Abstract

Fundo

O câncer de próstata (PCA) é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em homens norte-americanos. terapia de privação de androgênio (ADT) acentua a infiltração de células imunitárias no interior da próstata. No entanto, as vias imunossupressores regulados por androgénios no CaP não estão bem caracterizados. 2 arginase expressão (ARG2) por células CaP conduz a uma activação reduzida das células T específicas do tumor. Nossa hipótese era que os andrógenos poderia regular a expressão de ARG2 por células APC.

Metodologia /Principais Achados

Neste relatório, nós demonstramos que tanto ARG1 e ARG2 são expressos por hormônio sensível-(HS ) e (linhas HR) de células CaP hormônio-refratário, com as células LNCaP com a maior atividade da arginase. Em amostras de tecido da próstata, ARG2 foi mais expresso em tecidos normais e não-malignas da próstata, em comparação com tecidos tumorais. Após a estimulação de células LNCaP de androgénio com 10 nM R1881, tanto ARG1 e ARG2 foram sobre-expressos. A regulação da expressão de arginase no seguimento da estimulação de androgénio foi dependente do receptor de androgénio (AR), como um tratamento de siARN como alvo o AR inibida tanto ARG1 e ARG2 superexpressão. Esta observação foi correlacionada

in vivo

em pacientes por imuno-histoquímica. Os pacientes tratados com ADT antes da cirurgia tiveram menor expressão ARG2 em ambos os tecidos não-malignas e malignas. Além disso, ARG1 e ARG2 foram enzimaticamente activa e sua expressão diminuiu siRNA resultou no metabolismo atividade da arginase e L-arginina global reduzida. O ARG1 e ARG2 expressão diminuiu também traduzido com o crescimento celular de células LNCaP diminuída e aumento da ativação PBMC após exposição a células LNCaP meios condicionados. Finalmente, verificou-se que a interleucina-8 (IL-8) também foi sobrerregulada no seguimento da estimulação de androgénio e que aumentaram directamente a expressão do ARG1 e ARG2 na ausência de androgénios.

Conclusão /Significância

Nossos dados fornece a primeira detalhada

in vitro

e

em conta vivo

de uma via imunossupressora regulada por andrógenos em CaP humana através da expressão de ARG1, arg2 e IL-8.

Citation: Gannon PO, Godin-Ethier J, Hassler M, Delvoye N, Aversa M, Poisson AO, et al. (2010) Expressão andrógeno-regulamentado de Arginase 1, Arginase 2 e interleucina-8 no câncer de próstata humano. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10.1371 /journal.pone.0012107

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Março, 2010; Aceito: 06 de julho de 2010; Publicação: 11 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Gannon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado por uma bolsa de investigação Sanofi Aventis (FS), por um prémio de investigação Uro-Oncologia Group /AstraZeneca canadense (FS) e por uma bolsa da Fundação Prostate Cancer Research do Canadá (RL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, compartilhamento de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Além disso, F.S. detém a Universidade de Montreal Cadeira no câncer de próstata. R.L. é apoiado por uma bolsa da Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ). P.O.G. é um receptor de um Ph.D. studentship do FRSQ e recebeu apoio adicional do câncer de Institut du Montréal /Canderel bolsa e do programa de Biologia Molecular da Universidade de Montreal

Conflito de interesses:. Este projecto foi financiado em parte por uma pesquisa Sanofi Aventis concessão (FS) e por um prémio de investigação Uro-Oncologia Group /AstraZeneca canadense (FS). Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é o cancro mais frequentemente diagnosticado e terceira principal causa de câncer mortes relacionadas para os homens norte-americanos [1]. organogénese e carcinogênese da próstata contar com a presença de andrógenos [2]. Como tal, a modalidade de tratamento mais comum para homens com estágio avançado ou recorrente PCA é a terapia de privação de androgênio (ADT). ADT conduz à apoptose das células epiteliais da próstata sensível hormonais [3]. Infelizmente, no prazo de um a cinco anos após o início ADT, a maioria dos pacientes desenvolvem hormônio refratário PCA (HRPC), cujo tratamento permanece paliativos [4]. Novas modalidades de tratamento, tais como a imunoterapia, tentativa de resolver estas fases posteriores da APC. No entanto, imunoterapias atuais contra o CaP resultaram em sucesso limitado nos ambientes clínicos. Uma compreensão detalhada do microambiente imunológico do tumor em pacientes com câncer de próstata deve fornecer novos insights sobre como melhorar os protocolos de base imunológica atuais.

