Abstract

Fundo

O número de pacientes com carcinoma endometrial (EMCA ) com o estágio avançado ou alto grau histológico está aumentando e prognóstico não melhorou para ao longo da última década. Há uma necessidade urgente para a descoberta de novos alvos moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento da EMCA, que têm o potencial de melhorar a estratégia clínico ea evolução da doença.

Metodologia e Resultados

Nós usamos uma abordagem proteômica “drill-down” para facilitar a identificação de novos alvos moleculares para o diagnóstico, prognóstico e /ou intervenção terapêutica para a EMCA. Com base em iões de péptidos identificados e os seus tempos de retenção na primeira análise por LC-MS /MS, uma lista de exclusão foi gerado por iterações subsequentes. Um total de 1529 proteínas foram identificadas abaixo do limiar de erro de 5% Proteinpilot® dos sete conjuntos de experiências realizadas iTRAQ. Em média, a segunda iteração adicionado 78% de novos peptídeos para aqueles identificados após a primeira corrida, enquanto a terceira iteração adicionado 36% peptídeos adicionais. Dos 1529 proteínas identificadas, apenas 40 satisfeito nossos critérios para expressão diferencial significativo na EMCA em comparação com tecidos proliferativos normais. Estas proteínas incluídas enzimas metabólicas (piruvato-quinase M2 e lactato desidrogenase A); proteínas de ligação de cálcio (S100A6, calcyphosine e calumenin), e proteínas envolvidas na regulação da inflamação, proliferação e invasão (anexina A1, interleucina-ligação potenciador factor de 3, alfa-1-antitripsina, o nivelamento da proteína de macrófagos e a catepsina B). Rede análises regulação destes alvos moleculares por c-myc, Her2 /neu e TNF alfa revelou, sugerindo a intervenção com estas vias pode ser uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novas terapias direcionadas moleculares para EMCA.

Conclusões

as nossas análises revelaram a importância de drill-down abordagem proteômica em combinação com iTRAQ para superar algumas das limitações das estratégias proteômicas atuais. Este estudo levou à identificação de um número de alvos moleculares novos que têm potencial terapêutico para terapias moleculares orientadas para carcinoma endometrial

Citation:. Voisin SN, Krakovska O, Matta A, DeSouza LV, Romaschin AD, Colgan TJ, et ai. (2011) identificação de alvos moleculares Novel para o cancro endometrial usa uma broca-Down Approach LC-MS /MS com iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10.1371 /journal.pone.0016352

editor: Yang Cai, O Instituto de Pesquisa para Crianças, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de agosto de 2010; Aceito: 20 de dezembro de 2010; Publicado: January 31, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Voisin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio do Instituto canadense Society Cancer Research (anteriormente o National Cancer Institute of Canada) é reconhecido agradecimento. AB SCIEX forneceu apoio infra-estrutural e reagente desta pesquisa; Ajay Matta é o destinatário de uma MITACS Acelerar Fellowship, Ontário, Canadá. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. AB SCIEX fornece suporte de infra-estrutura e reagente desta pesquisa, mas não tem entrada editorial a este manuscrito. Além disso, isso não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

carcinoma endometrial (EMCA) é o quarto tipo de câncer mais prevalente em mulheres América do Norte, com 42160 novos casos e 7780 mortes prevista para este ano em os EUA sozinhos [1]. Existem dois tipos principais de cancro do endométrio: Tipo I EMCA da histologia endometrioid e Tipo II EMCA que é célula seroso ou clara na morfologia, o último tipo normalmente ser o mais agressivo dos dois. Tipo I EMCA é a forma mais comum de cancro do endométrio, constituindo cerca de 70-80% do total de casos [2], [3]. O diagnóstico baseia-se principalmente no exame histológico dos tecidos obtidos após uma biópsia, um procedimento invasivo tipicamente realizada como um resultado do diagnóstico de investigação sobre a hemorragia uterina anormal na apresentação. carcinomas do endométrio foram tratados principalmente por meio de cirurgia com radiação adicional e /ou quimioterapia, e os resultados relativamente favoráveis ​​foram alcançados desde que os cancros são detectados precocemente. No entanto, o número de pacientes com EMCA em estágio avançado ou alto grau histológico, o que é indicativo de um mau prognóstico, está a aumentar [2], [4]. Existe uma necessidade urgente para a descoberta de novos alvos moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento da EMCA, que terão o potencial para melhorar a estratégia clínica e resultado da doença.

