Abstract

Fundo

As únicas opções terapêuticas existentes para o carcinoma do pulmão de células escamosas (SCC) são a radiação padrão e quimioterapia citotóxica. células-tronco cancerosas (CSCs) são hipótese para explicar a resistência terapêutica, sugerindo que CSCs devem ser especificamente orientadas. Aqui, analisamos o transcriptoma da CSC e não-CSC subpopulações por RNA-seq para identificar novas estratégias terapêuticas potenciais para a SCC.

Métodos

Nós ordenados a SCC em CD133- e CD133 + subpopulações e então examinados tanto pela análise do número de cópia (CNA) e genoma inteiro e sequenciamento do transcriptoma. Analisamos o Cancer Genome Atlas (TCGA) dados de transcriptoma de 221 CCEs para determinar a generalidade das nossas observações.

Resultados

As duas subpopulações altamente expresso inúmeras isoformas de mRNA cujos produtos proteínas são alvos de drogas ativos para outros tipos de câncer; 31 (25%) correspondem a 18 genes sob investigação activa como alvos de mAb e um adicional de 4 (3%) são de interesse terapêutico. Além disso, encontramos evidências de que ambas as subpopulações foram proliferatively impulsionado por níveis muito elevados de c-Myc e o TRAIL isoforma longa (TRAIL

L), e que as respostas apoptóticos normais a alta expressão destes genes foi impedido por meio de altos níveis de Mcl- 1

L e Bcl-x

L e C-flip

L-isoformas para que as drogas estão agora em desenvolvimento clínico. dados SCC ARN-seq (n = 221) a partir de TCGA suportado nossas descobertas. Nossa análise é incompatível com o conceito de CSC que a maioria das células de um câncer perderam seu potencial proliferativo. Além disso, nosso estudo sugere como alvo subpopulações tanto o CSC e não-CSC com a estratégia de um tratamento.

Conclusões

O nosso estudo é relevante para SCC, em particular, pois apresenta várias opções potenciais para padrão terapia alvo que todo o tumor. Ao fazê-lo, ele demonstra como transcriptoma sequenciamento fornece insights sobre as bases moleculares das células cancerosas propagação que, mais importante, pode ser aproveitado para identificar novas opções terapêuticas potenciais para cancros além do que é possível com o sequenciamento de DNA

Citation.: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain B, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) transcriptoma Sequenciamento de subpopulações tumorais revela um espectro de opções terapêuticas para as células escamosas do câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10.1371 /journal.pone.0058714

editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de outubro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 20 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Barrett et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Prêmio Science Translational (UL1RR031980 e UL1TR000100) a partir do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, três bolsas (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) do Instituto Nacional do Câncer, quatro subsídios do California Institute for Regenerative Medicine (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) e um subsídio do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (P30 AI036214). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução o câncer

Lung para 28% de todas as mortes, o câncer de maior percentual de todos os cânceres [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por ~85-90% dos cancros do pulmão, dos quais adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular são os subtipos mais comuns [1]. Embora mais de 70% dos pacientes com NSCLC têm avançado doença que raramente é curável quando diagnosticado, novos avanços para subconjuntos de adenocarcinomas pulmonares que abrigam mutações EGFR ou fusões de genes EML4-ALK incentivar o desenvolvimento de terapias específicas, que podem alterar esta situação dire [2] . Estas alterações genéticas ocorrem principalmente em adenocarcinomas de pacientes que nunca fumaram, e são incomuns em SCC que é predominantemente associado ao tabagismo [3] – [5]. Enquanto FGFR1 [6] e DDR2 [7] surgiram recentemente como potenciais alvos terapêuticos para alguns pacientes SCC, inibidores ainda têm de chegar a ensaios clínicos. Recentes estudos de alto rendimento de sequenciamento NSCLC focado principalmente na análise do DNA têm demonstrado que alguns genes são mutantes em um suficientemente alta frequência para ser útil para terapia-alvo; No entanto, estes estudos fazer prever alterações de ADN que são frequentemente agrupados num número limitado de vias moleculares importantes sugerindo que o direccionamento destas vias pode ser uma estratégia terapêutica viável [8] – [12]. transcriptoma profunda (RNA-seq) de perfis de NSCLC para identificar genes com expressão desregulada que é comum entre os tumores ainda não foi avaliado, apesar de tais relatórios são de esperar, dadas as grandes conjuntos de dados de RNA-seq sendo gerados por TCGA [13] e outros consórcios.

