Abstract

Objectivo

O objetivo deste estudo foi investigar nanobubbles transportando receptor de andrógeno (AR) siRNA e sua

in vitro

e

In vivo

efeitos anti-tumorais, quando combinado com irradiação ultra-sônica, sobre o câncer de próstata andrógeno-independente (AIPC).

Materiais e Métodos

nanobubbles transportando AR siRNA foram preparadas usando poli-L-lisina e métodos de adsorção eletrostática. Utilizando a actividade de células C4-2 como um índice de teste, os parâmetros de irradiação óptimas (incluindo o rácio do número de série /célula nanobubble, índice mecânico [MI], e tempo de irradiação) foram determinados e usados ​​para a transfecção de três linhas de células de cancro da próstata humanas (C4 -2, LNCaP, PC-3 e as células). Os níveis de expressão de AR foi investigada com a RT-PCR e análise de Western blot. Além disso, os efeitos das microbolhas nanobubbles e controlo denominado SonoVue foram avaliadas por meio de formação de imagens de um modelo de xenoenxerto C4-2. Finalmente, a expressão crescimento e AR de sete grupos de tecidos tumorais foram avaliados utilizando o modelo de rato de xenotransplante C4-2.

Resultados

Os nanobubbles tinha um diâmetro médio de 609,5 ± 15,6 nm e poderia ligam-se de forma eficaz para ARNsi de AR. Sob as condições otimizadas de um nanobubble rácio do número /célula número de 100:1, um MI de 1,2, e um tempo de irradiação de 2 min, as maiores taxas de transfecção em C4-2, LNCaP e PC-3 células foram 67,4%, 74,0% e 63,96%, respectivamente. Nas células LNCaP C4-2 e, o tratamento com estes nanobubbles de ligação mais de irradiação ultrassónica inibiu significativamente o crescimento celular e resultou na supressão de AR em mRNA e a expressão da proteína. Além disso, o ultra-som com contraste mostrou que os nanobubbles alcançado sinais mais fortes do que o controlo SonoVue na área hipovascular central dos tumores. Finalmente, o efeito anti-tumoral destes nanobubbles além de irradiação ultra-sônica foi mais significativa no modelo de tumor xenoenxerto em comparação com os outros grupos.

Conclusão

nanobubbles transportando AR siRNA poderia ser potencialmente utilizado como gene vectores em combinação com irradiação de ultra-sons para o tratamento de

AIPC

citação:. Wang L, Zhang H, Tan K, Guo Y, H Tong, X Fan, et ai. (2014) Preparação de nanobubbles Carrying receptor andrógeno siRNA e seus efeitos inibitórios sobre o cancro da próstata andrógeno-independente quando combinado com ultra-som irradiação. PLoS ONE 9 (5): e96586. doi: 10.1371 /journal.pone.0096586

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 23 de fevereiro de 2014; Aceito: 09 de abril de 2014; Publicado em: 05 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.970.830) e projecto essencial da Natural Science Foundation da cidade de Chongqing (cstc2012jjB0072). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é bem estabelecido que o cancro da próstata dependentes de androgénios é [1]. Portanto, a privação de andrógenos tem sido o principal tratamento para o câncer de próstata avançado. Com esta terapia, no entanto, a doença progride rapidamente para o cancro da próstata independente de androgénios (AIPC) na maioria dos pacientes [2], [3]. Atualmente, não há terapias eficazes a longo prazo para AIPC. O desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para AIPC permanece atraente, mas é um problema desafiador em oncologia clínica. Estudos anteriores demonstraram que o crescimento da AIPC é dependente do receptor de androgénio (AR). Assim, bloqueando a expressão de AR tem um grande potencial para o tratamento de AIPC [4].