Recentemente, tem havido intensa interesse no estudo da expressão da proteína global, e abordagens proteômicas parecem apresentar uma nova estratégia para a investigação do cancro e na identificação de novos biomarcadores para aplicação clínica. Numerosos estudos de proteómica realizadas nos últimos anos têm tentado descobrir biomarcadores de câncer potencial através de proteínas diferencial de rastreio utilizando o câncer e tecidos não cancerosos [5] – [9]. Uma das tecnologias mais utilizadas para a descoberta de biomarcadores é uma abordagem de baixo para cima que envolve a marcação química de péptidos resultantes da digestão enzimática de proteínas de amostra, seguido de mistura das amostras de controlo e de ensaio antes da cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC- MS /MS) análise para assegurar um tratamento idêntico de amostras de [6], [7], [9]. Entre os mais comuns destes reagentes de rotulagem em uso atualmente são as tags isobáricos para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) [10]. Marcação de péptidos permite distinguir de outro modo idênticas provenientes de amostras individuais na mistura por meio de iões repórter formados a partir destes tags, que permitam a quantificação relativa do péptido determinada nas amostras, e, assim, a proteína correspondente. Devido à complexidade das amostras de tecido, um pré-fraccionamento das amostras utilizando forte permuta catiónica (SCX) é tipicamente realizado, antes da separação analítica numa coluna nanoescala de fase reversa (RP), o qual é acoplado em linha com o espectrómetro de massa. Apesar desta separação cromatográfica bidimensional, há ainda uma tendência para um grande número de péptidos de co-eluem durante a separação RP por causa da complexidade da amostra. Como resultado, o espectrómetro de massa é normalmente apenas capaz de analisar uma fracção dos péptidos devido a restrições de tempo. Em uma aquisição automática de dados, o software MS tende a favorecer a análise dos péptidos mais abundantes em detrimento de péptidos co-eluição de abundâncias inferiores. Como muitas proteínas cancerígenas relevantes, incluindo proteínas reguladoras de sinalização e, normalmente são expressas em baixas concentrações, este bottom-up, a abordagem shotgun tende a perder em adquirir a informação mais valiosa-[11]. Uma possível solução para este problema é uma análise iterativa da mesma amostra, juntamente com uma lista de exclusão de peptídeos identificados que são gerados após cada corrida e usados ​​para informar a escolha de íons que são direcionados para análise MS /MS durante as corridas subsequentes. Esta estratégia obriga o espectrômetro de massa para atingir novos, peptídeos menos abundantes para análise MS /MS durante cada iteração sucessiva. Variações desta abordagem têm sido relatados por laser assistida por matriz dessorção /ionização (MALDI) MS /MS e ESI-MS /MS [12], [13].

No estudo, utilizou-se uma análise iterativa , referido aqui como o “drill down abordagem”, para facilitar a identificação de novos alvos moleculares para o diagnóstico, prognóstico e /ou intervenção terapêutica para o cancro endometrial. O principal objetivo deste método de drill-down é a desenterrar mais peptídeos. Após a primeira análise por LC-MS /MS, os iões peptídicos identificados e o seu tempo de retenção foram adicionadas para gerar uma lista de exclusão para mais iterações em análise por LC-MS /MS. A nossa abordagem é conceitualmente similar à “exclusão precursor íon seletivo” método (sel-PIE) descrito anteriormente por Wang

et al.

[11]. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que uma tal combinação de quantificação de proteínas utilizando rotulagem iTRAQ e abordagem de análise iterativa tem sido usada para a descoberta de biomarcadores de câncer.