As células cancerosas dentro de um tumor individual existem em estados fenotípicas distintas que muitas vezes apresentam diferenças funcionais importantes. Uma subpopulação de células com auto-renovação e capacidades de iniciação do tumor, comumente referidas como células-tronco-cancro como (CSCs), têm sido identificados numa variedade de tipos de tumor, incluindo NSCLC [14]. Evidências crescentes sugerem que CSCs são resistentes a terapias anti-câncer e metástase subjacentes [15], [16] e, portanto, são o tipo de célula câncer primário responsável pela recaída e progressão de tumores malignos. A implicação é que imediato por segmentação CSCs deve ser possível erradicar a subpopulação resistente e metastático da droga de um cancro [14]. No entanto, estudos recentes demonstraram que o fenótipo CSC é de plástico e pode ser reconstituída por outros não-CSC, células tumorais, [17], [18]; portanto, não apenas CSCs mas todas as subpopulações de tumor que são “potencial CSCs” deve ser alvo. Transcriptoma sequenciação do CSC e subpopulações não CSC em NSCLC iria fornecer insights sobre a base molecular subjacentes suas semelhanças e diferenças fenotípicas e facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos. Tal análise será um complemento importante e necessário para a maior parte profiling transcriptoma tumor a ser realizada por TCGA e outros.

As observações de que não CSCs pode reconstituir CSCs, e vice-versa, sugerem que as diferenças fenotípicas entre estas subpopulações são devido a epigenética, em vez de diferenças genéticas. Portanto, as experiências exome e sequenciação do genoma que visam identificar mutações somáticas não são esperados para revelar diferenças entre ordenada CSC e subpopulações não CSC. Por outro lado, perfilamento transcriptoma, que é uma leitura da epigenome (isto é, marcas de histonas e metilação de ADN que regulam a expressão), deve ser um excelente método para perfilar CSCs e não-CSCs para revelar diferenças mecanicistas. A vantagem dos dados de RNA-seq mais de microarrays é a capacidade de analisar as diferenças de expressão de isoformas [19]. Em células cancerosas, isoformas alternativa de ARNm pode produzir isoformas proteicas com actividade dominante negativa. O papel patogênico de isoformas específicas do cancro tem sido amplamente demonstrado em todos os aspectos da fisiologia celular, incluindo a adesão celular e metástase (CD44 e RON), o crescimento celular e tumorigênese (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, NUMB), ciclo celular (PYK ), a angiogénese (VEGF), a apoptose (GS3KB, CD95, Bcl-X, caspase-2, caspase-9), o metabolismo (PK), e resistência a drogas (AR e MRP-1) [20] – [24]. Estes exemplos ressaltam a vantagem de informações em nível de isoforma transcriptoma sobre a expressão do gene inteiro para ganhar insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes CSC e diferenças fenotípicas não CSC.

Aqui nós relatamos a aplicação de tecnologias genômicas a um xenotransplante SCC que foi classificados em subpopulações CSC e não-CSC com base no marcador CD133 (Figura 1). CD133 (PROM1; Prominin-1) é uma glicoproteína transmembranar-5, que é considerada como sendo um marcador para a subpopulação de CSCs em ambos os subtipos de NSCLC [15], [25] – [27]. Em NSCLC o CD133 + subpopulação foi mostrado para ter maior potencial tumorigénico em ratinhos SCID, para expressar níveis mais elevados de genes stemness e a ser mais resistentes à quimioterapia convencional do que o CD133- subpopulação [15]. É importante, de modo que o xenoenxerto de SCC seriam mais representativas do tumor primário, que foi directamente enxertada como picada tumor primário em ratinhos NSG e nunca foi cultivado

