS mediana de 8 meses, 95% intervalo de confiança 4, 140 meses), como comparar a diminuir a expressão de p63 (OS mediana de 27 meses, 95% IC de 17 , 85 meses) log-rank p = 0,007. B: Elevado p63 foi associada com DSS adversos em pacientes com câncer músculo-invasivo (DSS mediana de 8 meses, 95% IC 19, 140), enquanto os pacientes com baixos níveis de p63 tinha uma melhorada DSS mediana de 41 meses (IC 95% 19 , mais de 140 meses, log-rank p = 0,004). C: Elevado MMP9 foi associado com resultado adverso (OS mediana de 10,2 meses, 95% i4.9 CI, 26,6) em comparação com menor MMP9 (OS mediana 35,4 meses, IC 95% 19,3, 107,9, p = 0,003). D: Elevated MMP9 foi associada com DSS adverso (mediana de 10,3 meses, IC de 95%: 4,9, 140 +), em comparação com inferior a MMP9 (DSS mediana 140, 95% CI: 19,3, 140+ meses, p = 0,01). E (OS) e F (DSS): Usando um modelo de regressão multivariada Cox, p63 e MMP9 foram preditores independentes de resultado adverso na doença muscular invasiva. Os doentes foram distribuídos 1 ponto cada para qualquer p63 elevada ou MMP9 (0 = nem elevado, a 1 = seja elevado, a 2 = ambos elevada). Pior sobrevida foi observada quando ambos os marcadores foram elevados, e melhor quando nem foi elevada (OS mediana para 0, 1, ou 2: = 69, 10 meses e 8 meses, com um sistema operacional de 5 anos ou 55%, 8 % e 0%, respectivamente).

Em um estudo anterior que mostrou que uma baixa relação e-caderina /MMP9 também foi associado com um resultado adverso sobrevivência. Portanto, nós também avaliou a relação entre a expressão MMP9 e OS nesta coorte (Figura 4C e D). Consistente com os dados anteriores, a expressão de alto nível de MMP9 foi associado a menor SO (OS mediana de 10,2 meses, IC de 95% 4,9, 26,6) em comparação com os tumores que expressam quantidades inferiores da MMP9 (OS mediana 35,4 meses, 95% IC 19,3, 107,9, p = 0,003, Figura 4C). Da mesma forma o DSS mediana foi menor com a expressão de alto nível de MMP9 (mediana DSS 10,3 meses, IC de 95% 4,9, 140 + meses) e em comparação com aquelas que expressam quantidades inferiores da MMP9 (DSS mediana 140, 95% IC 19,3, 140+ meses, p = 0,01, Figura 4D).

Nós também confirmou a associação entre p63 elevada e baixa sobrevida no câncer urotelial músculo-invasivo utilizando um conjunto de dados gene-expressão independente (GEO número Adesão GSE13507 [24]) usando a análise de regressão-tree, obteve-se o ponto de corte para a elevação p63. p63 elevado foi associado com um sistema operacional significativamente pior e DSS (log-rank p = 0,012 e 0,002, respectivamente, a figura S2). Tentativas adicionais na confirmação de tecido, utilizando imuno-histoquímica em câncer de bexiga microarray tecido muscular invasiva foram inconclusivos, em grande parte como resultado da falta de especificidade do anticorpo 4A4 comercialmente disponível para ΔN-p63, um achado também confirmado por um grupo externo [25].