Estudos têm demonstrado que a supressão expressão de RA com tecnologia de interferência de RNA (RNAi) é uma forma eficaz para inibir o crescimento de células cancerígenas da próstata, o que indica que este método pode ter o potencial para ultrapassar obstáculos associados com o tratamento AIPC [5]. Nos nossos estudos anteriores, o ARN de cadeia dupla AR (ARNcd) com uma elevada especificidade para os genes AR foi concebido para bloquear a expressão de AR nas células AIPC e para inibir o crescimento das células [6]. No entanto, este tipo de terapia genética abordagem é difícil de aplicar em um ambiente clínico, devido à baixa eficiência de transfecção de genes. Uma das principais razões para a baixa eficiência de transfecção é a falta de um

in vivo

sistema eficaz e não invasivo direcionados gene entrega. Nos últimos anos, as microbolhas de ultra-sons-destrutíveis foram mostrados para ser um método promissor para a terapia genética. De facto, a destruição das microbolhas mediada por ultra-som não só pode melhorar a eficiência de transfecção de genes, mas também pode ser utilizado para a entrega específica de tecido de agentes terapêuticos [7], [8].

Com o desenvolvimento de imagiologia molecular ultra-som e nanotecnologia, do tamanho de microbolhas continua a diminuir, e micro- aos tamanhos de nano-escala são atualmente possíveis. Nanobubbles oferecem várias vantagens em transfecção alvo gene [9]. Por exemplo, nanobubbles são caracterizados por poder penetrante forte e desempenho estável, o que lhes permite entrar nos tecidos tumorais através da vasculatura do tumor [10]. Portanto, neste estudo, que combinou a tecnologia RNAi com a nanotecnologia por nanobubbles preparando transportando AR pequena interferência RNA (siRNA). As propriedades físicas destas bolhas foram então ensaiadas. Além disso, os nanobubbles preparados foram usados ​​para a transfecção de células de siRNA AIPC em conjunto com o tratamento de irradiação ultrassónica para induzir a libertação dos transcritos de ARNip. O

in vitro

eficiência de transfecção foi avaliado sistematicamente. Além disso, a eficácia anti-tumoral dos nano-bolhas foi avaliada utilizando estudos de imagem e um ensaio de inibição do crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata do rato. Os resultados aqui apresentados proporcionam um suporte experimental para a utilização de nanobubbles transportando AR siARN em combinação com irradiação de ultra-sons como uma potencial terapia eficaz para AIPC.

Materiais e Métodos

Síntese da AR siARN

com base no anteriormente determinada sequência alvo de 19 pb de ADNc de AR, AR siARN foi sintetizado com o silenciador siARN Kit de construção (Ambion, Austen City, EUA) [6]. Cy3 marcado AR siARN foi então sintetizada utilizando o silenciador siARN Cy3 Labeling Kit (Ambion) para estudos de rastreio de fluorescência. A concentração do ARNsi sintetizado foi determinada utilizando um espectrofotómetro, e os siRNAs foram diluídas para 50 uM para utilização neste estudo.

Preparação de nanobubbles transportando AR siRNA e caracterização das suas propriedades físicas

uma suspensão de excipientes de lípidos, incluindo dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA), e dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) (numa razão molar de 90:2:5:3), foi preparado de polietileno-glicol (em uma proporção molar de 94:6). A suspensão foi aliquotada em frascos de 1 ml e liofilizada. As suspensões liofilizadas foram re-hidratadas com 1 ml de solução de hidratação com 50% de glucose, propilenoglicol e glicerina, em volume, 08:01:01. Perf luoropropano (C

3F

8) foi então adicionada aos tubos de ensaio para substituir o ar, e um amalgamador série ST-B (AT M Biomateriais Co. Ltd., Pequim, China) foi usada para preparar o branco nanobubbles com uma frequência de operação superior a 4500 rpm e um tempo de oscilação de 90 s [11].

um poli-L-lisina (PLL) solução (1 mg /ml) foi preparada com água duplamente destilada estéril . A solução de PLL foi então misturado com os nanobubbles em branco numa proporção 01:01 (v /v) e incubou-se a 4 ° C durante 30 min. A mistura foi, em seguida, lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover qualquer PLL não ligado. Cy3 marcado AR siARN foi adicionado a esta solução nanobubble numa proporção 01:01 (v /v), e a mistura foi incubada a 4 ° C durante 30 min. Em seguida, 200 ul de PBS foram adicionados à mistura nanobubble, e a suspensão foi lavada duas vezes por centrifugação a 600 rpm durante 3 minutos para remover qualquer não ligado AR siRNA, após o que nanobubbles marcado com AR foram obtidas tanto siRNA e PLL. A solução nanobubble e a solução aquosa contendo os siARN não ligadas foram então fervidas durante 5 min, após o que a densidade óptica foi medida a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. O número de nanobubbles foi medido utilizando um hemocitómetro [10]. A fórmula seguinte foi utilizado para calcular a capacidade de carga de siRNA:

