Sumário

Regulação epigenética de genes envolve a coordenação de metilação de DNA e histonas modificações para manter o status de transcrição. Estas duas características são frequentemente interrompidas em malignidade tal que genes críticos sucumbir à inativação. 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) é um agente que inibe a ADN metiltransferase, e tem um grande potencial como um tratamento para o cancro, mas a extensão da sua eficácia varia muito entre os tipos de tumores. Evidências anteriores sugerem status de expressão após a exposição 5-aza-CC não pode ser explicada pelo status de metilação do DNA sozinho.

Objectivo

Procuramos identificar alterações na cromatina envolvidos com a reativação do gene curto e longo prazo na sequência -5-aza dC exposição. Duas linhas celulares de cancro colorrectal, SW480 e HCT116, foram tratadas com 5-aza-dC e, em seguida, cultivadas em meio isento de droga para permitir a re-metilação de DNA. metilação do DNA e da cromatina modificações foram avaliadas com o seqüenciamento bissulfito e análise da cromatina imunoprecipitação.

Resultados

Aumento da acetilação H3, H3K4 tri-metilação e perda de H3K27 tri-metilação foram associados a reativação. genes hypermethylated que não apresentaram aumento da acetilação foram transitoriamente expressa com o tratamento-dC 5-aza antes de reverter para um estado inativo. Três genes reactivadas, CDO1, HSPC105 e MAGEA3, foram ainda expressa 10 dias após 5-aza-dC tratamento e exibida hipometilação localizada no local de início da transcrição, e também um aumento do enriquecimento de acetilação da histona H3.

Conclusões

estas observações sugerem que a hipometilação si só é insuficiente para reactivar genes silenciados e que o aumento da acetilação de histona H3 em uníssono com hipometilação localizada permite a reversão a longo prazo destes genes silenciados epigeneticamente. Este estudo sugere que os inibidores da metiltransferase de ADN e histona deacetilase combinada pode ajudar a reativação de longo prazo de genes silenciados

Citation:. Mossman D, Scott RJ (2011) Long Term transcricional Reativação de genes epigenetically silenciado nas células do câncer colorretal Requer DNA A hipometilação e acetilação das histonas. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10.1371 /journal.pone.0023127

Autor: Michael Freitag, Universidade do Estado de Oregon, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de dezembro de 2010; Aceito: 12 de julho de 2011; Publicação: 04 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Mossman, Scott. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por fundos da NBN Telethon, da Universidade de Newcastle e do Instituto de Investigação médica Hunter. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O genoma humano contém cerca de 3 bilhões de pares de bases de DNA [1] que exigem embalagens estratégica em uma estrutura compacta, mas dinâmica. A condensação é alcançado com o super-enrolamento do ADN ~147 pb em torno de um octâmero de proteínas histona (duas cópias de cada H2A, H2B, H3 e H4), para formar um nucleossoma [2], que impede a expressão do gene acidental e aumenta a dependência dos activadores de transcrição [ ,,,0],3]. repressão transcricional pode ser mediada por metilação do DNA e é assistida por extensas modificações em resíduos de lisina altamente conservadas nas caudas de proteínas histona. acetilação da lisina facilita a transcrição por enfraquecer a associação da histona e ligação ao DNA fator de transcrição [4] e permite [5]. Lisina metilação é mais complexo e pode ser associada com ambas as regiões activas e reprimidos de ADN, e podem estar presentes em mono-, bi-, e formas tri-metilado [6]. Por exemplo, trimethylation de histona H3 lisina 4 (H3K4me3) é uma marca ativa [7] enquanto a metilação de H3K9 e H3K27 aparece em promotores de genes transcricionalmente silenciosos [7], [8].