Dados recentes demonstram que vários mecanismos imunossupressores estão presentes na próstata e pode dificultar o anti- resposta imunitária tumoral, no contexto de uma imunoterapia (revisto em [5]). Arginase 2 (ARG2) é expressa em CaP humana [6] e a sua inibição, concomitante com iNOS, aumenta a activação de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) [7]. Embora as propriedades imunossupressoras de arginases através do metabolismo da L-arginina são bem documentada (revisto em [8]), a regulação da expressão da arginase humano, no entanto, é actualmente indefinido.

os andrógenos são conhecidos por terem propriedades imunossupressoras , o que é ilustrado pela inflamação intra-prostática seguinte ADT [9], [10]. A expressão de genes e análise de estudos murinos sugerem que os andrógenos regulam a expressão de ARG2 e outras enzimas da via de poliamina [11], [12], [13]. Assim, considerando os papéis fundamentais dos andrógenos na carcinogénese da próstata e na escultura do microambiente da próstata, avaliamos se andrógenos poderia regular a expressão de arginases por células CaP

in vitro

e

in vivo

.

neste estudo, relatamos que as linhas de células CaP expressam tanto ARG1 funcionalmente ativo e ARG2. Curiosamente, o hormônio sensível (HS) e do hormônio refratário (RH) tecidos expressaram menos ARG2 que os tecidos não malignos. Na linha celular LNCaP SH, estimulação androgénio levou ao aumento da expressão de ambos ARG1 e ARG2 num receptor de androgénio (AR) forma dependente. Esta expressão regulada de androgénios também foi observada no tumor primário dos doentes tratados com ADT que expressaram menos ARG2 em ambos os tecidos não malignos adjacentes ao tumor e os tecidos tumorais, em comparação com pacientes de controle. Finalmente, descobrimos que a IL-8 também foi regulada por andrógenos sob o controle da AR, e participou na regulação da ARG1 e expressão ARG2. Ao todo, os nossos dados fornece a primeira detalhada

in vitro

e

in vivo

conta de uma via imunossupressora regulada por andrógenos em CaP humano.

Resultados

expressão ARG1 e ARG2 em CaP

em primeiro lugar, avaliamos a expressão arginases de linhas celulares APC e amostras clínicas. Nossos dados demonstram que linhas de células CaP expressam tanto ARG1 e ARG2. A expressão génica análises por qPCR demonstrado que

ARG1

ARNm era mais abundante na linhagem de células 22Rv1 (Figura 1A), enquanto a proteína ARG1 foi ligeiramente mais expressos pelas duas linhas de células de RH CaP (DU145 e PC3) do que na células LNCaP (Figura 1B, painel inferior). a expressão da proteína ARG1 não se correlacionou com a análise da expressão do gene sugerindo uma possível regulação pós-transcricional. Quanto à expressão ARG2, a linha de células LNCaP expressa os mais altos níveis de

ARG2

mRNA (Figura 1A). Baixa

ARG2

expressão de ARNm foi detectada nas duas linhas de células DU145 e PC3 RH em comparação com as duas linhas de células HS APC. abundância de proteína ARG2 correlacionada com a qPCR resultados com células LNCaP que expressam significativamente mais ARG2 do que as outras três linhas celulares (Figura 1b, painel inferior). Além disso, as células LNCaP teve a maior atividade da arginase sugerindo que ARG2 é a enzima predominante no que diz respeito à atividade da arginase de células PCA (Figura 1B, painel superior).

linhas celulares PCA (LNCaP, 22Rv1, DU145 e PC3) foram mantidas em meio RPMI suplementado com FBS a 10%. A) A expressão gênica de