In vitro

. A análise do DNA de todo o genoma revelou que os cromossomos de subpopulações CD133 + e CD133- foram altamente perturbado de um modo muito semelhante; no entanto, como seria de esperar o tumor não abrigar mutações clinicamente acionáveis. Análise do ARNm de splicing perfis de expressão da isoforma do CD133 + e subpopulações CD133- resultou na identificação de SCC como uma potencial nova indicação para numerosos medicamentos actualmente em desenvolvimento e sugerem vários novos alvos promissores adicionais. Finalmente, a análise dos dados A Cancer Genome Atlas (TCGA) publicamente disponível transcriptoma de RNA-seq de 221 CCEs [28] apoia a generalidade das nossas descobertas transcriptoma para esta doença. Ao todo nosso estudo demonstra a capacidade do sequenciamento do transcriptoma de subpopulações de células de câncer classificados para informar o desenvolvimento clínico de formas que não são possíveis com sequenciação de ADN.

Nós classificadas as células tumorais humanas de um xenoenxerto de cancro do pulmão de células escamosas em CD133 + e subpopulações CD133-. Em seguida, realizada a análise CNA usando matrizes de genotipagem em células mononucleares de sangue periférico (PBMC), bem como ambas as subpopulações de células CD133 + e CD133-. Foram comparados os genomas da população CD133 + e amostra de PBMC para identificar mutações somáticas. Finalmente, foi realizada toda sequenciamento do transcriptoma (RNA-seq) das subpopulações CD133 + e CD133- para avaliar suas diferenças de expressão de mRNA das isoformas e semelhanças.

Métodos

xeno

Um Proteções de pesquisa Humanos Programa Institucional Review Board UCSD (IRB) aprovou este estudo antes de quaisquer actividades relacionadas com o estudo. Todos os procedimentos experimentais animais cumpriram com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute for Research Laboratory Animal, 1996) e foram aprovados pelo Comitê Global de Pesquisa e Desenvolvimento Institucional Animal Care e Use a Pfizer. Um homem de 75 anos de idade, com história de tabagismo de 30 maços-ano e um achado incidental nódulo pulmonar fornecida consentimento informado por escrito documentado de acordo com este IRB aprovou o protocolo antes da cirurgia. Ressecção revelou um carcinoma de células escamosas T1 moderadamente diferenciado. Uma parte do seu tumor fresco ressecado foi levado para xeno em NSG (nome exato estirpe NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ) ratos (The Jackson Laboratory). passagens subsequentes foram feitos em camundongos CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /Crl de Charles River. tumor fresco picada foi misturada com Matrigel (BD Biosciences) e inserida subcutaneamente. Os ratos foram observados até tumores palpáveis ​​cresceu e estes foram colhidas para a implantação de série e estudo. Em dois anos de acompanhamento do assunto permaneceu sem evidência clínica ou radiográfica de recaída.

Isolamento de RNA e DNA

Os lisados ​​da CD133- /EpCAM + e CD133 + /EpCAM + amostras escolhidas foram processados ​​para ARN e a extracção de ADN utilizando o Qiagen Mini Kit toda a preparação (Valencia, CA). As amostras foram processadas de acordo com as recomendações do fabricante. Não mais do que quatro volumes foram carregados em uma única coluna RNeasy Mini rotação. Amostras de RNA total foram avaliados quanto à pureza e concentração usando o Agilent 2100 Bioanalyzer na Genechip Microarray Core.