silenciamento epigenético aberrante de genes pode iniciar malignidade e frequentemente aparece para além de alterações genéticas, que contribui para a progressão da doença em vários tipos de cancro [9], [10], [11]. Além disso, a hipometilação aberrante de proto-oncogenes podem levar a sua activação [12], [13] redução da expressão de numerosos genes, devido ao silenciamento epigenético correlaciona com prognóstico pobre em muitas formas de malignidade, como pulmonar [14], o melanoma [15] , mama [16], gástrica [17] e do cólon [18]. Raros casos de metilação mono-alélicas de grande soma de MLH1 foram mostrados a surgir através de transmissão por linha germinal [19]. Além disso, hereditárias variações no número de cópias pode resultar em transcricional ler e in-

cis

metilação quando adjacente a genes fundamentais [20]. Estes mecanismos oferecem uma explicação de por que algumas famílias estão em maior risco de desenvolvimento da doença, apesar de não realizar uma mutação genética subjacente de genes cruciais. Indivíduos dentro dessas famílias poderiam se beneficiar de detecção precoce de marcas epigenéticas aberrantes de genes que conferem um risco elevado de uma determinada doença. Com uma crescente consciência de anormalidades na doença epigenética, contrariando estas alterações com os inibidores da metiltransferase, tais como 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) pareceria ser um tratamento potencialmente eficaz. Na realidade, este tratamento não é eficaz para um grupo específico de tipos de tumores [21], que pode ser devido a genes reactivadas revertam para um estado silenciados após a cessação do tratamento.

identificaram previamente a reactivação de numerosos genes em linhas celulares de cancro colorrectal, após o tratamento com o agente de desmetilação 5-aza-dC [22]. Após remoção da droga e dez dias de crescimento, alguns destes genes permaneceram altamente expressos, o que sugere a inversão do estado transcricional destes genes. Embora reduzido em 5-aza-dC, as alterações na metilação do ADN não se correlacionam com os níveis de expressão no grupo de genes analisados, indicando outras modificações foram epigenética controlar a transcrição. Os genes seleccionados para análise foram examinados devido ao seu envolvimento numa gama de tipos de tumores e possível utilização como biomarcadores nestes tumores [23], [24], [25], e /ou devido ao seu re-expressão forte e padrão de a expressão do gene seguinte 5-aza-dC em células de cancro colorrectal [22]. CDKN2A foi escolhida especificamente como é frequentemente reprimida em tumores de câncer colorretal [26]. Esses genes podem representar genes importantes no desenvolvimento epigenética de um número de tipos de tumor. Neste estudo, têm caracterizado as mudanças de metilação do DNA e da cromatina estado que permitem tanto uma reativação longo ou curto prazo de expressão após a exposição 5-aza-DC.

Métodos

Cultura Celular

culturas em triplicado de células HCT116 e SW480 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) a 37 ° C e 5% de CO

2. As células foram tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina (Sigma-Aldrich) como anteriormente descrito [22]. DNA e RNA foram extraídos a partir de células não tratadas, 5-aza-dC células tratadas (72 h de tratamento), e em 4 e 10 dias após a cessação do tratamento (Dia 4 e 10 de re-metilação). As células foram originalmente obtidas a partir da ATCC e foram autenticado utilizando o kit de ADN Identifiler identificação (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

metilação global

metilação global foi de avaliada como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, 50 ug de DNA foi digerido enzimaticamente com nuclease P1 (US Biológica, Swampscott, MA, EUA), seguida de separação cromatográfica sobre uma estação de trabalho Varian Estrela A cromatografia com uma coluna Supelcosil LC-18-DB (Sigma-Aldrich). A absorvância foi monitorizada a 278 nm e as áreas dos picos foram quantificados com estrela Viajante Software (Varian, Palo Alto, CA, EUA). O conteúdo 5-metilcitosina foi expresso como uma percentagem do pool total citosina após correcção para extinção co-efficients.

