Abstract

Fundo

O presente estudo foi realizado para caracterizar o efeito de anti-metabolitos na indução CXCL8 sinalização e determinar se a sinalização CXCL8 constitutiva e /ou induzida por drogas na próstata metastático câncer (PAC) células modula sua sensibilidade a esta classe de agente.

Métodos

a resposta das células CaP metastático em 5-fluorouracil (5-FU), pemetrexed ou Tomudex foi determinada utilizando células contar ensaios, citometria de fluxo e análise de clivagem PARP. Quantitative PCR, ELISA e imunotransferências foram utilizados para determinar os efeitos de drogas ou administração CXCL8 sobre a expressão do gene alvo /proteína.

Resultados

A administração de 5-FU, mas não a secreção de CXCL8 potenciada pemetrexed e aumentou a expressão do gene de CXCR1 e CXCR2 em células PC3 metastáticas. Consistente com isto, a inibição da CXCL8 sinalização utilizando um antagonista de CXCR2, AZ10397767, aumentou a citotoxicidade de 5-FU por 4 vezes (P 0,001), e um aumento da apoptose induzida por 5-FU em células PC3 (P 0,01). Em contraste, enquanto que a administração de AZ10397767 teve nenhum efeito sobre a sensibilidade de pemetrexed, o antagonista de CXCR2 exercida o maior efeito no aumento da sensibilidade das células PC3 de Tomudex, um inibidor dirigido a timidilato-sintase (TS). Experiências subsequentes confirmaram que a administração de CXCL8 humana recombinante aumento da expressão de TS, uma resposta mediada em parte pelo receptor CXCR2. Além disso, knockdown mediada por siARN da CXCL8 gene-alvo de Bcl-2 para aumentar a sensibilidade das células PC3 de 5-FU.

Conclusões

sinalização CXCL8 fornece uma resistência selectiva de células de cancro da próstata metastático a anti-metabolitos específicos, promovendo uma resistência associada ao alvo, além de sustentar uma evasão de apoptose induzida pelo tratamento

Citation:. Wilson C, Maxwell PJ, Longley DB, Wilson RH, Johnston PG, Waugh DJJ (2012) Constitutivo e Tratamento Induzida CXCL8-Sinalização seletivamente Modula o Eficácia de anti-metabolito Therapeutics no câncer de próstata metastático. PLoS ONE 7 (5): e36545. doi: 10.1371 /journal.pone.0036545

editor: Kin Mang Lau, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 Dezembro, 2011; Aceito: 10 de abril de 2012; Publicado em: 09 de maio de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wilson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A investigação foi suportado por uma concessão de pesquisa irrestrito da Fundação do Câncer Ulster (DJJW e PGJ) e um prêmio PhD bolsa (CW) do Departamento de Emprego e Aprendizagem, Irlanda do Norte. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O tratamento de câncer de próstata metastático resistente à castração avançado (CRPC) continua a ser uma necessidade não atendida clínica significativa. A recente aprovação de abiraterona-acetato como um tratamento de segunda linha em CRPC é um grande avanço, no entanto, este agente que tem como alvo a via de síntese de andrógenos fornece apenas uma melhoria limitada na sobrevida global e apenas os pacientes com uma boa vantagem performance status de sua disposição [1], [2]. Muitos pacientes não vai atender a performance status preferencial que é ideal para resposta a abiraterona. Além disso, muitos tumores será resistente à abiraterona no tratamento de segunda linha. Consequentemente, isso exige que os esforços para expandir o arsenal de agentes disponíveis para os médicos que tratam CRPC não está relaxado. Tais esforços não deve ser limitado apenas à descoberta de novos agentes, mas deve explorar o nosso conhecimento continua a biologia da doença para definir os mecanismos de resistência e identificar novos agentes que possam ser explorados para melhorar a eficácia dos agentes de quimioterapia existentes.