O tamanho, a distribuição, e o potencial zeta de ambos os nanobubbles em branco e preparada com siARN AR foram medidas com um analisador de tamanho de partícula Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd , Worcestershire, RU). A forma e a dispersão destas nanobubbles também foram examinadas utilizando microscopia de fluorescência (Olympus LX71, Olympus Corporation, Tóquio, Japão).

linhas de células e condições de cultura

Três linhas de células de cancro da próstata humano foram usadas nos estudos de transfecção: LNCaP (células dependentes de androgénio com a expressão de AR, ATCC, Manassas, VA, EUA), C4-2 (AIPC células com expressão de AR, ViroMed Laboratories Inc., Minnetonka, MN, EUA), e PC-3 (sem expressão de AR, ATCC, Manassas, VA, EUA). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo soro fetal bovino a 10%, em um de CO a 5%

2 incubadora a 37 ° C. passagens de rotina foram realizados com a digestão com tripsina. Um dia antes do tratamento com irradiação ultrassónica, todas as células foram semeadas em placas de cultura, a uma confluência de 50%.

Optimização das condições de irradiação para a transfecção de nanobubbles transportando AR siARN

Para evitar negativo não específica efeitos sobre a atividade das células, no intervalo de concentração adequada para os nanobubbles em branco e condições de irradiação não destrutivos foram determinados antes da

experimentos in vitro de células

. irradiação

Ultrasonic foi realizada com o sistema de ultrassom iU22 PHILIPS ( royal Dutch Philips Electronics Ltd, Holanda). A sonda de ultra-som foi fixado com um suporte; a superfície de radiação confrontados verticalmente para cima e foi coberta uniformemente com o gel de acoplamento de ultra-sons; uma placa de 24 poços com 1,5 x 10

5 C4-2 células cultivadas em cada poço foi colocado horizontalmente sobre a superfície radiante da sonda para garantir que cada cavidade foi completamente exposto à fonte de radiação; a suspensão nanobubble foi adicionado a cada poço e adequadamente misturado; e irradiação de ultra-sons foi realizada com variações de vários parâmetros, incluindo a concentração de nanobubbles em branco (avaliada como a razão entre o número nanobubble número /célula), o índice mecânico (IM, uma reflexão da energia de ultra-som calculado dividindo-se o pico de pressão acústica negativa pela a raiz quadrada da frequência), e o tempo de irradiação. Em detalhe, para avaliar o impacto da concentração nanobubble em branco, seis grupos foram estabelecidos com base na sua nanobubble rácio /número da célula, que foi de 0, 45:1, 90:1, 135:1, 180:1, ou o controle grupo (as células normais sem qualquer tratamento como controlo); a frequência do transdutor era 1,0-5,0 MHz, a duração foi de 30 s, e o MI era 1,0. Um adicional de cinco grupos foram estabelecidos com diferentes mis, ou seja, 0,1, 0,6, 1, 1,4, ou o grupo de controlo (células normais sem qualquer tratamento como controlo); a frequência do transdutor foi 1,0-5,0 MHz, a duração foi de 30 s, ea relação número /número de células nanobubble foi 100:1. Cinco grupos foram estabelecidos para avaliar o impacto da duração, que era de 10 s, 30 s, 1 min, 2 min, ou o grupo de controlo (células normais sem qualquer tratamento como controlo); a frequência do transdutor foi 1,0-5,0 MHz, o MI foi de 1,0, ea razão número /número de células nanobubble foi 100:1. Após a irradiação de ultra-sons, as células foram cultivadas durante 24 h, e o seu crescimento celular foi ensaiado utilizando um aparelho de contagem de sangue; as contagens de células foram utilizadas como um índice de testes para avaliar os efeitos destes parâmetros sobre a actividade celular. Todos os ensaios foram repetidos pelo menos três vezes, e uma série de condições não destrutivos para

in vitro

irradiação ultra-sônica foi determinada.