ARG1

(painel esquerdo) e

ARG2

(painel direito). expressão relativa média (n = 3) com o erro padrão da média (barras de erro). B) Painel superior: atividade Arginase de linhas celulares de CaP quantificados em mU /mg de proteínas. Painel inferior: Western blot de ARG1 e ARG2. Ran serviu como controle de carga. C) Imagem representativa de coloração imuno-histoquímica de expressão ARG2 no tecido prostático. Note-se que a expressão de ARG2 estava confinada às células endoteliais sem coloração estromal. D) Quantificação de expressão ARG2 por imuno-histoquímica em amostras de próstata. * Diferença estatisticamente significativa na expressão ARG2 entre os tecidos PIN e FC (p = 0,033, Mann-U). ** Diferença estatisticamente significativa na expressão ARG2 entre tecidos de tumor e tecidos normais (p 0,001, Mann-L), tecidos não malignos adjacentes ao tumor (P 0,01, Mann-U) e tecidos PIN (p 0,001, Mann U).

a expressão da proteína ARG2 foi avaliada em amostras clínicas por imunohistoquímica em três diferentes tecidos micro-matrizes (TMAs) reagrupamento amostras da próstata a partir de uma coorte de 99 pacientes APC e 50 de próstata normal, proveniente de autópsias. Nós não avaliamos a expressão da proteína ARG1 como, em nossas mãos, os anticorpos anti-Arg1 testadas não eram adequadas para imuno-histoquímica em tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina arquivados. Observou-se que a expressão ARG2 foi restrito ao epitélio da próstata e ausentes do estroma (Figura 1C). ARG2 foi estatisticamente significativamente menor expressa em tecidos de tumor em relação ao normal (p 0,001, teste de Mann-L), a não maligno normal adjacente (p 0,01, teste de Mann-L) e �pr�tata neoplasia intra-epitelial (PIN) tecidos (p 0,001 , Mann-L) (Figura 1D). tecidos de RH também expressaram menos ARG2, embora apenas significativamente diferentes dos tecidos PIN (p = 0,033, Mann-L). Não houve correlação entre a expressão ARG2 dentro dos tecidos adjacentes e tumorais normais (Tabela S1). Finalmente, avaliou-se a expressão ARG2 correlacionada com parâmetros clínico-patológicos tais como a classificação de Gleason, pré-operatório antigénio específico da próstata (PSA) níveis e recorrência bioquímica. Nossos resultados mostram que a expressão ARG2 dentro do tecido normal adjacente inversamente correlacionada com vesícula seminal invasão (Tabela S1). No total, estes

in vitro

e

In vivo

dados demonstram a expressão diferencial de ARG1 e ARG2 entre as várias fases de progressão APC, independentemente do estado de RH.

androgénio expressão regulada de ARG1 e ARG2

a expressão diferencial de ARG1 e ARG2 entre as linhas de células HS e HR CaP nos levou a investigar as funções reguladoras dos andrógenos na expressão de arginase. Para isso, avaliamos gene arginases e expressão da proteína após a estimulação do andrógeno.

ARG1

expressão de ARNm foi regulada positivamente não de forma estatisticamente significativa em qualquer 22RV1 linhas celulares após estimulação R1881 (Figura 2A) ou LNCaP. No entanto, em células LNCaP,

ARG2

expressão de ARNm foi aumentada às 48 horas (p = 0,002, Mann-U) e às 72 horas (p = 0,016, Mann-L) do painel após a estimulação R1881 (esquerda, A Figura 2B). A sobre-expressão de

ARG2

em 22RV1 não foi estatisticamente significativa (p = 0,248, Mann-U) (painel direito, Figura 2B). Na verdade,

ARG2

expressão correlacionada com a maior sensibilidade de células LNCaP de androgénio em comparação com 22RV1 (Figura S1A). Como tal, as células LNCaP foram utilizadas para outras experiências. Corroborando os dados de PCR, a partir de transferências de Western de células LNCaP, que a estimulação R1881 aumento da expressão de proteínas ARG2 (Figura 2C). Curiosamente, embora nenhuma mudança significativa foi observada em

ARG1

expressão de mRNA em células LNCaP tratados com R1881, a expressão da proteína ARG1 foi significativamente aumentada. Nós não observamos qualquer aumento de ARG1 ou proteína ARG2 expressão em DU145 e PC3 estimulados com 10 nM de R1881 (Figura S1B).