Bissulfito Sequencing

DNA foi convertido em duplicidade, usando um kit de conversão Qiagen Epitect Bissulfito ( Qiagen, Valencia, CA, EUA), utilizando 2 ug de fenol-clorofórmio ADN purificado. As amostras foram eluídas em 30 ul de tampão de eluição e uma aliquota foi diluída 1:03 antes da PCR e armazenado a 4 ° C, enquanto que a fracção restante foi armazenado a -20 ° C. ilhas CpG que rodeiam o local de início da transcrição de genes alvo foram em análise de PCR utilizando os iniciadores listados na Tabela S1. As reacções de sequenciação foram realizadas em duplicado e foram analisadas num sequenciador ABI 3730. A análise dos dados foi realizada usando o software do scanner Sequência (Applied Biosystems). A percentagem de metilação de CpG em cada foi determinada dividindo-se o pico de citosina por as alturas combinadas dos picos de citosina e timina como descrito anteriormente [27].

ARN Tempo real Análise de PCR da expressão do gene

foi convertido em cDNA usando Superscript II (Invitrogen) e iniciadores aleatórios (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As reacções foram realizadas em triplicado utilizando os iniciadores listados na Tabela S1, 2 × SYBR Green (Applied Biosystems) em um Prism 7500 máquina de PCR ABI (Applied Biosystems). C

valores de T foram realizadas automaticamente por Sequence Detection Software versão 1.4 e cálculos finais foram expressos como diferenças vezes em comparação com B-actina utilizando a ΔΔC

método T. Genes com expressão sem ser detectado foi atribuído um

valor T C de 40. As barras de erro nas figuras de expressão representam o erro padrão.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) e Análise

Resumidamente, a reticulação de ADN com a proteína e lise celular foi realizada utilizando o EZ-Magna ChIP Um Kit (Upstate /Millipore) segundo as instruções do fabricante. A sonicação foi realizada utilizando 8 × ciclos de 30 segundos no ciclo de trabalho de 60% num banho de gelo e as amostras foram adicionalmente arrefecida para 30 segundos entre os ciclos de sonicação. Cromatina imunoprecipitação foi realizada como previamente descrito [28] com ligeiras modificações. Os anticorpos foram obtidos a partir de Upstate (números de catálogo; a-H3Ac 06-599, 07-473 α-H3K4me3, α-H3K9me3 17-625, α-H3K27me3 17-622) com a excepção de o anticorpo de coelho não específica de IgG a partir de Santa Cruz Biotechnology (número de catálogo SC2027). quantidades de anticorpos foram determinados por reacção em experiências preliminares e foram de 5 mL para α acetil-H3, 5 uL de α-H3K4me3, 4 uL de α-H3K9me3, 4 uL de α-H3K27me3. 5 ul de IgG de coelho foi adicionado às amostras de controlo negativo. ligações cruzadas foram invertidas com a adição de 20 ul de proteinase K (Promega) e incubado a 62 ° C durante 3 h com agitação. Recuperado DNA foi então purificado usando um kit de limpar PCR (Qiagen, Valencia, CA, EUA).

em tempo real A análise de PCR de cromatina imunoprecipitada

ADN foi quantificado utilizando o Sistema A quantificação de ADN (Promega ) de acordo com as instruções do fabricante, e as medições foram feitas usando um luminómetro TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA, EUA). As reacções de PCR em tempo real foram realizados utilizando 200 ρg de molde de ADN com SYBR Green 2 × mastermix (Applied Biosystems) e os iniciadores listados na Tabela S1. As reacções foram realizadas em triplicado e levada a cabo utilizando uma máquina de PCR ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems).

valores de C T foram realizadas automaticamente por Sequence Detection Software versão 1.4 (Applied Biosystems) e os valores finais foram expressas como um percentual da fração de entrada. As barras de erro em números de mudança de cromatina representam o erro padrão.

Análise Estatística

Os desvios padrão foram calculados e uma T-test foi utilizado para comparar os níveis de expressão e níveis de modificação das histonas em células tratadas com droga contra não tratada células.