ensaio de eficiência de transfecção em células de câncer de próstata

LNCaP , C4-2, e células PC-3 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10

4 células por poço e cultivadas durante a noite. Nanobubbles transportando Cy3 marcado AR siRNA foram então adicionados aos poços de cada placa de cultura de células e transfectado para estas três linhas celulares sob o intervalo predeterminado de condições não destrutivas. A eficiência de transfecção foi então avaliada por microscopia de fluorescência. A percentagem de células fluorescentes (taxa de transfecção) foi determinada por citometria de fluxo. Resumidamente, as células foram ressuspensas, após digestão com tripsina para gerar uma suspensão de célula única. A citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, EUA) foi utilizado para medir a intensidade de fluorescência de células de 10.000, e os resultados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo 7,65. As células foram fechado para calcular a percentagem de células transf ectadas dentro da população total de células, permitindo a determinação dos parâmetros optimizados para alcançar a mais alta eficiência de transfecção. Todas as análises foram repetidas pelo menos três vezes.

crescimento celular ensaio de inibição

Cada uma das linhas de células de cancro da próstata foi três divididos em seis grupos de tratamento de células de acordo com os reagentes e as condições utilizadas (Tabela 1). Todos os grupos foram transf ectadas utilizando o método de irradiação ultrassónica acima mencionada sob os parâmetros apropriados: frequência de 1,0-5,0 MHz, índice mecânico (MI) de 1,2, e a duração da exposição a ultra-som modo-B de 2 min. A contagem celular Kit-8 (CCK-8) foi utilizada diariamente a partir do primeiro ao sexto dia após a transfecção para avaliar o crescimento celular. Cada grupo tinha 10 cavidades de ensaio equivalentes e 2 poços de controlo negativo. Os valores de absorvância a 450 nm [D (450 nm)] foram analisados ​​com um leitor de microplacas (modelo 550, Bio-Rad, EUA). A curva de crescimento de células foi obtido por representação gráfica do tempo (eixo X) versus o (eixo Y) respectivo valor de absorvência, e a taxa de inibição do crescimento de células (RI) foi calculado usando a seguinte fórmula:

Além disso, a morfologia de células 48 h após a transfecção foi observada usando microscopia de fluorescência.

nível de expressão de AR Detecção de ARNm por RT-PCR células

e LNCaP C4-2 foram transfectadas usando o acima mencionado de ultra-sons método de irradiação com os parâmetros acima. O ARN total foi extraído a partir de todos os grupos de 48 h após a irradiação ultra-sónica. A análise de RT-PCR foi realizada utilizando um kit de PCR de ARN (AMV Ver. 3.0, Quioto, Japão), e desidrogenase de fosfato de gliceraldeído (GAPDH) foi utilizada como um controlo. As sequências dos iniciadores (5 ‘→ 3’) para AR foram AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG (upstream) e AAC CAG ATG AGG GGC GAA GTA GA (downstream), e as sequências de primers para GAPDH foram ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G (upstream) e GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC (downstream). Estes primers amplificou um fragmento de AR 275 pb e um fragmento de GAPDH 159 pb, respectivamente. As condições de transcrição inversa foram 50 ° C durante 30 min, 99 ° C durante 5 min, e 5 ° C durante 5 min. As condições de PCR foram 94 ° C durante 2 min; 32 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 1 min; e 72 ° C durante 10 min. Os produtos de RT-PCR foram carregadas num gel de agarose a 2%. Após a electroforese, as bandas foram visualizadas usando um sistema de imagem em gel Bio-Rad GelDoc 2000 (Bio-Rad, CA, EUA) e foram analisados ​​densitometricamente usando o software ImageJ (NIH, https://rsb.info.nih.gov/ij/). Todas as análises foram repetidas cinco vezes.