RNA sequenciamento

O RNA total, tanto do CD133- /EpCAM + e CD133 + /EpCAM + tumorais subpopulações ( ~230 ng de cada) foram usadas para gerar bibliotecas transcriptoma inteiros para sequenciação na plataforma sólido seguindo as recomendações do fabricante (Life Technologies, Carlsbad CA, EUA). As amostras de RNA foram fragmentadas por ARNase III e concentrou-se utilizando Módulo concentração RiboMinus (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). fragmentos de RNA foram ligados às misturas adaptador sólida e transcrição reversa realizada. Os ADNc foram purificados tamanho seleccionado (150-250 pb), utilizando o kit de purificação de PCR MinElute (Qiagen Inc., Valencia, CA, EUA), e, em seguida, amplificado 15 ciclos usando Solid 3 ‘e 5’ SÓLIDOS iniciadores. ADNc amplificado foi purificado utilizando PureLink Micro PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA), QC’ed pela Bioanalyzer 2100 1000 ADN kit (Agilent, Santa Clara, CA, EUA), e quantificadas usando o Qubit Fluorómetro 2.0 (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). As bibliotecas transcriptoma inteiras foram utilizados para fazer contas templated sólido seguindo o Guia SOLiD Templated Bead Preparação e sequenciado utilizando o protocolo de 50 × 25-end pareado, para cada amostra gerando mais de 500 M ler pares por amostra.

Computacional análise de dados de RNA-seq

sequenciamento do transcriptoma das subpopulações CD133 + e CD133- produziu 529 M e 531 M 50 × 25 pares de leitura, respectivamente. Nós primeira alinhado toda transcriptoma emparelhado-end lê para genes rRNA e tRNA usando a versão 0.6.4 f de bfast + BWA [29] e manteve apenas os pares em que nem leitura foi alinhados, resultando em conjuntos de dados que compreende 77 M e 79 M leia pares. Em seguida, alinhado cada conjunto de retidos ler pares com bfast + BWA a um banco de dados personalizado não redundante de isoformas de mRNA construídos com o programa “cuffcompare” a partir da versão 0.9.3 do conjunto de software Abotoaduras (79) e todos os modelos de isoformas da RefSeq [30], UCSC conhecidos genes [31] e [32] ENSEMBL bases de dados. Nós próxima convertido o alinhamento leitura coordena no mRNA das isoformas banco de dados para coordenadas genômicas hg19 usando um script personalizado. A partir destes alinhamentos calculamos as estatísticas de expressão e de expressão diferencial com os “abotoaduras” e programas “cuffdiff” de botões de punho, respectivamente. Ao usar ambos os programas que usamos normalização quartil superior e a sequência de referência do genoma humano hg19 para correção de viés. Calculamos que, 13,612 e 43,120 genes isoformas do gene teve algum diferente de zero nível de expressão em pelo menos uma das duas subpopulações. Figura S1 S1 Informação mostra um histograma destas valores expressão da isoforma pré-filtrado em ambas as subpopulações de células. A maioria destes casos foram devidas ao ruído de leitura mapeamento ou a expressão do gene “leaky” que é de importância fisiológica desconhecido [33], por isso, aplicado expressão mínima e ler os critérios de cobertura ( 1 FPKM e cobertura de 60%) para se obter um expressão da isoforma inicial estima nas duas subpopulações. Observou-se que 3.844 genes com 7.558 isoformas de mRNA alcançaram estes critérios mínimos. Para ser altamente confiantes em nossa expressão e de expressão diferencial de resultados, aplicamos filtragem rigorosa para as estimativas de expressão isoforma iniciais; Foram estabelecidos limites para as isoformas análise de ARNm que foram expressas a um nível de pelo menos 30 FPKM em uma das subpopulações e que foram cobertos em pelo menos 60% do seu comprimento por sequenciação lê. Além disso, para uma isoforma de ser chamado expresso diferencialmente, a sua expressão diferencial teve de ser chamado significativa a um FDR de 0,01 e ter mudado, pelo menos, quatro vezes entre as duas subpopulações. A aplicação destes critérios produziu 572 genes tinham pelo menos uma isoforma que foi significativamente expresso diferencialmente. Como resultado final, calculado 671 das isoformas 43,120 (1,6%), para ser significativamente expressos diferencialmente. Tabela S1 em Informação S1 mostra como esses números mudam para FPKM diferente e dobre critérios de mudança.