AB) células LNCaP (painéis à esquerda) e 22RV1 (painéis da direita) foram estimulados mais um período de 72 horas, com 10 nM R1881 após um período de 72 horas de incubação em meio despojado de carvão ea expressão gênica de a)

ARG1 Comprar e B)

ARG2

analisadas por qPCR. Controle (barras cinza claro) e R1881-estimulados (barras pretas). * Diferença estatisticamente significativa (p 0,05, teste de Mann-L). A média de expressão relativa (n = 4) com erro padrão (barras de erro). C) A expressão aumentada de proteínas de ambas ARG1 e ARG2 após a estimulação R1881 por Western blot. As células LNCaP foram estimuladas com 10 nM R1881 como anteriormente descrito. PSA serviu como controlo positivo. Experiência representativa, (n = 6). D) Inibição de actividade de AR com bicalutamida (CASODEX). As células LNCaP foram estimuladas com R1881 durante 72 horas como descrito anteriormente, na presença de doses crescentes de bicalutamida (0, 10, 20 e 40 uM). ARG1 e os níveis de expressão Arg2 foram avaliadas por transferência de Western. Experiência representativa é mostrada, (n = 3). Observação do efeito agonista de bicalutamida na ausência de R1881 ilustrado por um aumento da expressão de PSA e ARG2. E) A inibição da expressão de AR por siRNA. As células LNCaP foram transfectadas, como descrito anteriormente. AR, os níveis de expressão e Arg1 ARG2 foram avaliadas por transferência de Western. Experiência representativa é mostrada, (n = 4). F) Arginase actividade foi quantificada em mU /mg de proteínas. As células LNCaP foram transfectadas com siCTRL (barras cinzentas claras) ou Siar (barras pretas) e depois estimuladas com R1881 durante 72 horas como anteriormente descrito. experiência representativa, (n = 3).

O AR está implicado em ARG1 e expressão ARG2

Como os nossos resultados sugerem que os andrógenos regulam a expressão arginase, avaliou a contribuição da AR . Nós inibiu a actividade de AR com o não-esteroidal anti-andrógeno bicalutamida (CASODEX) (Figura 2D). Observamos uma diminuição da expressão de ARG1 com a maior concentração (40 mM) de bicalutamida após a estimulação R1881. A indução de androgénio ARG2 não foi bloqueado, mesmo na concentração mais elevada de bicalutamida. Conforme documentado anteriormente [14], observou-se que tinha uma actividade bicalutamida AR-agonista em células de LNCaP em cultura na ausência de androgénios. Houve uma indução R1881-independente de PSA e expressão ARG2 em células LNCaP estimuladas com 20 uM e 40 uM de bicalutamida na ausência de androgénios. Nesta mesma condição, bicalutamida causou uma diminuição na expressão ARG1. Estes resultados sugerem que a expressão ARG1 pode ser mais sensível à inibição de AR do que ARG2, cuja expressão foi induzida pelo efeito inibidor agnóstico da AR.

Decidimos para inibir ainda mais o AR através do bloqueio da expressão de AR nas células LNCaP usando siRNA. A presença de ARNsi contra a AR resultaram numa inibição significativa da expressão de AR e em uma expressão reduzida de PSA seguindo estimulação R1881 (Figura 2E). Tanto o ARG1 e indução após estimulação ARG2 R1881 foram inibidas pelo tratamento com siRNA, que traduzido na ausência de uma regulação positiva da actividade da arginase (Figura 2F). Estes resultados sugerem que a AR regula a expressão de ARG1 e ARG2

in vitro

e que ARG1 e ARG2 têm uma sensibilidade diferente para a inibição AR.

expressão ARG2 diminuída em pacientes CaP seguinte ADT

com base em nossa

in vitro

de dados, temos a hipótese de que os andrógenos pode modular a expressão da proteína ARG2 em pacientes CaP também. Observou-se que, em comparação com o controle de pacientes de cancro (cirurgia só), pacientes (ADT antes da cirurgia) teve significativamente menor expressão ARG2 em ambos os tecidos não malignos adjacentes ao tumor (46,4 vs 23,5 unidades relativas ADT-tratados; P 0,001 , Mann-L) e os tecidos de tumor (41,7 vs 31,5 unidades relativas; p 0,01, teste de Mann-L) (Figura 3A). Também observamos que a privação de andrógeno

in vitro

poderia diminuir ARG2, mas não a expressão da proteína ARG1, em LNCaP e 22RV1 células cultivadas durante sete dias, na ausência de andrógenos (Figura 3B). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que os andrógenos regulam a expressão de ARG2

in vivo

em pacientes CaP como ADT reduz a expressão ARG2.