A detecção de AR nível de expressão da proteína por análise de Western blot

células

e LNCaP C4-2 foram transfectadas utilizando o método de irradiação ultrassónica acima mencionada com os parâmetros optimizados. proteína celular total foi extraído a partir de todos os grupos, utilizando um tampão de lise das células 48 h após a irradiação ultra-sónica. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de Bradford. Uma alíquota de 50 ^ g de cada ligado de células foi separado num gel de dodecilsulfato de sódio 12% de electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) e transferidos para um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado durante 4 h à temperatura ambiente e incubadas com um (anticorpo monoclonal de ratinho contra a AR humana; Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) anticorpo primário a uma diluição 1:400 a 37 ° C durante quatro h. As membranas foram então lavadas com solução salina tamponada com Tris /Tween (TBST) de tampão e incubadas com um anticorpo secundário (anti-rato de cabra IgG; Zsjqbio, Pequim, China) (1:1200 diluição) a 37 ° C durante 2 h. Um reagente de quimioluminescência aumentada (ECL) foi então usado para detectar as bandas de proteína por exposição das manchas para autorradiografia filme. Uma análise de imagem quantitativa foi realizada usando software Quantity One 4,52 (Bio-Rad). GAPDH foi utilizada para normalizar as amostras. Todas as análises foram repetidas cinco vezes.

Imagem de nanobubbles transportando AR siRNA em um rato modelo de xenotransplante

Este animal estudo foi aprovado pelo Bem-estar e Ética Comissão de Animais de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar , China. Cinco ratinhos SCID machos pesando 22-25 g (5-7 semanas de idade) foram xenoenxertado com 3 × 10

6 C4-2 células de cancro da próstata em 100 ul de Matrigel (BD Biosciences, Basileia, Suíça). Os tumores foram deixados para se estabelecer e crescer para um diâmetro de 10-15 mm. Os animais foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de 100 ul de solução de pentobarbital de sódio a 1% e, em seguida, fixada numa posição de bruços. Bidimensionais imagens de ultra-som dos tumores xenoenxerto foram adquiridos utilizando um sistema de ultra-som PHILIPS iU22. Nanobubbles transportando AR siRNA foram então administrado aos ratinhos por meio de injecção na veia da cauda a uma dose de 5 ml /kg de peso corporal. Os parâmetros utilizados para a obtenção das imagens de ultra-som foram as seguintes: freqüência de sonda = 5-12 MHz; MI = 0,4; e ganho de = 70%. A sonda foi fixado, e imagens dinâmicas com contraste foram capturados usando o software de estação de trabalho ultra-som. mircrobubbles de tamanho de micron SonoVue chamado agente de contraste (Bracco, Milão, Itália) foi utilizado como um controlo sob as mesmas condições. A análise quantitativa foi realizada utilizando Philips QLAB 8,1 software (Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Holanda).

In vivo

crescimento do tumor ensaio de inibição

Este estudo animal foi aprovado pelo Bem-estar e Ética Comissão de animais de Laboratório da Terceira Universidade médica Militar, na China. Cinquenta e seis ratinhos SCID machos pesando 22-25 g (5-7 semanas de idade) foram xenoenxertado com 3 × 10

6 C4-2 células em 100 ul de Matrigel. O estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da China Pharmaceutical University. Os tumores foram deixados para se estabelecer e crescer a um diâmetro de 7-10 mm. Os animais portadores de xenoenxertos de tumor foram então divididos aleatoriamente em sete grupos (oito animais por grupo). Os tratamentos usados ​​para 1-6 grupos estão listados na Tabela 1. Grupo 7 foi administrado nanobubbles que transportam contra-senso siRNA + irradiação ultra-sónica. Em detalhe, as doses de nanobubbles transportando AR siRNA (aproximadamente 1,6 x 10