Resultados

O isolamento do CSC e não-CSC subpopulações

Nós isolados CSCs humanos ( CD133 + /EpCAM +) e não-CSCs (CD133- /EpCAM +) a partir de um xenoenxerto de cancro do pulmão de células escamosas usando células activadas por fluorescência (FACS) e, respectivamente recolhido um total de 9,19 x 10

4 (3,4%) e 2,18 × 10

6 (96,6%) as células vivas correspondentes às duas subpopulações (Figura 2). Para avaliar a qualidade do nosso tipo que mediram os níveis de isoformas CD133 (Figura S2 em Informação S1) de expressão em todo o dados de transcriptoma (descrita abaixo) e observou a expressão moderada de três isoformas na subpopulação CD133 + e nenhum nível detectável de expressão no CD133 – subpopulação. Foi realizada uma segunda FACS para o mesmo xenotransplante isolado de um animal diferente e obteve um número e proporção de CD133 + e as células CD133- (Figura S3 em Informação S1) similar. Nossos resultados mostram que somos capazes de classificar em subpopulações CD133 + e CD133- puros e que a CD133 + subpopulação constitui uma pequena fração das células cancerosas no tumor de pulmão de células escamosas, que é consistente com estudos publicados anteriormente [15], [26] .

(A) As células vivas exibidas populações distintas de qualquer rato CD45 /MHC I ou expressão EpCAM humana. (B) Isolamento de células humanas CD133 + (vermelho) a partir de células humanas CD133- (verde) e as células positivas de ratinho (azul). (C) Reanalysis de populações de células no painel B mostra que o C133 células + (vermelho) são 3,4% do EpCAM + população.

A paisagem mutacional de pulmão de células escamosas subpopulações tumorais

foi realizada Copiar Número Alteração (CNA) análise por microarray (ver resultados e os métodos de Informação S1) da linha germinal, CD133 + e DNA CD133- e descobriu que cerca de metade de todo o genoma, tanto no CD133- e CD133 + subpopulações estava envolvido em grande CNAs (Figura S4 em Informação S1). análise de sobreposição revelou a existência potencial de CNAs específico para cada subpopulação, mas após uma inspeção manual de todas as CNAs e tendo em conta a precisão de microarrays [34], não foi possível identificar com confiança diferenças. Assim, concluiu que os cromossomas do CD133 + e CD133- subpopulações foram altamente alterado de uma forma amplamente indistinguíveis. Além disso, foram analisados ​​dados de sequência de genoma inteiros da subpopulação CD133 + e DNA germinal correspondentes e concluiu que o tumor estudado não contém quaisquer mutações clinicamente acionáveis ​​(Tabelas S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 na informação S2 e S8, Figura Informação S1).

Avaliação de isoformas de ARNm de genes que codificam para proteínas da superfície celular