Resultados

Identificação de proteínas usando iterativo análise com iTRAQ

um total de 1529 proteínas foram identificadas pela Proteinpilot® a um nível de confiança de 95% a partir dos sete conjuntos de experimentos iTRAQ realizadas neste estudo. A primeira execução de todas as fracções identificado um total de 1137 proteínas não redundantes, com o segundo e terceiro iterações contribuem as 392 proteínas não redundantes restantes. Em média, a segunda iteração adicionado 78% de novos peptídeos para aqueles identificados após a primeira passagem, enquanto que a terceira iteração adicionado mais 36% de péptidos, como mostrado na Figura 1 e Tabela 1. Dentro de um dado conjunto, cerca de 12% dos péptidos eram comuns a quaisquer duas iterações sucessivas; No entanto, apenas 3 a 6% dos péptidos foram identificados em todas as três iterações. Como esperado, estes péptidos adicionais melhoraram a cobertura das proteínas identificadas. Na verdade, a segunda iteração adicionado 34% de novas proteínas em média, enquanto a terceira iteração adicionado apenas 14% para a lista combinada de iterações 1 e 2; assim, havia pouco incentivo para realizar novas iterações. 40% das proteínas identificadas durante a primeira passagem, também foram identificados nos próximos dois iterações (Tabela 1). Dos 1529 proteínas, 623 foram identificados por um único péptido; 423 dos quais mostraram ≥99% na confiança. As 906 proteínas restantes foram identificados, em média, com seis péptidos por proteínas, considerando apenas peptídeos com pontuações de confiança ≥95%. Dos 1529 proteínas identificadas no presente estudo, 1260 proteínas (isto é, 82%) tinham taxas de iTRAQ relatados para amostras de tecido EMCA. Uma lista completa das proteínas identificadas e os seus rácios médios iTRAQ está disponível na Tabela S1. Um gráfico mostrando a distribuição em funções celulares destas proteínas é mostrado na Figura 2.

Em média, a segunda iteração adicionado 78% de novos peptídeos para aqueles identificados após a primeira corrida, enquanto a terceira iteração adicionado 36% mais péptidos. Dentro de um dado conjunto, cerca de 12% dos péptidos eram comuns a quaisquer duas iterações sucessivas; no entanto, apenas 3 a 6% dos peptídeos foram identificados em todas as três iterações.

Identificação de proteínas diferencialmente expressos em EMCA

Para determinar proteínas diferencialmente expressos que podem servir como potenciais alvos moleculares para a avaliação do diagnóstico e /ou prognóstico da EMCA, todas as proteínas (n = 1529) identificado no presente estudo foram avaliados usando os critérios descritos no material seção de métodos. Uma lista de 40 proteínas que podem servir como potenciais marcadores para EMCA é mostrada na Tabela 2. Destes 40 biomarcadores candidatos, 38 foram identificadas com um mínimo de dois péptidos. As duas excepções (S100 A6 proteína e beta-2-glicoproteína 1 ligante de cálcio) foram incluídos como eles foram identificados por um peptídeo com ≥99% na confiança e inspeção manual mostrou excelente MS /MS qualidade espectral (Figuras S1 e S2) . iTRAQ valores individuais para a quantificação de proteína estão listados na Tabela S2a; uma lista de todos os péptidos identificados com um nível de confiança Proteinpilot ≥95% está disponível na Tabela S3. Tabela S4 lista as iterações na análise da amostra em que as proteínas da Tabela 2 foram quantificados. Como o EMCA e tecidos proliferativos normais foram obtidas a partir de diferentes indivíduos e foram, por conseguinte, não idêntico (isto é, as análises não foram replica), o conceito típico de desvio padrão na análise quantitativa pode ser enganadora como uma medida de qualidade analítica. Nós temos, portanto, optou para expressar as distribuições de variabilidade analítica e individual combinados da seguinte forma: nas nossas análises, 28% dos valores iTRAQ individuais desviem dentro de ± 10% dos seus meios, 54% ± 20%, e 88% dentro de ± 50% (ver Tabela S2B para detalhes). Estas distribuições são de apoio a nossa hipótese de que uma variação de 50% em proporções iTRAQ é indicativo da expressão diferencial. Na verdade, nós identificamos um grupo de 16 proteínas adicionais que só perdeu o corte de nossos critérios para expressão diferencial e que podem ainda qualificar-se após a inclusão de amostras adicionais (Tabela 3).