6 /ul), nanobubbles em branco, e solução salina foram 5 ml /kg de peso corporal. A dosagem nua AR ARNip foi de 100 ug por ratinho. Todos os nanobubbles, nua AR siRNA, e solução salina foram administrados como um bolus intravenoso através de uma veia da cauda. Os ratos dos Grupos 3-7 foram então anestesiados com isoflurano e fixado em uma posição propensa. Imediatamente após a injecção, os xenoenxertos de tumor foram tratados utilizando um sistema de ultra-som Philips iU22. A perfusão de nanobubbles no tumor foi visualizado em tempo real, utilizando ultra-sons (5-12 MHz) a baixa potência acústica (MI 0,4) para minimizar a destruição nanobubble. Após a visualização dos nanobubbles dentro de um tumor, os nanobubbles foram explosão, aumentando o MI para 1,2 com uma frequência de 1-5 MHz. Um tempo de exposição de ultra-sons de 30 minutos aplicou-se para garantir que todos os nanobubbles foram destruídas. Durante o tratamento, o transdutor foi aplicado num movimento circular para assegurar que todo o xenoenxerto de tumor receberam exposição de ultra-som. Para todos os animais, o tratamento foi realizado três vezes, uma vez a cada 3 d (no dia 0, dia 3, e dia 6). O diâmetro máximo (a, mm) e o diâmetro mais curto (b, mm) de cada tumor foram medidos a cada 3 d começando no primeiro dia de tratamento (dia 0) e que termina 21 dias depois do primeiro tratamento (dia 21). O volume do tumor (TV) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: TV = 1/2 × a × b

2. O volume relativo do tumor (RTV) foi então calculado usando a seguinte fórmula: RTV = TV

N /TV

0 × 100%, onde a TV

n é o volume do tumor medido no dia n e TV

0 é o volume de tumor no dia 0. a curva de crescimento do tumor foi representada graficamente com base no RTV. No dia 21, todos os animais foram sacrificados e os tumores foram pesados ​​e exercido. A taxa de inibição do crescimento do tumor (TIGR) foi calculado usando a seguinte fórmula:. TIGR = (1-TWT /TWC) × 100%, onde TWT e TWC são os pesos de tumor média nos grupos tratados e controle, respectivamente

a detecção da expressão de ARNm de AR em tumores prostáticos por qRT-PCR

o ARN total foi isolado a partir de tecidos tumorais, seguindo as instruções fornecidas com o kit VILO SuperScript RT-PCR Síntese (Invitrogen). A concentração e a integridade do ARN foi determinada por análise espectrofotométrica a A260 e A280. Aproximadamente 500 ng de RNA total foi transcrito reverso com Superscript III (Invitrogen) usando iniciadores aleatórios N6. Cerca de 2 ul de ADNc foi amplificado utilizando um passo-PCR em tempo real em uma máquina rápida Applied Biosystems 7500 com o programa de lavagem normal. Os níveis de expressão relativa de ARNm de AR foram calculadas usando a fórmula, em que.

A detecção do nível de expressão da proteína de AR em tumores da próstata por análise Western blot

tecido de tumor de xenoenxerto foi homogeneizada com 1 ml de radioimunoprecipitação ensaio (RIPA) de tampão contendo inibidor de protease e centrifugou-se a 12000 g durante 10 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi armazenado a -80 ° C. A proteína total foi separado num gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana PVDF a 100 V durante 50 min. Os passos de Western blot foram os mesmos que os descritos para o

in vitro

experimento.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados quantitativos são apresentados como médias ± desvio padrão (± DP). Uma análise de uma via de variância (ANOVA) foi utilizado para comparar as médias de vários grupos (n 2). -amostras independentes testes t foram usados ​​para comparar as médias de cada grupo de tratamento e do seu grupo de controle relativo. A P-value (P) 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Propriedades físicas de nanobubbles transportando AR siRNA

As imagens obtidas por microscopia de campo brilhante mostrou isso. os nanobubbles foram homogêneos em tamanho e distribuídas uniformemente sem agregação significativa (Fig. 1A). Os nanobubbles regulares foram observados em microscópio óptico (1.000 ×) (Fig. 1C). microscopia de fluorescência confirmaram que a nossa abordagem rotulagem siRNA foi eficaz; apenas nanobubbles conjugados com Cy3 marcado AR siARN exibiu fluorescência vermelha (Fig. 1B), e ausência de fluorescência foi observada com os nanobubbles regulares (Fig. 1D). Os resultados obtidos com um analisador de tamanho de partícula indicado que os nanobubbles tinha um diâmetro médio de 609,5 ± 15,6 nm (gama, 269-1030 nm), e o seu potencial zeta foi -29,9 ± 6,6 mV. Os nanobubbles em branco tinha um diâmetro médio de 509,3 ± 45,19 nm (gama de 324-930 nm), e o potencial zeta destas bolhas era -27,3 ± 6,4 mV. Como mostrado na Fig. 2, a quantidade de siRNA carregado aumentou de uma forma dependente da dose. A capacidade média de carga AR siRNA dos nanobubbles foi (18,94 ± 0,35) × 10

-9 nmol /nanobubble.