A) Análise de expressão ARG2 regulada por andrógenos em pacientes CaP por imuno-histoquímica . pacientes de controlo (barras cinza claro, n = 40) e pacientes tratados com ADT (barras pretas; n = 35). B) A diminuição da expressão da proteína ARG2 na ausência de androgénios

In vitro

determinados por Western blot. Ran serviu como controle de carga. linhas celulares de PCA (LNCaP, 22Rv1, DU145 e PC3) foram mantidas em RPMI 10% FBS ou em meio RPMI suplementado com 10% de carvão despojado de FBS durante 7 dias (n = 3). Note-se que a expressão ARG1 não variar, mas que ARG2 foi reduzida em células LNCaP e 22Rv1 na ausência de andrógenos.

ARG1 e ARG2 are metabolicamente ativo

Para avaliar se ARG1 e ARG2 expressa por células LNCaP foram metabolicamente ativo, que inibiu a expressão de qualquer ARG1 ou ARG2 por siRNA. Em comparação com um siCTRL, tanto siARN inibiu significativamente ARG1 ou expressão ARG2 (Figura 4A). A inibição de qualquer um ou ARG1 ARG2 resultou em actividade enzimática da arginase reduzida (Figura 4B). Por HPLC, que, em seguida, determinou-se a impacto da inibição da expressão ARG2 ARG1 e sobre o metabolismo da L-arginina por células LNCaP. A ausência de qualquer ARG1 ou ARG2 conduziu a concentrações mais elevadas de L-arginina no meio condicionado sugerindo uma diminuição do metabolismo da L-arginina por células LNCaP (Figura 4C). Além disso, observou-se que a estimulação R1881 levou a uma concentração diminuída de extracelular l-arginina, o que corrobora nossos resultados demonstrando um aumento da expressão arginase após a estimulação do andrógeno. Avaliou-se a expressão da sintase do óxido nítrico (NOS), também conhecido para metabolizar a L-arginina. No entanto, não se observou a expressão de iNOS ou de nNOS (proteínas), assim como não há produção de NO (função) no nosso modelo (dados não apresentados).

células LNCaP foram transfectadas com qualquer um ou uma siCTRL coquetel de três ARNsi contra o ARG1 ou ARG2. Após a transfecção (24 horas), as células foram plaqueadas em meio suplementado soro despojado com carvão durante 72 horas e em seguida estimuladas durante 72 horas com 10 nM R1881. A) inibição siARN da ARG1 e ARG2 expressão foi avaliada por Western Blot. Experiência representativa é mostrada, (n = 4). B) Diminuição da atividade da arginase após a transfecção com siARG1 ou siARG2 em células LNCaP. O Western blot correspondente é mostrada no painel inferior. Experiência representativa é mostrada, (n = 3). C) Diminuição do metabolismo da L-arginina, na ausência de expressão da arginase. Os meios condicionados de células LNCaP transfectadas com siCTRL, siARG1 ou siARG2 foram analisadas por HPLC para a concentração de L-arginina. Os meios condicionados foram analisadas por HPLC a partir das células LNCaP apresentados na Figura 4A. * Diferença estatisticamente significativa (p 0,05, teste de Mann-L). D) A diminuição da proliferação de células LNCaP na ausência de expressão da arginase. As células LNCaP foram transfectadas, como descrito anteriormente. A proliferação foi medida por contagem de células 96 horas após a transfecção. * Diferença estatisticamente significativa (p 0,05, teste de Mann-L), (N = 3). E) A inibição da expressão de causas Arg2 aumento da proliferação de PBMC e de activação. PBMC de dadores normais foram activadas com anti-CD3 (OKT3, 1 ug /ml) com ou sem IL-2 na presença de meio fresco ou meio de células LNCaP transfectadas com controlo, siCTRL, siARG1 ou siARG2 condicionado tal como previamente descrito. PBMC de controlo foram incubadas com o controlo do isotipo IgG (1 ug /ml) e com PBS, em vez de IL-2. Painel esquerdo: a proliferação de PBMC foi quantificado por incorporação de BrdU seguintes 120 horas de estimulação com OKT3 e IL-2. absorvância média (n = 4) é mostrada com erro padrão (barras de erro). Painel da direita: PBMC secreção de IFN-γ quantificado por ELISA. A mesma experiência, como descrito anteriormente, mas as PBMC foram activados durante 24 horas sem IL-2. expressão representativo é mostrado (n = 4) com o erro padrão da média (barras de erro).