Avaliação potencial diagnóstico de proteínas diferencialmente expressos em EMCA

foram também avaliados outros parâmetros relevantes para os potenciais de diagnóstico. Estes incluem valores preditivos positivos (VPP) e áreas sob a curva (AUC) disponíveis a partir de características de funcionamento do receptor de análise (ROC). Os valores para os biomarcadores candidatos individuais estão listadas na Tabela 2.

A verificação da expressão diferencial de proteínas em tecidos EMCA

A sobre-expressão de biomarcadores candidatos seleccionados: catepsina B, calumenin, S100A6, lactato desidrogenase Um (LDHA), e nos tecidos HNRNPA1 EMCA foram verificados por análises de Western blot em um subconjunto das mesmas amostras de tecido utilizadas para iTRAQ LC-MS /MS. A Figura 3 mostra uma comparação de quatro tecidos EMCA (T) com quatro endométrio normais (N) para os cinco candidatos a biomarcadores com β-actina que servem como um controlo de carga. Além disso, imuno-histoquímica em um conjunto independente de amostras de tecido (n = 5 cada) revelou citoplasmática intensa e /ou imunomarcação nuclear de proteína S100A6 em células tumorais de endometrióides secções de tecido EMCA (resultados típicos são mostrados na Figura 4), ao passo que nenhum imunocoloração significativa foi observada nas células epiteliais do endométrio proliferativas normais.

se quantidades iguais de proteínas (50 ^ g /pista) foi resolvido em 10% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) em gel de poliacrilamida e depois electro-transferidas para polivinilideno-difluoreto (PVDF) da membrana. Após o bloqueio, as manchas foram incubadas com o anticorpo monoclonal respectivo rato em diluições apropriadas, a 4 ° C O /N. As membranas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com anticorpo secundário. bandas de proteínas foram detectadas pelo método de quimioluminescência aumentada (Cuidados de Saúde GE) na Kodak hiperfilme. A análise Western blot mostrou sobre-expressão de (i) S100A6, (ii) calumenin, (iii) a catepsina B, (iv) a lactato desidrogenase A (LDHA), e (v) de proteína heterogénea A1 (HNRNPA1) em tecidos de cancro do endométrio (T1, T2, T3 e T4) em comparação com o endométrio normal (N1, N2, N3 e N4). β-actina serviu como um controlo de carga mostrando quantidades iguais de proteína em cada pista.

A análise imunohistoquímica da proteína S100A6 foi realizada em secções de tecido embebidos em parafina independentes de cancro do endométrio e endométrio normal (n = 5 cada), tal como descrito em Materiais e Métodos. mostra o painel (a) Nenhum imunocoloração da proteína S100A6 no endométrio normal; (B) O câncer endometrial que mostra a expressão citoplasmática da proteína S100A6; e (c) controle negativo não mostrando nenhuma expressão da proteína S100A6.

Rede Análise

Realizamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para gerar redes que mostram regulamentos directos e indirectos /interações entre proteínas identificado no presente estudo. Estas redes mostram o envolvimento de jogadores chave, incluindo o TNF alfa, NFkB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenina, e proteínas de ERK1 /2, que regulam a inflamação e a sobrevivência e proliferação de células de tumor (Figura 5). A maioria dos alvos moleculares identificados neste estudo são regulados por c-myc, Her2 /neu, e TNF α, sugerindo, portanto, intervenção destas vias pode proporcionar um meio para o desenvolvimento de terapias específicas moleculares para o cancro endometrial.