a quimioterapia convencional tem sido largamente ineficaz no tratamento de CRPC; docetaxel continua a ser o único agente de quimioterapia para obtiveram aprovação para CRPC, na base de uma melhoria na sobrevivência global limitada [3]. O anti-metabolito 5-FU tem sido um pilar da quimioterapia de tumores sólidos há mais de cinco décadas; ao entrar na célula, o 5-FU é convertida em três metabolitos activos, trifosfato fluorouridina (FUTP), trifosfato flurodeoxyuridine (FdUTP) e monofosfato flurodeoxyuridine (FdUMP), que são mis-incorporada no ARN, promover a danos no ADN, ou contribuir para a inibição da enzima timidilato sintase, respectivamente [4]. Recentes estudos de fase II de 5-FU e seu análogo de capecitabina oral, mostraram que eles sejam seguros no tratamento de segunda linha para CRPC metastático, com respostas modestas observadas quando administrado em combinação com o docetaxel ou oxaliplatina [5], [6]. Embora estes permanecem claramente respostas sub-óptima, a capacidade para atingir rapidamente proliferação de células CaP induzindo um bloco de fase S e, posteriormente, apoptose indução continua a ser um cenário terapêutico atraente, especialmente em tumores que se tornaram refratários à terapia anti-andrógeno.

células cancerosas da próstata estão sujeitos a um CXCL8 autócrino pronunciado sinalização estímulo, que aumenta com a fase da doença e é máxima na doença de castração-resistente [7], [8]. A magnitude de sinalização CXCL8 é potenciada por factores ambientais, tais como a hipoxia [9] e tensões induzidas quimicamente, incluindo a exposição a agentes de quimioterapia [10], [11], que simultaneamente regular a expressão do ligando e os receptores através dos quais medeia a sua biológica efeitos, isto é, CXCR1 e CXCR2. CXCL8 promove a progressão para castrar-resistência através da activação independente do ligando do receptor de androgénio (AR) [12], [13] e induz a proliferação de células de cancro da próstata metastático [7], [14] (). Além disso, mostrámos que a sinalização CXCL8 induzida pelo stress atenua a sensibilidade de células de cancro da próstata para sofrer apoptose em resposta a agentes que danificam o ADN [9], [10], inibidores de Hsp90-dirigidas [15], agonistas de receptor de morte (TRAIL) [11] e terapêutica, como bicalutimide (Casodex) [13] AR-alvo.

o objetivo deste estudo foi determinar como a sinalização CXCL8 intrínseca e /ou induzida pelo tratamento modula a resposta das células CRPC a anti -metabolites.

Materiais e Métodos

química e Reagentes

Todos os produtos químicos eram fonte da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), salvo indicação contrária. 5-FU foi obtido a partir de Bridgewater Quimioterapia Suíte, Belfast City Hospital. Pemetrexed foi um presente amável do Dr. Dean Fennell (CCRCB, QUB, Belfast, Reino Unido). AZ10397767 foi gentilmente cedido pelo Dr. Simon T. Barry e Dr. David Blakey (AstraZeneca, Alderley Park, Cheshire, Reino Unido).

Cultura celular

células cancerosas da próstata PC3 foram cultivados como descrito anteriormente [10]. Em experiências subsequentes de sinalização que investigam CXCL8, as células PC3 foram incubadas em RPMI isento de soro 1640 durante 16 h antes de exposição a 3 nM humana recombinante (rh) -CXCL8 (Peprotech, Londres, Reino Unido).

Os agentes citotóxicos

5-FU e pemetrexed foram armazenadas a 4 ° C como soluções de estoque 10 mM. As diluições em série foram feitas em água estéril para injecção e medicamentos foram adicionados directamente às células para se obter a concentração desejada do agente citotóxico. No caso de tratamento com 5-FU, as células foram mantidas e tratou-se em meio contendo FCS dialisado.

siRNA transfecções

transfecções siRNA foram realizadas como anteriormente descrito [11]. As células (5 × 10

5) foram lavadas duas vezes em PBS estéril e depois incubadas com uma mistura de transfecção compreendendo meio OptiMEM, oligofectamine (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), e o oligonucleótido específico (Bcl-2 de 200 nM; Dharmacon Inc) durante 48 h a 37 ° C. Uma sequência de direccionamento não foi incluído nestas experiências na mesma concentração que a sequência de ARNsi utilizada.