Como arginases estão implicados na via de síntese de poliamina necessário para a proliferação celular, foi avaliado o impacto do ARG1 e ARG2 sobre o crescimento celular. Observou-se que a inibição de qualquer um ou ARG1 expressão ARG2 resultaram numa proliferação de células LNCaP inferior mantidas em meio completo (p = 0,02 e p = 0,01, respectivamente, para siARG1 e siARG2) (Figura 4D). Além disso, a fim de estudar se ARG1 e expressão ARG2 por células LNCaP afectado o seu potencial imunossupressor, PBMC de dadores saudáveis ​​foram activadas na presença de meio condicionado de LNCaP + siCTRL ou LNCaP + siARG1 ou LNCaP + siARG2. A inibição de qualquer ARG1 ou ARG2 traduzido em aumento da proliferação de PBMC como quantificada pela incorporação de BrdU (Figura 4E, painel esquerdo). Esta proliferação aumentada foi associada a uma elevada secreção de IFN-γ por PBMC tal como medido por ELISA (Figura 4E, painel da direita). Não foram observadas variações significativas na secreção de IL-2 ou IL-10 (dados não mostrados). Finalmente, avaliou-se a expressão ARG2 correlacionada com o infiltrado imune das células do tumor primário que, recentemente publicada [10]. Notou-se que a expressão ARG2 se correlacionam inversamente com a infiltração de linfócitos T e macrófagos no interior da próstata (Tabela S2). Colectivamente, estes resultados sugerem que ARG1 e Arg2 expressa por células LNCaP são enzimaticamente activa e participar em processos fisiológicos importantes, tais como a proliferação celular e imunossupressão derivado de tumor.

indução de IL-8 de ARG1 e expressão ARG2

Como arginases estão bem documentados para participar da escultura do microambiente imunológico tumor [15] e que as citocinas são conhecidas para induzir a expressão arginase em modelos murinos [16], que avaliou se as citocinas também pode regular a expressão arginase no CaP humana . O perfil das células LNCaP estimuladas com 10 nM de R1881 expressão de citocinas foi avaliada qualitativamente usando uma variedade de citocinas proteoma Profiler (R D Systems) (Figura 5A). Os dados proteomic ilustrado que as células LNCaP estimuladas R1881-se expressão aumentada de IL-8 e Serpina E1 (Figura S2A). Investigamos ainda mais o papel da IL-8 na expressão da arginase como a IL-8 tem sido recentemente ligada à expressão de genes regulados de androgénios em CaP [17]. Nós portanto, quantificada a expressão elevada de IL-8 em células LNCaP seguinte expressão R1881 (Figura 5B). Esta indução de IL-8 era dependente da AR como a inibição da expressão de AR por siARN impediu a secreção de IL-8 a seguir à estimulação de androgénio (Figura 5C). Em seguida, avaliamos se a inibição da IL-8 poderia diminuir ARG1 e ARG2 expressão após estimulação R1881. Usando um ARNsi contra a IL-8, que podem diminuir significativamente a secreção de IL-8 (Figura 5D). Isto reduziu a produção de IL-8 foi associada com uma redução de Arg1 e Arg2 24 horas após a estimulação R1881 (Figura 5E). O tratamento de células LNCaP com siil-8 também traduzido para uma diminuição da actividade da arginase (Figura S2B). Finalmente, estimulou as células LNCaP privadas de androgénio com o aumento da concentração de IL-8 exógena durante 72 horas e monitorizada a expressão de ARG1 e ARG2. Através de análise de transferência de Western, observou-se que tanto a 50 ng /ml e 100 ng /ml de IL-8 induzida a expressão de ARG1 e ARG2 quando comparado com células de controlo de LNCaP (Figura 5F). O decréscimo na expressão da proteína ARG1 e ARG2 com 250 ng /ml de IL-8 correlacionados com IL-8 toxicidade celular induzida. Observou-se também uma indução de