Os potenciais alvos moleculares novos identificados neste estudo foram submetidos a via de análises usando Ingenuity Pathways Analysis software (IPA), Versão 7.5. A figura mostra (linhas em negrito) diretos e (linhas pontilhadas) indiretos regulamentos (→) /interações (-) entre os biomarcadores identificados neste estudo e outras proteínas associadas significativamente. Estas redes revelar o envolvimento de proteínas-chave, incluindo TNFa, NFkB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenina, JNK e ERK1 /2 proteínas que regulam a inflamação, sobrevivência e proliferação.

Discussão

tem havido um interesse recente considerável na identificação de potenciais marcadores de cancro para o diagnóstico e prognóstico via proteomic análise diferencial. As várias edições, armadilhas e sucessos destes estudos de biomarcadores de proteômica baseada foram discutidos e revistos [14] – [17]. O presente estudo permitiu a identificação de proteínas 40 que mostram a expressão diferencial significativa em EMCA em comparação com os tecidos proliferativos normais. Estas proteínas incluem enzimas metabólicas [piruvato-quinase M2 (PKM2) e lactato desidrogenase A (LDHA)]; proteínas de ligação de cálcio (S100A6, calcyphosine e calumenin); e proteínas envolvidas na regulação da inflamação, proliferação e invasão [anexina A1 (ANXA1), interleucina-factor potenciador de ligação 3 (ILF3), alfa-1-antitripsina (AAT), proteína de macrófagos capping (CapG) e catepsina B]. Vários relatórios demonstraram a influência do receptor de estrogénio (ER) e p53 sobre a expressão destas proteínas, o que garante a verificação de todas as observações em tecidos EMCA em maior escala. Entre as proteínas identificadas neste estudo, nós relatado anteriormente expressão alterada de AAT, CapG, piruvato quinase M1 /​​M2, e creatinase quinase B. Duas dessas proteínas (piruvato-quinase M2 e creatinase quinase B) foram incluídos aqui para consideração, investigação manual como adicional dos dados revelou que, enquanto as alterações de relação de expressão para estas duas proteínas eram pouco menos de 50% (piruvato-quinase M1 /​​M2, 1,43; e creatinase quinase B, 0,69), fizeram conhecer os outros dois critérios (ver Materiais e Métodos). Além disso, um estudo independente usando imuno-histoquímica em um tissue microarray (n = 148 pacientes) realizado pelo nosso grupo demonstrou o potencial notável de AAT e PKM2 como biomarcadores de diagnóstico para a EMCA [18] – [20]. É de salientar que o aumento da quantidade de PKM2 tumor também foi avaliado nas células tumorais e EDTA plasma de pacientes com cancros do rim, do pulmão, da mama, do tracto do colo do útero e gastrointestinal, bem como em amostras de fezes de pacientes com cancro colo-rectal e do estômago [21]. Assim PKM2 pode actuar como um indicador geral de malignidade, em vez de ser específico para EMCA. Esta associação com tumorigênese em geral, é, talvez, compreensível à luz da função do PKM2 [21]. A mudança para a isoforma M2 de piruvato quinase em células tumorais é necessário para induzir o efeito Warburg. A expressão aumentada de PKM2 contribui para um ambiente metabólico que é passível de proliferação de células sob condições hipóxicas e promove o crescimento de células de tumor [22], [23]. Assim, PKM2 actua como um sensor metabólica, o que permite que a célula do tumor para adaptar o seu metabolismo para variações no fornecimento de nutrientes. Curiosamente, LDHA também mostraram a sobre-expressão em tecidos EMCA neste estudo, e é conhecido por PKM2 transporta preferencialmente piruvato em lactato desidrogenase [24]. A fosforilação da tirosina de lactato desidrogenase facilita a proteína de ligação a PKM2, canalizando desse modo, o produto da cinase piruvato em lactato [25]. Isto ajuda na geração de dinucleótido adenina nicotinamida (NAD

+) necessário para manter um elevado fluxo glicolítico em células tumorais. Esta conversão metabólica da glicólise torna auto-suficiente, desde que a captação de glicose elevada é viável. Uma elevada taxa glicolítica proporciona intermediários sintéticos para proliferação rápida de células tumorais, necessária para replicar a biomassa celular e genoma em cada divisão celular [24], [26].