expressão desregulada de isoformas de ARNm pode resultar na geração de Câncer proteínas de superfície celular associados que são potenciais alvos antigénicos de anticorpos monoclonais terapêuticos. Para identificar esses alvos, medimos a expressão de 1.191 isoformas de mRNA de 426 CD Molecule [35], 354 GPCR [36], e 212 ion canal [36] genes (992 genes totais). Nós limitamos nossa análise a isoformas que foram pelo menos moderadamente expressa (30 FPKM) e coberta pelo menos 60% do seu comprimento por sequenciação lê em uma ou ambas as subpopulações os CD133 + e CD133-, produzindo um conjunto de avaliação de 124 isoformas representando 80 genes (10,4% das isoformas de 1,191 e 8,0% dos 992 genes) (Figura 3; Figuras S5A, S5B em Informação S1). Dos 124 isoformas altamente expressos, 43 (em 25 genes) têm diferenças de expressão, pelo menos, quatro vezes (FDR 0,01), com 24 que apresentavam menor e 19 mostrando expressão aumentada em CD133 + células em relação ao CD133- células (Figura 3). Curiosamente, 31 (25%) dos 124 isoformas altamente expressos correspondem a 18 genes actualmente sob investigação activa como alvos de drogas para numerosos cancros (especificamente ABCG2 [37], ADAM10 [38], ALCAM [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] – [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], EPCAM [54], ERBB2 [55], ICAM1 [56], do IGF1R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. É de notar, a isoforma ABCG2 (16X mais elevada expressão na subpopulação CD133 +) e a isoforma CXCR4 (4X maior expressão na subpopulação CD133 +) foram previamente identificados como biomarcadores de tumor do cancro do pulmão de células poupadas por tratamento com cisplatina iniciar [15]. para além destes 18 genes sob investigação activa como droga como alvos dois outros genes altamente expressos -CD97 [61], e IFITM1 [62] -ter sido propostos, mas não prosseguiu activamente como alvos de anticorpos terapêuticos para tumores primários ou metastáticos. acreditamos que outros genes de superfície celular altamente expressos mostrados na Figura 3 podem também ser alvos potenciais drogas. Por exemplo, uma isoforma da DDR1, um homólogo de DDR2 que é um alvo promissor para o CEC [7], é altamente expresso em células CD133 +. ICAM4, que tem demonstrado um papel na carcinogénese e situa-se no locus 19p13.2 susceptibilidade para vários tipos de cancro [63], [64], é também altamente expresso. Como estes genes de superfície 22 de células de terapêutica codificam interesse para as proteínas envolvidas em interacções célula-célula, a adesão celular, migração, e quimiorresistência, as suas semelhanças de expressão e as diferenças aqui identificados ilustra como as análises ao nível da isoforma pode fornecer um novo nível de informação tanto para a compreensão a fisiologia do e para o direcionamento, subpopulações tumorais específicas.

indicadas são os níveis de 1.191 isoformas de 426 CD molécula, 354 GPCR e 212 ion genes de canais de expressão. círculos cinzentos correspondem a isoformas que não cumprem nossos critérios de nível de expressão mínima e círculos azuis para isoformas que fizeram, mas não eram significativamente expressa diferencialmente. triângulos coloridos indicam isoformas significativamente diferencialmente expressos; triângulos para baixo apontando verdes indicam diminuição da expressão e triângulos up-apontando vermelho indicam um aumento da expressão nas células CD133 +. As linhas cinzentas diagonais são clines mudança vezes. Isoformas discutidas no texto são nomeados. Note-se que CD133 /PROM1 não atender o nosso critério expressão, subjacente ao rigor da nossa filtragem de dados; mas é mostrado para comparação. símbolos Aqui usamos HGNC aprovados genes [96] e denominações de isoformas UCSC [31].

Para avaliar o grau em que a alta expressão das proteínas da superfície celular terapeuticamente atraentes descritos acima para o tumor estudado é um fenômeno comum em SCC que examinaram os dados de transcriptoma TCGA de 221 tipos de câncer de pulmão de células escamosas [28], [65]. Importante, TCGA sequenciação é realizada em tumor volume, assim que a composição subpopulação é esperado para ser muito diferente do que as subpopulações CD133 + e CD133- do carcinoma de células escamosas em nosso estudo. Os dados de expressão TCGA publicamente disponível é analisado a exon-, junction- emenda, e em nível de gene. Desde que não há nenhuma maneira estabelecida para inferir a expressão de nível isoforma do exão e expressão junção de processamento, optamos por comparar o nosso nível de expressão isoforma estima com as estimativas de expressão de genes nível TCGA. Baseado no fato de que a nossa análise incidiu sobre as isoformas com alta expressão, que argumentou que, se os nossos resultados são gerais para SCC então poderíamos observar alta expressão dos genes correspondentes integrais através de uma maioria das amostras tumorais 221. Como mostrado na Figura 4A, 4C, a maioria dos 22 genes de superfície de células de interesse terapêutico são robustamente expressa em todas as 221 amostras com 12 colocação na parte superior de 10% (expressão mediana 31 RPKM) dos genes mais altamente expressos. Curiosamente, ABCG2 e ICAM4, que têm os dois níveis mais baixos dos 22 genes de expressão, foram predominantemente expresso na subpopulação CD133 +. Esta situação reflecte a de CD133 /PROM1 (Figura 3), de modo especula-se que a expressão aparentemente baixo de todo o tumor de ABCG2 e ICAM4 é porque eles são robustamente expresso apenas em células CD133 +, as quais constituem uma fracção menor das células tumorais. No geral, estes resultados indicam que nossas descobertas são gerais para SCC e assim poderia impactar o desenvolvimento clínico porque identificam esta doença como uma potencial nova indicação para numerosas drogas atualmente em desenvolvimento e sugerir vários novos alvos promissores adicionais.