ARG2

, mas não

ARG1

, expressão gênica após uma estimulação de 24 horas (Figura S2C). Finalmente, uma vez que foi anteriormente relatado que o fenol vermelho poderia activar o ar [18], também estimulou células LNCaP com IL-8 em meios RPMI isento de fenol-vermelho. Estas experiências de controlo demonstraram que a indução de IL-8 dependente de ARG1 e ARG2 pode ocorrer na ausência de fenol vermelho (Figura S2D). Tomados em conjunto, os dados mostram claramente que os andrógenos regulam a expressão de IL-8, que por si só pode induzir a expressão de ambos ARG1 e ARG2.

Avaliação do perfil de expressão de citocinas de células LNCaP no seguimento da estimulação R1881. A) Os meios condicionados de células LNCaP estimuladas como anteriormente descrito foram analisadas com um proteoma Profiler ™ (R D Systems). B) Os meios condicionados de células LNCaP estimuladas ao longo do tempo, quer com controlo etanol (barras cinzentas claras) e R1881 (barras pretas) foram analisados ​​para a produção de IL-8 por ELISA. A experiência representativa mostrou foi realizada com o mesmo meio condicionado usado para a análise de perfis em proteoma 5a, (n = 3). C) Quantificação da secreção de IL-8 por células LNCaP transfectadas com Siar e estimuladas com R1881 como anteriormente descrito. Experiência representativa é mostrada, (n = 3). D) Quantificação da secreção de IL-8 por células LNCaP transfectadas com siil-8 e estimuladas com R1881 como anteriormente descrito. Experiência representativa é mostrada, (n = 3). Por 5b e 5c, não havia IL-8 secreção detectada na ausência de estimulação R1881. E) Expressão de ARG1 e ARG2 em células LNCaP após transfecção de estimulação siil-8 e R1881 durante 24 horas. Experiência representativa é mostrada, (n = 3). F), as células LNCaP foram plaqueadas em meio suplementado soro despojado com carvão durante 72 horas e durante 24 horas em meio RPMI isento de soro. As células foram em seguida estimuladas durante 72 horas com 10 nM R1881 ou com 50, 100 ou 250 ng /ml de IL-8 em meio RPMI isento de soro. ARG1 e os níveis de expressão Arg2 foram detectadas por Western Blot. Experiência representativa, (n = 3). Note-se a indução de ambos ARG1 e ARG2 a 50 e 100 ng /ml de IL-8 na ausência de concentração de R1881.

Discussão

Uma compreensão mais completa da próstata imunológica mecanismos microambiente pode melhorar a eficácia clínica de imunoterapias atuais contra o CaP. Nós e outros mostraram que ADT leva a mudanças drásticas no microambiente da próstata imunológica [9], [10]. A via de arginase participa no desenvolvimento de um estado imunossupressor dentro do tumor primário de pacientes com CaP [7]. No entanto, a regulação da expressão de arginase por células CaP permanece indefinida.

Neste relatório, observou-se que os andrógenos induziu a expressão de ambos ARG1 e ARG2 em linhas de células HS APC. A AR foi implicado no presente regulamento tanto como bicalutamida e Siar transfecção ARG1 prevenida e ARG2 superexpressão após a estimulação R1881. Reciprocamente, a privação de andrógeno e ADT reduzida expressão ARG2

in vitro Comprar e no tumor primário de pacientes APC, respectivamente. células LNCaP expressa ARG1 enzimaticamente funcional e ARG2 que, uma vez que a sua expressão da proteína foi inibida, causou uma redução na proliferação celular e no seu potencial imunossupressor. Finalmente, mostrou que a IL-8 também foi regulada por R1881 e poderia estimular a expressão de ARG1 e ARG2 independentemente de androgénio. Ao todo, nossos resultados fornecem a primeira evidência mecanicista de uma via imunossupressora-driven andrógeno na CaP através da expressão de ARG1, arg2 e IL-8 pelas células APC.