P

-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Genomic DNA metilação com 5-aza-dC tratamento

metilação global níveis diminuiu seguinte 5-aza-dC tratamento em 53% e 59% em HCT116 e a linhas de células SW480, respectivamente (Figura 1). Isto representa uma diminuição significativa em comparação com as células que foram falsamente tratados que não sofreu desmetilação (valor-p = 0,003 HCT116, SW480 valor-p = 0,017). a incubação das células continuou durante mais dez dias após o tratamento em meio livre de drogas permitidos ADN re-metilação e níveis genómicas aumentada, mas não voltar para o mesmo nível que o observado antes do tratamento durante este período.

metilação genómico níveis diminuiu significativamente em ambas as linhas celulares após a exposição 5-aza-dC. níveis de metilação genômicas foram gradualmente restaurada ao longo dos próximos dez dias de crescimento livre de drogas onde eles estavam se aproximando níveis de tratamento pré-droga.

Gene metilação específico e re-expressão com 5-aza-dC tratamento

Usando genoma matrizes de expressão mais amplo já anteriormente identificados padrões de expressão genética após o tratamento-dC 5-aza [22]. Os mesmos genes foram novamente examinados neste estudo para permitir a caracterização de modificações de histonas. Nesta experiência, a expressão foi determinada por PCR quantitativa e os genes foram, então, classificados em cinco categorias; “Sempre expressa ‘(expressão detectada em todos os pontos de tempo),’ regulado para cima” (duas vezes na expressão depois de 5-aza-dC tratamento), “longo prazo reactivada” (não detectadas em células não tratadas, mas expresso após tratamento bem como quatro e dez dias após a exposição ao fármaco (com base em um C

valor T de 40 para transcrições indetectáveis)), ‘curto prazo reactivada’ (o mesmo que ‘a longo prazo reactivada’ com a excepção dos dias quatro e /ou dez expressão que foi necessário para ser 100 vezes acima do nível de células não tratadas), ou “outro” (qualquer outro padrão de expressão gênica)

os três genes que foram reativadas por um curto período somente (. CXCL6 e ZFP3 em células HCT116 e CDKN2A em células SW480) foram todos hipermetilado em toda a região ensaiada de suas ilhas CpG. O padrão de expressão destes genes foi marcadamente diferente na outra das duas linhas celulares; aqui, estes genes mostrou muito pouca ou baixa metilação no sítio do início da transcrição (TSS) e foram expressos quer continuamente ou tornou-se sobre-regulada (figura 2). Os genes que permaneceram altamente expressos após reactivação (CDO1, HSPC105, MAGEA3) exibido perfis de metilação único e caracterizado um sítio CpG hypomethylated adjacente ao local de início da transcrição (TSS) como mostrado na figura 3. A desmetilação específica ilha CpG após o tratamento era 10- 15%, no máximo, por conseguinte ,, apenas padrões de metilação não tratados são mostrados na Figura 2 e 3. os dados para os quatro pontos de tempo é mostrado na Figura S1 para o gene MAGEA3 que exibiu a maior diminuição associada gene em metilação do DNA. Um exemplo dos cromatogramas sequenciação directa de MAGEA3 são mostrados na Figura S2

– CXCL6 ilha CpG metilação.; curto prazo sempre v-expresso. (B) – células SW480 e exibida hipometilação CXCL6 foi expressa em todos os pontos de tempo. (C) – hipermetilação uniforme da linha de células HCT116 foi associada a uma reactivação a curto prazo de expressão. D, E, F – CDKN2A CpG Ilha metilação; curto prazo v expressão constante. células SW480 exibir CDKN2A hipermetilação e foram temporariamente re-expressa, enquanto que em células HCT116 CDKN2A é ~ 50% em locais CpG metilados perto do TSS, e foi expressa em todos os pontos de tempo. Os asteriscos denotam alterações significativas em comparação com células não tratadas. G, H, I – ZFP3 CpG Ilha de metilação; curto prazo v expressão regulada para cima. células SW480 apresentaram hipometilação em locais de CpG próximo do TSS e expressão foi regulado para cima depois de tratamento com 5-aza-dC. ZFP3 permanece hipermetilado em células HCT116 e foi temporariamente reactivada com o tratamento com 5-aza-dC. J – Mudanças significativas modificações de histonas em comparação com células não tratadas (p 0,05).