A) superfície celular e B) estimativas de expressão gênica todo relacionadas com a apoptose de amostras de carcinoma de células escamosas 221 pulmonares. C) A distribuição dos níveis de expressão estimada para 20,533 genes por amostra, média de todos os 221 amostras. A linha horizontal pontilhada indica o top 5% dos genes, quando classificados por expressão.

Avaliação das isoformas de mRNA de genes envolvidos na apoptose

Dada a extensão das alterações genómicas observadas no análise CNA do SCC estudado e a multiplicidade de mecanismos de morte celular conhecidos que respondem a danos no DNA, que suspeita que as células cancerosas devem ter alterado a expressão de genes relacionados com a apoptose, a fim de sobreviver sob uma carga elevada, tais mutacional. Para obter insights sobre a capacidade de sobrevivência das subpopulações CD133 + e CD133-, foi realizada uma análise de expressão focado em um conjunto de 106 genes relacionados com a apoptose (Tabela S2 em Informação S2) que em conjunto tiveram 434 isoformas de mRNA. Tal como referido acima, que limita a nossa análise de isoformas que foram expressos ao nível de pelo menos 30 FPKM e que foram cobertos em pelo menos 60% do seu comprimento por sequenciação lê numa ou em ambas das subpopulações. Trinta dos 106 genes (28%) e 37 dos 434 isoformas (9%) preencheram estes critérios (Figura 5; Figura S6 em Informação S1). Interessantemente, apenas 9 isoformas em 6 genes foram significativamente expresso diferencialmente com pelo menos uma diferença de quatro vezes entre as duas subpopulações (FDR 0,01). Digna de nota é a expressão elevada de uma isoforma L-Myc (MYCL1, uc001cer) e uma isoforma de XIAP (XIAP, ucoo4etx) em ambas as subpopulações, com a regulação positiva de quatro vezes no CD133 + e as subpopulações CD133-, respectivamente. L-Myc é um factor de transcrição na qualidade global e de todas as proteínas da família Myc (N-Myc, c-Myc e L-Myc) que tem a actividade mais forte e mais específica na promoção iPSC humano geração-presumivelmente através do seu capacidade para suprimir genes associados à diferenciação [66]. XIAP é um supressor conhecido de apoptose, além de outras funções fisiológicas relacionadas com a sua actividade de ubiquitina-ligase E3 [67]. Destacam-se também os poucos isoformas (ou seja BCLAF1 e BFAR isoformas) com 16x expressão diferencial. BCLAF1, que tem uma isoforma altamente expresso somente na subpopulação CD133-, desempenha um papel crítico em diversos processos [68], incluindo o desenvolvimento pulmonar [69]. BFAR, uma ubiquitina ligase E3 provável que medeia a diafonia entre as vias apoptóticas intrínsecos e extrínsecos [70], tem uma isoforma exclusivamente expressa em células CD133 + e outro exclusivamente em CD133-. Estes resultados sugerem que, embora em geral as subpopulações CD133 + e CD133- semelhante expressar genes relacionados com a apoptose, diferenças de isoformas de genes-chave da apoptose de expressão podem, em parte, contribuir para as diferenças de auto-renovação e de sobrevivência entre estes tipos de células cancerígenas.