(A) nanobubbles PLL sob microscopia de campo brilhante. (B) Óbvio fluorescência foi observada nos nanobubbles PLL. (C) nanobubbles em branco sob microscopia de campo brilhante. (D) no fluorescência foi observada nos nanobubbles em branco. As setas vermelhas nas imagens indicam nanobubbles (1.000 ×).

condições de irradiação óptimas para transfecção

Fig. 3 mostra os efeitos de vários parâmetros de irradiação ultra-sónica sobre o crescimento de células C4-2. Um volume de nanobubbles superior a 6 uL (o rácio do número de série /célula nanobubble foi 135:1) resultou numa redução significativa no crescimento celular (P 0,05 comparado com o controlo) (Fig. 3A). Um MI superior a 1,4 também causou uma inibição significativa do crescimento das células (P 0,05 comparado com o controlo) (Figura 3B.). No entanto, o impacto do tempo de irradiação sobre o crescimento de células verificou-se ser bastante baixo; houve diferenças significativas em praticamente nenhum crescimento das células entre os grupos tratados com diferentes tempos de irradiação (Fig. 3C). Assim, as condições de irradiação não destrutivos foram finalmente determinada como sendo uma proporção de número de série nanobubble /célula 135:1 ( 6 ul de nanobubbles), um MI. 1,4, e uma irradiação tempo ≤2 min

(a) o impacto da concentração nanobubble (com um MI de 1,0 e um tempo de irradiação de 30 s), L: expostos aos ultra-sons; (B) o impacto do MI, com uma relação /número da célula nanobubble de 100:1 e um tempo de irradiação de 30 s; e (C) o impacto do tempo de irradiação, com uma relação /número da célula nanobubble de 100:1 e um MI de 1,0. As células foram contadas 24 horas após a irradiação ultra-sónica. Todos os ensaios foram repetidos três vezes. Os dados são apresentados como médias ± DP (n = 3). Asteriscos (*) representam o nível de significância em comparação com o controle (P 0,05)

ensaio de eficiência de transfecção em células de câncer de próstata

fluorescência vermelha (indicativo de Cy3 marcado com AR. siARN) foi observado na maioria das partes do citoplasma em todas as linhas celulares de cancro da próstata três, mas não foi detectado no núcleo (Fig. 4). Estes resultados indicam que o Cy3 marcado AR siARN foi transfectada com sucesso. As percentagens de células transfectadas nestas linhas celulares sob diferentes condições de irradiação de ultra-sons são mostrados na Tabela 2.

fluorescência vermelha no citoplasma indica que o Cy3 marcado AR siARN foi transfectado com êxito (400 × de ampliação).

Como se mostra no Quadro 2, quando transportando nanobubbles AR siRNA foram administrados a uma razão número nanobubble /número de células de 100:1 (5 ul de nanobubbles), a percentagem de células transfectadas, juntamente com o aumento aumentos de MI e tempo de irradiação. A maior eficiência da transfecção foi obtida com um MI de 1,2 e um tempo de irradiação de 2 min. Portanto, os parâmetros optimizados para conseguir a maior eficicia de transfeco foram como se segue: 5 uL de nanobubbles, um MI de 1,2, e um tempo de irradiação de 2 min; o seguinte

in vitro

ensaios foram realizados utilizando esses parâmetros.