p63 e MMP9 são preditores independentes de oS

Um modelo de regressão multivariada de Cox foi utilizado para avaliar simultaneamente o efeito de expressão de dois ou mais marcadores de EMT por RT-PCR e estágio da doença no oS. Não é surpreendente que o estágio da doença foi um preditor estatisticamente significativo de OS (HR = 2.15 invasiva vs. superficial, p = 0,05). Curiosamente, tanto p63 contínua e MMP9 foram preditores independentes de OS (p63: HR = 1,69 para p63, p = 0,004, MMP9 log: HR = 1,25, p = 0,013), além de estágio da doença entre todos os 101 pacientes. Outras expressões marcadores não foram associados com o resultado OS no modelo multivariado. Apesar de incluir outras características do tumor, incluindo presença /ausência de histologia escamoso, estágio da doença, e da idade no momento do diagnóstico no modelo de regressão multivariada, tanto p63 eo log de MMP9 permaneceram como preditores independentes de OS (p63: HR = 1,54, p = 0,017 ; log-MMP9: HR = 1,26, p = 0,011). Ambos p63 ea transformação log de MMP9 também foram preditores independentes de DSS (p63: HR = 2,04 para p63, p = 0,0006, registro MMP9: HR = 1,31, p = 0,006), além de estágio da doença entre todos os 101 pacientes. Incluindo a presença /ausência de histologia escamoso, estágio da doença, e da idade no momento do diagnóstico no modelo de regressão multivariada, tanto p63 eo log de MMP9 permaneceram como preditores independentes de DSS (p63: HR = 1,63, p = 0,022; log-MMP9: HR = 1,35, p = 0,003). Quando restringimos o nosso marcador multivariada aos tumores músculo-invasiva (n = 67, a partir das 101 amostras usadas em RT-PCR), a mesma tendência, mas aumentaram ligeiramente as taxas de risco para OS com foi observado tanto p63 e MMP9 (p63: HR = 2,17, p = 0,0003; log-MMP9: HR = 1,31, p = 0,007), sugerindo que ambos p63 e MMP9 são preditores independentes de sobrevivência adverso na doença muscular invasiva. A mesma tendência também foi observada com taxas de risco levemente maior de DSS (p63: HR = 2.40, p = 0,0018; log-MMP9: HR = 1,37, p = 0,003) em comparação com o OS. Atribuindo pacientes um ponto para cada um quer a expressão elevada de p63 ou MMP9 (0 = não elevada, 1 =, quer elevada, 2 = tanto elevada), sobrevivência estratificada com o pior sobrevivência quando ambos eram elevados (Figura 4E e F), e a melhor sobrevivência quando nem foi elevada (OS mediana para 0, 1, ou 2: = 69, 10 meses e 8 meses, com um sistema operacional de 55%, 8% e 0% em 5 anos, respectivamente). Riscos Proporcionais pressupostos para cada fator de risco está satisfeito no modelo de regressão, quer para 67 pacientes músculo-invasivo, ou 101 pacientes com câncer de bexiga primário.

Discussão

Estudos anteriores concluíram que a perda de p63 é associado com menor sobrevida em pacientes com câncer de bexiga [3], [20]. Em contraste, os nossos resultados sugerem que a manutenção da expressão p63 está associada a resultados adversos em pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo. Na superfície os nossos resultados parecem contradizer estes outros estudos. No entanto, nós suspeitamos que essa aparente discrepância é devida em parte à inclusão de cânceres superficiais exibindo uniformemente boas características de sobrevivência nas análises anteriores, em oposição ao nosso foco atual sobre o seu impacto na doença muscular invasiva. Como um grupo, os cancros da bexiga mais superficiais têm excelente sobrevivência a longo prazo (perto de 100%), e altos níveis uniformemente expressas do E-caderina e p63. Por outro lado, a perda de p63 é restrito a um subconjunto dos tumores músculo-invasivo, e doença músculo-invasiva é tipicamente associada com piores resultados clínicos, em comparação com o cancro superficial, não-invasiva. Por conseguinte, a inclusão de tumores superficiais uniformemente exibindo um fenótipo “epitelial” poderia diluir um efeito adverso de um fenótipo “epitelial” na coorte de músculo-invasiva. Além disso, o anticorpo comercial (4A4), que é mais comumente usado para medir p63 em cortes de tecidos não pode distinguir as duas principais isoformas p63 (TA e ΔN), de modo que a relação entre a expressão ΔN p63 e os resultados pobres em cancros da bexiga músculo-invasivo poderia não ser reconhecidos com base em estudos-IHC anteriores que utilizaram este reagente [4], [20]. Buscou-se confirmar os nossos resultados baseados em ARNm utilizando o 4A4 em microarrays de tecido e os resultados foram inconclusivos (dados não mostrados). Consistente com esta conclusão, enquanto o nosso manuscrito estava sendo preparado para o grupo de submissão Cordon-Cardo gerado um anticorpo anti-p63, que é específico para as isoformas ΔN e é usado em uma coorte independente de tumores músculo-invasivo para mostrar que os níveis de proteína ΔN p63 também identificar um subconjunto letal de cancros, ao passo que os seus resultados com o anticorpo 4A4 foram inconclusivos [25]. Em última análise, serão necessários estudos prospectivos para testar rigorosamente o significado clínico destes resultados.