Nós demonstramos que as células CaP expressam tanto ARG1 e ARG2. ARG2 foi predominantemente expressa por linhas de células HS APC e pelos tecidos da próstata não-malignas. Estes resultados corroboram dados que descrevem uma expressão ARG2 inferior em linhas de andrógeno-insensitive CaP celulares (DU145 e PC3) e no tumor e RH tecidos de pacientes CaP publicado [6], [19]. No entanto, para o nosso conhecimento, nós somos o primeiro grupo para estudar a expressão de ARG1 por células APC e definir consequências mecanicistas que levam a sua indução regulada por androgénio. Semelhante a ARG2, a inibição da expressão ARG1 levou à diminuição da proliferação de células tumorais, reduziu o metabolismo da L-arginina e redução do seu potencial imunossupressor. Com base na expressão da proteína (Figura 1B, painel inferior) e sobre a actividade da arginase de células PCA (Figura 1B, painel superior), os nossos dados sugerem que ARG2 pode, contudo, ter um papel mais proeminente do que ARG1 no potencial actividade da arginase de células CaP [20].

Além disso, nossos dados mostraram que ARG1 e ARG2 foram diferencialmente regulados por andrógenos. Contrariamente ao gene de ARG2 e a expressão da proteína, que demonstrou claramente que a expressão do gene e proteína de ARG1 não se correlacionou. Isto sugere que os andrógenos podem influenciar a regulação pós-transcricional da ARG1 como foi previamente relatada em Xenopus [21] e em modelos de levedura [22]. Desde expressão ARG2 está localizada a mitocôndria, avaliamos se a proliferação celular independente de androgénios poderia induzir a expressão ARG2 em células LNCaP. Num ensaio de proliferação com EGF em vez de R1881, não foi observada indução ARG2 (dados não mostrados). Coletivamente, nossos resultados revelam que, embora ambos induzida por R1881, as vias de sinalização que levam à ARG1 e expressão ARG2 diferentes para as duas enzimas e precisam ser examinadas.

A implicação de uma expressão regulada por androgénio de ARG1 e ARG2 na carcinogênese de próstata requer uma investigação mais aprofundada. expressão arginase e síntese de poliaminas são elevados em CaP [23], [24] e associado com o grau do tumor [25]. A actividade da arginase alta correlaciona-se com o aumento da proliferação de cancro da mama [26], o cancro do cólon [27] e linhas de células de rim [28]. No entanto, observou-se que tumorais ou RH tecidos expressam menos ARG2 que os tecidos não malignos. É possível que as células tumorais não adquirem a expressão destas enzimas como um meio para explorar ainda mais o seu potencial imunossupressor, um aspecto relacionado com a progressão do tumor. Na verdade, uma vez que a próstata é o órgão com a maior produção de poliamina, arginase expressão pelas células da próstata pode preceder o desenvolvimento de cancro, como a produção de poliamina é essencial para a proliferação de células da próstata. Assim, a vantagem imunossupressora adquirida pelas células da próstata pode ser secundária ao papel desempenhado pelos proliferativa arginases. A partir dos nossos dados e a dos outros, nós supomos que arginase podem estar implicados nas fases anteriores sensível ao hormônio da carcinogênese da próstata através da promoção da proliferação de células cancerosas e para o desenvolvimento de um ambiente imunossupressor regulada por androgénio.

Finalmente, observado que a IL-8 foi sobrerregulada no seguimento da estimulação de androgénio e podem induzir a expressão de ARG1 e ARG2. IL-8 medeia os seus efeitos através da activação de dois-elevada afinidade à proteína G de receptores acoplados, CXCR1 e CXCR2 [29], sendo que ambos são expressos por células LNCaP [30], [31]. É importante notar que a expressão de ARG1 e ARG2 seguinte a estimulação de IL-8 não foi tão substancial como estimulação com R1881 sugerindo que outras vias reguladas de androgénios poderia ser envolvido.