Outro grupo importante de proteínas verificou-se que em tecidos desregulada EMCA inclui quatro proteínas de ligação de cálcio: S100A6, calcyphosine (CAPS), calumenin (CALU), e anexina A1 (Tabela 2). S100A6 é predominantemente uma proteína citoplasmática, mas na presença de Ca

2+, pode-se associar com a membrana plasmática e do envelope nuclear. Nossa análise imuno-histoquímica mostrou coloração citoplasmática e /ou nuclear de S100A6, predominantemente nas células tumorais de endometrioid EMCA. Isto é ainda apoiada pela presença de proteína S100A6 no citoplasma e núcleo de pulmão, pele, e células do adenocarcinoma ductal pancreático [27] – [29]. S100A6 desempenha um importante papel na reorganização do citoesqueleto, invasão, sobrevivência e proliferação por regulação das funções de vários alvos moleculares, incluindo p53, β-catenina, anexinas, tropomiosina, calponina, proteína /Siah-1 que interactua com a proteína de ligação a calcyclin (CacyBP /SIP ) e Hsp90 /Hsp70-organização proteína (Hop) [30] – [33]. A sobre-expressão de S100A6 tem sido associado com prognóstico pobre em pulmão, gástrico e pancreático [27], [31], [33]. Dos quatro Ca

2 + proteínas reguladoras encontrados para ser diferencialmente expressos neste estudo, apenas calcyphosine foi previamente relatado para ser associado com mau prognóstico em pacientes EMCA [34]. Anexina A1 (ANXA1), verificou-se ser sobre-expresso em tecidos EMCA neste estudo, é uma proteína anti-inflamatória endógena. Anexinas constituem uma família de Ca

2 + proteínas /lipidos-ligação envolvidos em diversas funções celulares, tais como a agregação de membrana, a inflamação, a fagocitose, a proliferação e apoptose [35]. Juntos, estes resultados sugerem que o cálcio-fosfatidilinositol e cascatas de AMP cíclico pode desempenhar um papel importante na regulação da função celular, proliferação, diferenciação e na carcinogénese do endométrio.

Notavelmente, o nosso estudo indica também um papel importante inflamação regulamentar e RNA binding proteins em EMCA de alta qualidade. A sobre-regulação da anexina A1 acima mencionada em conjunto com a regulação negativa das apolipoproteínas, fibrinogens e haptoglobina sugere supressão do processo inflamatório nos tecidos que rodeiam o tumor. A interleucina-3 de ligação potenciador fator (ILF3 ou NF90) e ribonucleoproteína heterogénea A1 (PRNhn A1) são proteínas de ligação a ARN que regulam a expressão de várias proteínas envolvidas na sobrevivência e proliferação de células de tumor [36] – [38]. Entre outros, a sobre-expressão de H1 serpina, F-actina capping subunidade proteína beta (CAPZB), macrófagos capping proteína (CapG), vilina 2 (EZR) e catepsina B (CTSB) são conhecidos para promover a motilidade celular e a invasão nos tecidos tumorais [ ,,,0],39] – [42]. Entre as potenciais marcadores moleculares que poderiam ajudar no diagnóstico ou prognóstico de EMCA, alguns, tais como PKM2, LDHA e catepsina B foram já exploradas para o seu potencial terapêutico em outros cancros. A inibição da PKM2 e LDHA, utilizando ARN interferente curto (siRNA) ou inibidores, houve uma diminuição da proliferação celular devido à indução de estresse oxidativo, resultando em apoptose [43] – [47]. Além disso, a regulação negativa de células de câncer de pulmão PKM2 sensibilizados a cisplatina e doxorrubicina siRNA mediada. O potencial destas proteínas para servir como alvos para novas terapias baseadas alvo-molecular, portanto, tem de ser determinado no contexto de cancro do endométrio também.