A, B, C – CDO1 CpG Ilha metilação; longo prazo v curto prazo expresso. análise de sequenciação revelou CpG locais próximos ao TSS em células SW480 têm menor metilação e exibido expressão de longo prazo, em comparação com células HCT116 que são uniformemente hypermethylated em CDO1 e experientes um padrão de up-regulada de expressão. D, E, F – HSPC105 CpG Ilha metilação; sempre expressa-v a longo prazo expressa. A linha celular SW480 mostra localizada hipometilação no TSS e pode permanecer expressa dez dias após o tratamento. A linha de células HCT116 é hypomethylated no promotor HSPC105 e é continuamente expresso. G, H, I – MAGEA3 CpG Ilha de metilação; sempre expressa v longo prazo re-expressas. células SW480 mostram localizada hipometilação no TSS e são expressos dez dias após o tratamento. células HCT116 mostrar ~ 50% de metilação no TSS e MAGEA3 é expressa em todos os pontos de tempo. J – Mudanças significativas modificações de histonas em comparação com células não tratadas (p 0,05).

Genes determinados a ser “sempre expressa ‘exibido um máximo de 50% de metilação no TSS que sugere mono-alélicas metilação, e up-regulada genes exibidos variados padrões de metilação. O gene MLH1 foi expressa em ambas as linhas de células e não foi detectada a metilação na ilha CpG do TSS relacionado (dados não apresentados). Por outro lado, uma variante de DICER1 não era expresso em qualquer linha celular em qualquer ponto de tempo, tal como determinado por análise de micro-arranjo e a ausência da sua expressão foi confirmada por PCR quantitativa. DICER1 não está associada com uma ilha de CpG, por conseguinte, a análise de sequenciação de bissulfito não foi realizada. CDKN2A foi expressa em HCT116 e mostrou metilação parcial no TSS. A região correspondente em células SW480 foi hipermetilado e expressão foi classificada como de curto prazo reativada após o tratamento.

incubação continuou de células em meios de comunicação livres de drogas permitido re-metilação do DNA, que retornou aos níveis originais pelo promotor ilhas CpG . A expressão de genes não foi necessariamente afectada pela troca da metilação do promotor no entanto, e de expressão da CDO1, HSPC105 e MAGEA3 genes em células SW480 permaneceu elevada dez dias após o tratamento com 5-aza-dC. Estes genes exibido únicas CpG padrões de metilação ilha que apresentam locais CpG hypomethylated adjacentes ao TSS. Como os níveis de metilação no promotor ilhas CpG não refletem com precisão a expressão dos genes estudados, procurou-se analisar os padrões de modificações de histonas nas respectivas ilhas CpG que podem ser responsáveis ​​por elevados níveis de expressão.

modificações da cromatina após 5-aza-dC exposição

Cromatina imunoprecipitação e Q-PCR revelou que Histona H3Ac e H3K4me3 eram características associadas com genes expressos, tais como GAPDH e genes reprimidos MLH1 e foram associadas com H3K9me3 e menos frequentemente H3K27me3 que estavam ausentes genes constitutivamente expressas .. resultados de chips estão resumidos na Figura 2 e 3, com valores de p listadas na Tabela 1. As alterações específicas na modificação da cromatina são mostrados nas figuras S3, S4, S5, S6.