O crescimento celular inibição

A análise CCK-8 a partir do primeiro ao sexto dia após a transfecção indicou que o crescimento celular foi inibida nos Grupos 3, 5, e 6 das células C4-2 e LNCaP (Fig. 5A e 5B). No sexto dia após a transfecção, as células em C4-2 Grupo 6 apresentada a maior taxa de inibição do crescimento em 64,7%. No entanto, nenhuma inibição de crescimento celular significativo foi observado nas células PC-3, e a taxa de inibição de crescimento no grupo 6 foi apenas de 0,9% (Tabela 3).

foi observada inibição significativa do crescimento de células em três Grupos, 5, 6 e para ambas as linhas celulares. Os dados são apresentados como médias ± DP (n = 10). Grupos 1-6 representam nua siRNA AR + nanobubbles em branco, nanobubbles transportando AR siRNA, AR siRNA + irradiação ultra-sônica nua, nanobubbles em branco + irradiação ultra-sônica, siRNA AR nua + nanobubbles + irradiação ultra-sônica em branco e nanobubbles transportando irradiação ultra-sônica AR siRNA +, respectivamente .

os níveis de expressão de ARNm de AR analisadas por RT-PCR

Os resultados de electroforese em gel de agarose seguintes RT-PCR são mostrados na Fig. 6A. Bandas de 275 bp (AR) e 159 pb (GAPDH) foram observados em todos os grupos de ambas as células C4-2 e LNCaP. bandas AR não foram observados em qualquer um dos PC-3 grupos porque as células PC-3 não expressam AR. Os resultados da análise quantitativa (Fig. 6B) mostraram que, em ambas as linhas celulares, expressão de ARNm de AR foi significativamente suprimida em grupos 3, 5 e 6 em comparação com o de controlo (Grupo 1). A maior supressão foi conseguida no Grupo 6.

Lanes 1-6 representam Grupos 1-6, respectivamente (Group1: siRNA + NB, Grupo2: siRNA-NB, Group3: siRNA + US, Group4: NB + US , Group5: siRNA + NB + US, gRUPO6: siRNA-NB + US). Os tamanhos dos marcadores (pista M, de baixo para cima) são 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 e 450 pb. GAPDH serviu como uma referência interna. Observou-se a maior supressão da expressão de ARNm de AR no Grupo 6. (A) e (B): Bandas de produtos de RT-PCR e os resultados de quantificação de imagem; os dados dos histogramas representam as médias ± desvio padrão de cinco experiências independentes. (* P 0,05 e ** P 0,01 vs. Grupo 1 C4-2 células; # P 0,05 e ## P 0,01 vs. Grupo células LNCaP 1).

Pós-transfecção Os níveis de expressão de proteína AR analisadas por análise de Western blot

Os resultados de Western blot são mostrados na Fig. 7. A expressão da proteína AR foi suprimida em grupos de 3, 5, e 6 das células C4-2 e LNCaP. A maior supressão foi observado no Grupo 6, que foi consistente com os resultados de RT-PCR

Lanes 1-6 representam Grupos 1-6, respectivamente (Grupo 1:. SiRNA + NB, Grupo2: siRNA-NB, Group3 : siRNA + US, Group4: NB + US, Group5: siRNA + NB + US, gRUPO6: siRNA-NB + US). proteína GAPDH serviu como uma referência interna. A maior supressão foi observado no grupo 6. (A) e (B): Imuno-bandas e os resultados de quantificação de imagem; os dados dos histogramas representam as médias ± desvio padrão de cinco experiências independentes. (* P 0,05 e ** P 0,01 vs. Grupo 1 C4-2 células; # P 0,05 e ## P 0,01 vs. Grupo células LNCaP 1).

Imagem de nanobubbles levando AR siRNA na C4-2 cancro da próstata modelo de xenotransplante

imagens dinâmicas com contraste de nanobubbles transportando AR siRNA são mostrados na Fig. 8. Os resultados indicaram que os nanobubbles alcançado sinais mais fortes do que SonoVue na área hipovascular central dos tumores. A análise de dados de imagem (Tabela 4) mostrou que estes nanobubbles teve aumentos significativos na intensidade do pico e a duração de imagem em comparação com o controlo SonoVue (P 0,05). Na área tumor torno, os nanobubbles também mostrou significativamente mais longo imagiologia durações que SonoVue (P 0,05).

(A) Uma amostra de tumor xenoenxerto;