Neste estudo, a abordagem drill-down melhorou o número de proteínas identificadas, embora foi detectado um conjunto de peptídeos em todas as corridas de qualquer amostra. Essas instâncias de detecção repetida são atribuíveis a mudanças no tempo de retenção, tailing pico, vários encargos e modificações (por exemplo, de-amidação e oxidação de metionina). Após a análise do primeiro conjunto iTRAQ, melhoramos a precisão da injeção fração e ampliou as janelas de exclusão para ambos tempo e

m /z

, de ± 5 a ± 7 min, e de 100 MDA 120 ppm , respectivamente para mitigar alguns destes desafios. Nós não escolheu para excluir íons com base nas diferenças de carga ou modificação, pois isso teria aumentado a lista de exclusão para além de um tamanho prático, e, adicionalmente, que argumentou que alguma redundância com base nas diferenças de carga ou modificação pode servir para aumentar a confiança de identificação. Assim, o iterativo analisa empregamos um equilíbrio entre a profundidade da análise e tratabilidade. No entanto, esta identificação através de múltiplos peptídeos significa que o número de proteínas identificadas provavelmente aumentou a uma taxa mais lenta do que teria sido possível se que implementada a exclusão de diferentes estados de carga e modificações. Curiosamente, o número total de proteínas identificadas no presente estudo foram comparáveis ​​às identificadas no nosso estudo anterior (1,529 contra 1,388 proteínas, respectivamente), apesar de trabalho aqui apenas com metade da quantidade de material de partida (100 contra 200 ug /amostra utilizada anteriormente ) [18].

em conclusão, a nossa análise revela claramente a importância do drill-down abordagem proteômica em combinação com iTRAQ na identificação de candidatos biomarcadores para o câncer endometrial. Este estudo revela êxito novas proteínas expressas diferencialmente, que poderia servir como alvos moleculares para o diagnóstico e /ou prognóstico de endometrióides tecidos EMCA. Algumas destas proteínas potenciais apresentam como alvos moleculares para terapêutica.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

tecidos endometriais foram recuperados a partir de um in-house, pesquisa dedicada endometrial do tecido banco como descrito anteriormente [18]. A recolha e utilização destes materiais foram aprovados pelos Conselhos de Ética em Pesquisa da Universidade York, Mount Sinai Hospital, University Health Network, e Hospital Geral de North York. As amostras provenientes de pacientes submetidos a histerectomias ou outros procedimentos clínicos envolvendo biópsias. Todas estas amostras foram obtidas após consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos neste estudo.

amostras e reagentes

Salvo disposição em contrário, todos os reagentes foram disponível a partir de Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). Para este estudo, os casos de carcinoma endometrióide (Tipo I EMCA, n = 10) e endométrio proliferativo normal (n = 10) foram seleccionados. Cinco das amostras de tecido do Tipo I a partir de biópsias foram EMCA que tinham sido examinados no nosso estudo anterior. Para a análise proteómica, amostras de tecido foram obtidas a partir do espelho de face do bloco residual usado para avaliação histopatológica pelo patologista. As amostras de tecido foram lavadas três vezes em ~ 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com uma mistura de inibidores de protease (mm 4- (2-aminoetil) benzenossulfonilo de fluoreto 1, 10 | iM de leupeptina, 1 ug /mL de aprotinina e 1 uM pepstatina) como descrito anteriormente [18]. A amostra lavada foi em seguida, homogeneizada em 0,5 mL de PBS com inibidores da protease usando um homogeneizador de mão, em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até à sua utilização [18] congelado-flash. Depois de retiradas do armazenamento a -80 ° C, as amostras foram descongeladas, clarificado por centrifugação, e a concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de Bradford (Bio-Rad, CA). Para todos os conjuntos iTRAQ, foi usada uma amostra de referência compreendendo um conjunto de amostras proliferativas normais dez (100 ug de lisado de cada tecido). Para cada experiência, com 100 ug de proteínas foram digeridas com tripsina e rotulados individualmente com a tag iTRAQ apropriado. As atribuições das marcas para os tipos de amostras foram randomizados para minimizar qualquer potencial viés na eficiência de marcação entre as versões individuais das tags iTRAQ. Um total de sete conjuntos iTRAQ foram examinados, cada um compreendendo de três do total de 20 amostras individuais – dez EMCA e dez endométrio normais e – o conjunto de referência. Os anticorpos monoclonais de ratinho contra calumenin e HNRNPA1 estavam disponíveis a partir de Abcam, catepsina B a partir de Calbiochem, e S100A6 de Santa Cruz Biotech. Policlonal de coelho lactato desidrogenase A (LDHA) também foi obtido a partir de Santa Cruz Biotech.