Contagem celular Análise

As células (1 x 10

5 células /poço) foram permitidos a aderir durante a noite. O meio foi substituído com meio fresco RPMI 1640 e tratou-se com uma gama de concentrações de 5-FU ou pemetrexed na ausência ou na presença de AZ10397767 (20 nM). As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera durante 72 h, depois tripsinizadas e contadas utilizando um Coulter® Z

TM Série contagem de partículas e analisador de tamanho (Beckman Coulter, Miami, FL) como previamente descrito [10]. Os números de células foram normalizados para os valores de controlo e de análises estatísticas dos dados realizada utilizando o software GraphPad Prism 3.0.

Citometria de Fluxo

A análise do ciclo celular foi avaliado por coloração com iodeto de propidio de células como descrito anteriormente [ ,,,0],10].

Immunoblotting

foram preparados lisados ​​de células inteiras, resolvido e apagado, como descrito anteriormente [7]. As membranas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris /0,1% de Tween-20 (TBS-T), em seguida, bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente em 5% de albumina de soro bovino /TBS-T (BSA /TBS-T). As membranas foram sondadas com anticorpos primários para Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), TS (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA) ou PARP (eBiosciences Inc., San Diego, CA, EUA). As membranas foram lavadas três vezes em TBS-T e, em seguida, incubadas com uma peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpo secundário (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, Reino Unido). Após três lavagens em TBS-T, as bandas foram detectadas utilizando quimioluminescência amplificada (ECL, mais reagentes, Amersham Biosciences). As membranas foram re-sondado com anticorpo GAPDH para assegurar a igualdade de carga (Biogenesis, Dorset, Reino Unido).

Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

RNA foi colhido como descrito anteriormente [9]. Para PCR em tempo real, de 1 ug de ARN total foi de oligo (dT) reversamente transcrito usando MMLV-RT (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. 50 ng de cDNA foi misturado com os iniciadores (2 nM) e água estéril mastermix SYBR Green PCR (Roche Diagnostics, Sussex, UK). As sequências de iniciador foram como anteriormente relatado [9]. PCR em tempo real foi levado a cabo numa placa de 96 poços utilizando um instrumento luz LC480 cycler (Roche Diagnostics). O ciclo de limiar (C

P) foi calculado para cada reacção pelo sistema LC480. Os níveis de expressão desconhecidas foram determinadas utilizando o método de curva padrão relativo e normalizados contra 18S.

ELISA

A quantidade de CXCL8 secretada detectada no meio de células de cancro da próstata foi determinada utilizando um ensaio ELISA de acordo com as instruções do fabricante (kit de ELISA Pelikine compacto CXCL8, Beckman Coulter, High Wycombe, Reino Unido), como descrito anteriormente [9]. A concentração CXCL8 em cada amostra foi calculado por comparação com uma curva padrão gerada a partir de um frasco de estoque de CXCL8.

Resultados

5-FU potencia sinalização da quimiocina em células metastáticas CaP

a linha celular PC3 foi originalmente isolado a partir de uma metástase óssea do tampão e, portanto, é considerada como um sistema modelo clinicamente relevante para estudar CaP avançado [16]. Uma vez que estudos anteriores demonstraram agentes de quimioterapia induzem a síntese de CXCL8, as nossas experiências iniciais focada em caracterizar os efeitos da administração de anti-metabolitos sobre a secreção deste quimiocina. Além da utilização de 5-FU, as nossas experiências iniciais foram também conduzidos usando pemetrexed, um anti-folato multi-alvo que inibe a timidilato sintase (TS), di-hidrofolato redutase (DHFR), e glicinamida ribonucleótido formiltransferase (GARFT), todas as enzimas envolvidas na

de novo

biossíntese de timidina e purina nucleotídeos [17]. Um ELISA específico foi utilizada para quantificar a secreção a partir de células PC3 CXCL8 ao longo de 8 h timecourse, comparando controles pareados por tempo a partir de 5-FU-tratados ou tratados com pemetrexed células. A administração de 5-FU promoveu um aumento significativo na secreção de CXCL8 a partir de células PC3 (P 0,05) (Figura 1A). No entanto, a administração de pemetrexed teve efeitos desprezáveis ​​sobre a secreção de CXCL8 (Figura 1B). Para verificar as nossas observações, experiências foram repetidas na linha celular de cancro da próstata LNCaP; adição de 1