Trabalho realizado ao longo dos últimos 5 anos renovou o interesse no papel de EMT na progressão e metástase do câncer. Um estudo demonstrou que o influente variantes metastáticas isogénicas de uma linha celular de cancro da mama murino sobre-expressa o repressor de E-caderina, torção, e que a expressão elevada torção foi necessária para metástase [7]. Os trabalhos posteriores demonstraram que a expressão torção aplicada em células epiteliais mamárias normais desencadeada EMT e expressão simultaneamente regulada de marcadores de células-tronco do câncer mamário [26]. Estudos paralelos por outros reforçaram a noção de que a EMT impulsiona a progressão do tumor, metástase, resistência a drogas, e um “tronco-como” fenótipo [10], [27]. No que diz respeito aos cancros da bexiga, estudos recentes EMT implicada na progressão da doença, invasão /migração, e a resistência à radiação e terapia-alvo [11], [12], [15] – [17]. Com estas observações em mente, espera-se que medir a expressão do marcador EMT iria identificar o subconjunto mais letal de cancros da bexiga músculo-invasivo. Nossos resultados confirmam que os marcadores EMT foram elevados em cancros músculo-invasivo. Surpreendentemente, no entanto, o aumento da expressão de p63 foi associada com efeitos adversos tanto no músculo-invasiva e em tumores T1.

Vários estudos recentes têm demonstrado que EMT e “radical do tipo” fenótipo é regulada por micro RNAs (miR- 205 e miR-200 família) [28] – [31]. miR-205 e a família de miR-200 pode manter o fenótipo epitelial através da supressão da expressão de factores mesenquimais de transcrição (Zeb-1 e SIP1) e a introdução de miR-205 e miR-200 em células mesenquimais podem reverter a morfologia das células mesenquimais para uma fenótipo epitelial [30]. Curiosamente, descobrimos recentemente que ΔNp63 promove diretamente a expressão miR205 (M. Tran, manuscrito em preparação), fornecendo uma explicação para a estreita correlação entre a expressão de ΔNp63 e marcadores epiteliais em linhas celulares de cancro da bexiga e tumores primários.

também estamos investigando os efeitos da ΔNp63 sobre a biologia de células de câncer de bexiga, a fim de entender melhor por que sua expressão se correlaciona com a sobrevivência pobre paciente. Embora estruturalmente semelhante a p53, p63 é filogeneticamente mais velhos do que seu primo e exibe muito maior inter-espécies de conservação [32], [33]. Além disso, mesmo que p53 e p63 interagir com motivos de sequências de ADN semelhantes, a maioria das isoformas de p63, não transactivar genes alvo p53 mas sim pode funcionar como negativos dominantes supressores de transactivação dependente de p53 [33]. P63 é expresso em níveis elevados nas camadas basal contendo os compartimentos de células estaminais normais em muitos tecidos epiteliais diferentes, incluindo o urotélio. ablação alvo de expressão p63 perturba diferenciação normal da bexiga em ratos, levando à perda da camada basal /suprabasal com retenção seletiva de células chamadas “guarda-chuva” [34]. Estas observações levaram muitos investigadores a propor que a p63 é essencial para a manutenção de auto-renovação e /ou sobrevivência de células estaminais normais [35]. Assim, a expressão de p63 na doença músculo-invasiva pode ser associada tanto fenótipo epitelial e “stemness” [36] – [38]. No entanto, as células dentro do urotélio normal de expressar TAp63 (não ΔNp63), o que seria esperado ter efeitos muito diferentes na biologia celular. Surpreendentemente, os nossos estudos preliminares indicam que o knockdown de ΔNp63 estável em células cancerosas da bexiga provoca uma forte inibição de proliferação, os efeitos que estão associados com downreguliation de ARNm de c-Myc e a expressão de proteína (L. Marquis et ai, manuscrito em revisão), Portanto, Atualmente favorecer a ideia de que o significado de ΔNp63 como um marcador de prognóstico negativo está relacionada com os seus efeitos sobre a proliferação de células tumorais. estudos sobre os mecanismos adicionais são necessários para definir as relações entre o fenótipo EMT, “stemness”, a proliferação, a sensibilidade de drogas e metástases em modelos pré-clínicos e tumores primários.