as alterações nas proteínas de cromatina seguintes 72 h de exposição eram dependente do estado a expressão do gene. Genes com maior expressão após o tratamento aumentou em H3K4me3, enquanto H3Ac só foi associada a genes reativados por períodos mais longos. Geralmente as marcas H3K27me3 repressivas foram reduzidos após o tratamento, com a excepção do gene CXCL6. Uma comparação das histonas modificações nos genes reactivadas curto prazo revelou aumento transitório da histona H3K4me3 e diminuiu ou nível estável de trimetil-histona H3 lisina 9 e 27. Apesar disso, a transcrição destes genes dez dias após o tratamento foi de uma semelhantes às células não tratadas. A única diferença mais evidente entre os genes reativados curto e longo prazo foi a modificação H3Ac. Genes consideradas ‘de longo prazo reativada’ revelou um aumento de H3Ac, embora nem sempre alcançar significância estatística, após o tratamento, que persistiu até dez dias após o tratamento de drogas. Houve também uma tendência nos genes a longo prazo expressa-re, onde uma redução na H3K27me3 observou-se a genes regulados positivamente (CDO1 em células HCT116 e ZFP3 em SW480) e genes que foram sempre expressas mostrou um ganho de marcas de cromatina ativos e uma perda de modificações de histonas repressivas após 5-aza-dC exposição.

Discussão

O controle epigenética da expressão do gene é mediada por metilação do DNA e modificações de histonas. Ao alterar a metilação do DNA e up-regulação da expressão gênica podemos identificar padrões de mudança em modificações de proteínas histona que acompanham a reativação de longo e curto prazo dos genes epigenetically silenciados. De particular relevância para este estudo foi a aparente transcricional-regulação de genes silenciados que apresentaram menos de 15% desmetilação do DNA, onde as modificações das histonas são susceptíveis de estar envolvido na regulação da expressão genética nestes casos.

O efeito da metilação do DNA na expressão génica

Independentemente do padrão de expressão durante o tratamento da droga, a extensão da metilação de determinadas ilhas CpG permaneceu relativamente inalterada em comparação com os níveis genómicas após a exposição ao 5-aza-dC. Esta observação foi feita anteriormente, com a metilação de sequências repetitivas susceptíveis de contribuir para esta discrepância [22], [29]. Outro estudo demonstrou que a metilação do ADN aumenta a promotores de genes que não são expressos quando inibida pela doxiciclina em um sistema promotor Tet-responsivo [30]. genes expressos constitutivamente foram hypomethylated em ambos os alelos, ou exibiram ilha CpG metilação de 50%, indicando que a metilação de mono-alélico, tal como o gene CDKN2A em células HCT116 como mostrado anteriormente [31]. desmetilação ligeira de promotor ilhas CpG foi induzida com 5-aza-dC, ainda não foi necessariamente expressão restrita em alguns genes quando a metilação retornou aos níveis iniciais. Alta expressão de genes reativados a longo prazo parecia ser dependente de hipometilação pré-existente na TSS independentemente de os locais CpG adjacentes foram hipermetilado. Este resultado indica o padrão de metilação em vez do nível geral de metilação em toda a ilha CpG é crucial para re-ativar genes silenciados via interações com outros fatores epigenéticos. Hypomethylated locais de CpG dentro de promotores hipermetilado foram identificados anteriormente no gene do receptor de oncostatina M [27], mas o efeito desta hipometilação de transcrição não foi examinado. Por expressão de genes a longo prazo reactivadas não ocorreu nas células não tratadas que apresentavam um padrão de metilação idêntico próximo pode ser explicada pelas alterações nas modificações nas proteínas histona.