Strong Cation Exchange (SCX) Separação

Cada conjunto iTRAQ foi separado por SCX utilizando um instrumento HP1050 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA) com um 2,1 mm de diâmetro interno x 100 mm de comprimento PolyLC Polysulfoethyl se uma coluna empacotada com esferas de 5-um, com 300 um poros (O Grupo ninho, Southborough, MA) tal como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, o conjunto iTRAQ foi diluída com o tampão de carga (de composição idêntica, com Tampão A: KH 15 mM

2 PO?

4 em 25% de acetonitrilo, pH 3,0) até um volume total de 1,8 ml, e o pH ajustado a 3,0 com ácido fosfórico. A solução foi então filtrada utilizando um filtro de seringa de 0,45 um (Millipore, Cambridge, ON, Canadá) antes do carregamento sobre a coluna. A separação foi efectuada utilizando um gradiente linear de binário durante 1 h, mais 30 minutos de coluna re-equilibração (Tabela 4). Como descrito anteriormente, o Tampão A era idêntico em composição para o tampão de carga; Tampão B foi Tampão A contendo cloreto de potássio 350 mM; e Tampão C era tampão A contendo 1 M de cloreto de potássio. As fracções foram recolhidas a cada 2 min usando uma SF-2120 Colector de fracções Super (Advantec MFS, Dublin, CA) após uma espera inicial de 2 min para acomodar o volume vazio. Isto resultou em um total de 30 fracções SCX por conjunto iTRAQ. Estas fracções foram secas utilizando Speed-Vac (Savant Thermo SC110 A, Holbrook, NY) e re-dissolvido num volume mínimo de 5% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%: tipicamente 8 uL de cada fracção n ° 6-9, 12 uL para No. 10-13, 16 mL para No. 14-16, 20 mL de No. 17-19, 25 mL de No. 20-21, e 30 mL para os últimos frações, No. 22-30. Volumes maiores nas últimas fracções foram ditadas pela necessidade de dissolver completamente os peletes de sal maiores resultantes dos seus teores de sais correspondentemente mais elevadas. Fracções No. 1-5 não foram analisadas como fracções iniciais principalmente contido iTRAQ subprodutos.

Reverse-Phase (RP) LC-MS /MS

As frações SCX No. 6-30 de cada conjunto iTRAQ foram analisados ​​on-line por nano LC-MS /MS usando o instrumento LC Packings final (Amsterdão, Países Baixos), equipado com um circuito de amostra de 10 ul. O amostrador automático foi usado no modo de pick-up microlitro. Para cada amostra, uma solução mL foi carregado numa fase reversa (RP) C18 prcoluna de 5 mm (LC Packings) a 25 mL /min e lavou-se durante 4 min antes de mudar o pré-coluna em linha com a coluna de separação. A coluna de separação utilizada foi uma coluna capilar de diâmetro x 150 mm de comprimento 75 mícrons-interno (Integrafrit capilar de Nova Objetivo, Woburn, MA) embalado in-house com contas C18 3,5 mícrons com 100-A poros de Kromasil (Akzo Nobel /EKA Chemicals Inc, NY). A taxa de fluxo utilizada para a separação na coluna de RP foi de 200 nL /min. O solvente A foi 5% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%; O solvente B foi 95% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. O gradiente de solvente é detalhado na Tabela 5. Uma nova coluna foi usada para cada conjunto iTRAQ.

Online MS /MS foi realizada em um /(QqTOF) em tandem Qstar Pulsar quadrupolo híbrido time-of-flight