Conclusões

Superficial (não músculo- invasivos) tumores expressam níveis mais elevados dos marcadores epiteliais e-caderina e p63, enquanto os tumores músculo-invasivo têm maior expressão de marcadores mesenquimais Zeb1, Zeb2, vimentina, MMP2 e MMP9. No entanto, há um subconjunto de cancro músculo-invasivo que tem um prognóstico desfavorável na definição de expressão p63 elevada. Esta elevação da p63 está associada com a expressão retida de E-caderina e diminuição dos níveis de marcadores mesenquimais incluindo vimentina, Zeb1 e Zeb2, sugerindo que o acoplamento entre a expressão da p63 e o fenótipo “epitelial” permanece presente num subconjunto de cancros de músculo-invasiva. expressão MMP9 parece ser independente da p63 na previsão de resultados adversos, sugerindo regulação por mecanismos independentes. Os mecanismos moleculares de condução invasão muscular em tumores que apresentam um fenótipo “epitelial” eo papel da EMT na capacidade de resposta a quimioterapia e metástase precisa ser mais bem explorado em estudos futuros.

Materiais e Métodos

Usando conjuntos de dados de expressão de genes públicas verificou-se se a diminuição da expressão do “epitelial” marcador de e-caderina e aumento da expressão de vários marcadores “mesenquimais” (os repressores e-caderina Zeb-1, Zeb-2, e twist, a matriz de metaloproteases MMP2 e MMP9 , fibronectina e vimentina) foi associada com a progressão para o músculo-invasão. Em seguida, usamos um painel de linhas celulares de cancro da bexiga para determinar se a expressão de “epitélio” e “mesenquimais” marcadores eram mutuamente exclusivas exibindo “epitelial” distinta e fenótipos “mesenquimais”. Usando quantitativa PCR em tempo real foi testado se a relação entre EMT e doenças músculo-invasivo estava presente em uma nova coorte de pacientes com câncer de bexiga e de expressão EMT marcador correlacionado com a sobrevivência.

Análise de EMT Marcadores em Gene Pública perfil de expressão conjuntos de dados

Dois conjuntos de dados humanos públicas expressão do gene do cancro da bexiga foram utilizados para analisar marcadores EMT. Os dados de Blavari et al e Carbayo et al foram baixados do Gene Expression Omnius (número GEO Adesão GSE-1827 [13]) e no Journal of Clinical Oncology [14], respectivamente. BRB ArrayTools versão 4.2, desenvolvido pela NCI [39] foi usado para analisar os dados [13], [14]. Para seleccionar os genes expressos diferencialmente entre os dois sub-grupos diferentes (tumores superficiais e músculo-invasivo), uma ferramenta de comparação classe dentro BRB ArrayTools foi usada para calcular a significância das observações (isto é:

P

0,001 computada a partir de duas amostras teste t com uma taxa de descoberta de falsas (FDR) menor do que 0,1). Para observar os padrões de expressão genética EMT, o valor de cada gene, ajustado para uma média de zero, foi usada para o agrupamento com Cluster e TreeView [40].