O efeito de modificações de histonas na expressão do gene

Um instantâneo de fatores que regulam a expressão do gene foi obtida com a compilação de CpG sequenciamento ilha e resultados imuno-precipitação de cromatina. Após a reativação de vários genes e classificação de expressão, podemos distinguir entre os genes com base nos metilação e cromatina apresentou alterações. Antes do tratamento, os genes transcricionalmente inactivos foram caracterizados por níveis mais elevados de modificações repressivas e níveis mais baixos de marcas de activação. Após o tratamento com 5-aza-dC, houve geralmente um aumento dos níveis de H3K4me3 e H3K9me3, enquanto H3Ac aumentou apenas em alguns dos genes. Reduções para H3K27me3 ocorreu em genes que inicialmente exibido esta característica. Com relação às modificações da cromatina, foi durante o período de crescimento livre de drogas que acetilação das histonas se tornou a característica mais distinguível entre genes reativados curto e longo prazo. Longo prazo promotores de genes reativados tornou-se cada vez mais associada a acetilação da histona H3 ajudando com ativação de genes no entanto só chegou a níveis significativos depois de dez dias de crescimento livre de drogas. Temporariamente genes reativados não atraiu essa modificação, apesar de um breve período de expressão. Parece, portanto, que a introdução de H3 acetilação é um fator crucial na reversão estatuto da transcrição de um gene epigenetically silenciada que é assistida por hipometilação do DNA localizada. Com a exceção de H3K27me3 em CDKN2A em células SW480, mudanças duradouras para modificações epigenéticas não foram observados nos genes temporariamente reativados.

O aumento da regulação de genes expressos humilde foi associado com o aumento da acetilação H3 e H3K4me3, como o gene ZFP3 em células SW480. perfis de metilação como isso pode indicar um intermediário entre os genes sempre expressas como a longo prazo genes reativados. Co-existente marcas activas e repressivas podem permitir um nível restrito de transcrição, sugerindo o controle da expressão desses genes é dependente do equilíbrio de ambos os tipos de modificações.

Nos genes analisados ​​neste estudo, os papéis de histona H3 acetilação e H3K27me3 eram aparentes como activação e reprimindo marcas respectivamente, no entanto, o efeito de H3K4me3 H3K9me3 e não parecem ser suficientes para alterar a expressão de genes numa base de longo prazo. Seguindo 5 aza-dC exposição, H3K9me3 foi frequentemente aumentada a genes expressos que está de acordo com descobertas recentes que também podem ser acoplados com a ativação do gene [29], [32], [33]. Da mesma forma, H3K4me3 que associa com regiões activas do genoma foi encontrado em genes inactivos, embora a um nível reduzido. Observações dessa natureza destacar a natureza dinâmica da cromatina e, possivelmente, sugerem uma forma intermediária de repressão similar à cromatina bivalente torno genes de desenvolvimento [34] ou o efeito de cromatina vizinho que tem sido detectados por causa de variações na corte eficiência durante sonicação.

Ligando a metilação do DNA, modificações da cromatina e a expressão do gene

os padrões de expressão de re-activada e sobre-regulada de genes pode ser explicado em grande parte, com a combinação de análise de metilação do promotor e os ensaios de imuno-precipitação de cromatina. Pela observação e comparação dos genes longo e curto prazo reativada, nossos resultados mostram que os genes com uma hipometilação localizada na TSS são mais propensos a experimentar um aumento da acetilação das histonas H3 e permanecem manifestado após 5 aza-dC exposição. Além disso, observamos que a expressão do gene específico foi reativada sem grande mudança na associado ilha metilação CpG e isso foi independente da hipermetilação nas proximidades dentro da mesma ilha CpG.

A sequência de eventos envolvidos com a reativação epigenética foi proposto por Litt

et al.