As linhas celulares

As linhas celulares foram obtidos a partir de o MD Anderson bexiga SPORE Tissue Bank, e suas identidades validado pela impressão digital de DNA usando AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems, Foster City, CA) ou AMPF

l

STR® Profiler ™ PCR de amplificação (Applied Biosystems), realizada pelo MD Anderson Caracterizado Linha celular do núcleo, ou nos, respectivamente. Estas impressões digitais estão disponíveis no site do MD Anderson bexiga SPORE. As linhas celulares foram cultivadas em MEM de Eagle modificado suplementado com 10% de soro fetal bovino, vitaminas, piruvato de sio, L-glutamina, penicilina, estreptomicina e aminoácidos não essenciais a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora.

espécimes humanos

dados os resultados clínicos e amostras de pacientes para PCR em tempo real foram obtidos para 101 pacientes do banco de dados de pesquisa cânceres do trato geniturinário MD Anderson. tecidos congelados frescos foram obtidos a partir de nosso Core SPORE Tissue. As amostras foram coletadas usando macrodissection concentrando-se em áreas com concentração de tumor, pelo menos, 80%. Todos os pacientes já tinham assinado consentimento informado permitindo coleção de seus tecidos e dados clínicos em nosso banco de dados de pesquisa geniturinário. Um protocolo IRB aprovado adicional foi obtido para a análises específicas descritas neste documento. Todas as amostras de tecido foram revisadas por um patologista. Os doentes foram classificados como músculo-invasivo para o crescimento do tumor para dentro da muscularis propria; caso contrário, eles foram classificados como superficial (não músculo-invasivo). O ARN total a partir de amostras humanas foram isoladas utilizando o kit de isolamento miRvana ™ miARN (Ambion, Inc).

baseada em Taqman em tempo real A análise de PCR de Transcriptase Reversa

EMT marcadores foram analisados ​​por PCR em tempo real (ABI PRISM 7500; Applied Biosystems). O método comparativo CT [41] foi utilizada para determinar a expressão do gene relativo para cada gene alvo; a ciclofilina Um gene foi o controlo interno utilizado para normalizar a quantidade de ARN amplificável (números Ensaio ID: E-caderina; Hs00170423_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, ZEB2; Hs00207691_m1, vimentina; Hs00185584_m1, MMP2; Hs00234422_m1, MMP9; Hs00957562_m1 e ciclofilina A; Hs99999904_m1). Os iniciadores e sondas fluorescentes para p63 isoformas foram concebidos por Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) com as seguintes sequências: TAp63 iniciador directo 5′-TGCAGGACTCGGACCTGAGT-3 ‘, o iniciador inverso 5′-TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3′, 5’-sondas ACCCCATGTGGCCAC-3 ‘; ΔN-p63 iniciador directo 5′-GGAAAACAATGCCCAGACTCA-3, sondas de 5′-TTTAGTGAGCCACAGTACAC-3 ”, iniciador 5’- TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3 reverter ‘. Primers e sondas para isoformas p63 foram validados utilizando métodos da curva padrão (dados não mostrados).

métodos estatísticos

As análises estatísticas foram baseadas em informações de 101 pacientes. Os objetivos primários foram para examinar as correlações entre a expressão do marcador e estágio da doença, e avaliar a associação entre a expressão do marcador e sobrevida global (SG) e sobrevida específica da doença (DSS). estágio da doença foi estratificada como superficial (Ta ou T1) ou músculo-invasivo ( = T2). valores de expressão foram comparados entre o câncer de bexiga superficial e músculo-invasivo utilizando o teste de Wilcoxon. Correlações entre a expressão de marcadores foram quantificados utilizando coeficientes de Rho de Spearman. A estimativa de Kaplan-Meier de distribuição sobrevivência foi exibido pela expressão investigaram biomarcador caracterizado como alta e baixa (por exemplo, p63, MMP9), onde o ponto de corte para definir alto e baixo foi obtido a partir de análises de regressão árvore [42]. O teste de log-rank foi utilizado para comparar distribuições de sobrevivência entre os grupos. O modelo de riscos proporcionais foi utilizado para avaliar os efeitos de vários marcadores e estágio do tumor em DSS e OS. Foi realizada uma transformação logarítmica dos valores de expressão de MMP9 devido à skewedness dos dados. Todos os valores de p apresentados são 2 faces.

Informações de Apoio

Figura S1.