[35]. Os autores afirmam que a reactivação do hemi-desmetilação do gene HPRT necessária do promotor, “abertura” da estrutura da cromatina, de ligação do factor de transcrição e montagem do complexo de transcrição antes da síntese do ARN HPRT. Com base nas nossas experiências, podemos alargar com base neste conhecimento, sugerindo que menor desmetilação induzida por 5-aza-dC e aumentou H3K4me3 permite a iniciação da transcrição. O papel de trimethylation H3K9 não é clara, mas pode estar associado a reactivação em alguns casos. Uma perda de marcas, tais como repressores H3K27me3 também pode aumentar ainda mais a transcrição. Apesar de não ser aqui examinados, é possível MBD2 de ligação poderia ser perdido neste ponto que já não deter histona acetiltransferase da região [36]. A transcrição é prolongada se o aumento da acetilação de histona H3 ocorre, caso contrário, a expressão é transitória e expressão do gene é provavelmente para reverter para um estado inactivo.

Metiltransferase inibidores no tratamento de tumores

Estudos anteriores demonstraram a genes utilizados no presente estudo sucumbem à metilação em outras doenças malignas, tais como certas formas de cancro da mama [24] e do cancro do ovário [37]. Portanto, a reactivação descrito neste estudo não pode ser limitado a cancro colorectal, mas também outros tipos de tumores em que a reversão da repressão epigenética pode ser de benefício terapêutico. A eficácia de 5-aza-dC como um tratamento é limitado a determinados tipos de tumores, no entanto, o que faz com que um resultado favorável de 5-aza-dC tratamento é desconhecido. Seu sucesso pode estar com o padrão de metilação em genes alvo atualmente não-identificados e a capacidade drogas para reativar genes silenciados durante um longo período de tempo. Portanto, nossos resultados sugerem que os genes reprimidos exibindo localizada hipometilação TSS pode ser reativado com o tratamento inibidor da deacetilase metiltransferase /histona combinado. O aumento da acetilação em locais de início da transcrição que hipermetilado levar a reactivação de longo prazo de genes anti-proliferativos podem ser benéficas no tratamento de tumores quando essa informação é conhecida. Este mecanismo seria, além de o efeito sinérgico relatado apoptótica de inibidores da metiltransferase e histona desacetilase [28], [38].

Conclusão

Análise da cromatina no promotor dos genes este estudo sugere que a hipometilação de 5-aza-dC tratamento existente a seguir (mas não necessariamente induzida por), SIDA histona H3 acetilação, quer directamente ou indirectamente. A combinação de hipometilação de locais CpG no resultado acetilação TSS e H3 na reactivação estável dos genes estudados aqui. Os resultados deste estudo destacar as características epigenética que precisa ser modificado no que diz respeito à inversão do estado de transcrição dos genes para o tratamento da doença. Uma abordagem mais estratégica vai conduzir ao desenvolvimento de terapias epigenética em vez do uso de drogas de modificação de epigenética como terapias citotóxicas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Metilação de MAGEA3 em células SW480 tratados com 5-aza-dC. sequenciação de bissulfito de PCR foi realizada em cada ponto de tempo e traçada para mostrar alterações antes e depois de 5-aza-dC tratamento, o gene MAGEA3 mostrou o maior desmetilação de todos os genes testados, com uma redução de 10-15% em vários locais CpG próximo o gene TSS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023127.s001

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Figura S2.

metilação no MAGEA3 Transcrição Iniciar Site. A – Promotor de metilação em toda a ilha MAGEA3 CpG. A barra vermelha indica a região da sequência mostrada na B e C. B – A metilação no MAGEA3 TSS em células SW480. A sequenciação directa de produtos de PCR bissulfito provoca picos T dupla C e em locais de CpG, e são representativos de alelos metilados e não metilados, respectivamente. O site CpG adjacente ao TSS mostra uma maior proporção de alelos T (representando citosina não metilado) indicando hipometilação, enquanto sites CpG próximas mostrar aumento dos picos de citosina e níveis de metilação mais elevados. As setas indicam os locais de CpG, em caixas de T indicar a posição de CpG não-citosina e a sequência sublinhada representa o sítio de iniciação da transcrição. C – locais de CpG na linha celular HCT116 são superiores a 50% desnaturado

doi: 10.1371 /journal.pone.0023127.s002

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Figura S3..