indicadas são os níveis de 434 isoformas de 106 genes relacionados com a apoptose de expressão. círculos cinzentos correspondem a isoformas que não cumprem nossos critérios de nível de expressão mínima e círculos azuis para isoformas que fizeram, mas não eram significativamente expressa diferencialmente. triângulos coloridos indicam isoformas significativamente diferencialmente expressos; triângulos para baixo apontando verdes indicam diminuição da expressão e triângulos up-apontando vermelho indicam um aumento da expressão nas células CD133 +. As linhas cinzentas diagonais são clines mudança vezes. Isoformas discutidas no texto são nomeados. Isoformas discutidas no texto são nomeados. símbolos Aqui usamos HGNC aprovados genes [96] e denominações de isoformas UCSC [31].

A seguir, focada nos genes relacionados com a apoptose mais altamente expressos em ambas as subpopulações CD133 + e CD133- para ganhar insights sobre os mecanismos de sobrevivência comuns entre estes tipos de células cancerígenas. Esta análise incidiu revelou c-Myc (MYC, uc003ysi), e as longas isoformas de TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), Mcl-1 (MCL1, uc010pch) e Bcl-x (BCL2L1, uc002wwl) para estar entre os mais genes relacionados com apoptose altamente expressos (Figura 5). Foi confirmada por RT-qPCR a alta expressão de c-Myc, Mcl-1

L, e Bcl-x

L em ambos o CD133 + e subpopulações CD133- (Figura S7 na informação S1). Está bem estabelecido que a alta expressão de c-Myc de forma potente induz o intrínseca via de morte celular (mediada por mitocôndrias); elevada expressão no entanto concomitante de Mcl-1

L, e Bcl-x

L pode sequestrar as proteínas mitocondriais da membrana externa de Bak e Bax [71], [72], e, assim, bloquear as consequências apoptóticos de c-Myc. um papel de Mcl-1

L e Bcl-x

L foi recentemente demonstrado em 14 linhas de c-Myc-driven não-escamosas do câncer de pulmão de células humanas de células [73], em modelos de ratos com câncer de pulmão adenocarcinoma [74], e em outros contextos de malignidade [75]. Os nossos dados implicam Mcl-1

L, e Bcl-x

G no bloqueio dos efeitos apoptóticos de c-Myc em ambos o CSC e a subpopulação não-CSC do carcinoma de células escamosas estudada. Notamos que, enquanto os longos isoformas de Mcl-1 e Bcl-X demonstraram funções pró-sobrevivência, as curtas isoformas destes genes, os quais não foram expressas, são pró-apoptótica [76]. Alta expressão da isoforma longa de TRAIL (TRAIL

G) em ambas as subpopulações é significativa, como esta citocina está sob investigação como um agente anti-cancro [77], porque pode matar selectivamente células de tumor por meio de apoptose mediada pelo receptor. No entanto, a exposição prolongada a níveis elevados de TRAIL

G pode resultar em TRAIL

resistência G, após o que TRAIL

L torna-se um forte indutor de proliferação e metástase [78]. Estudos anteriores demonstraram tanto Mcl-1

L, e Bcl-x

L para ser responsável por TRAIL adquirida

resistência L em linhas celulares de cancro do pulmão não-escamosas [79] e em outras linhas celulares de cancro [ ,,,0],80] – [83]. De nota, outro importante determinante da resistência TRAIL, c-Flip

L (CFLAR, uc002uxb) -a isoforma longa de falhanços /CFLAR que é um homólogo cataliticamente inativa da caspase-8-é também altamente expresso nas duas subpopulações de nossa SCC estudada (Figura 5) [79], [84] – [87]. Os curtas isoformas tanto de TRAIL e c-Flip têm também um papel pró-apoptóticos antitéticas em comparação com as longas isoformas [79], [88]. No total, a análise da expressão do gene ao nível isoforma sugere que no SCC estudada tanto as subpopulações CD133 + e CD133- foram impulsionadas por níveis muito elevados de c-Myc e TRAIL

L, e que a resposta apoptótica normal à elevada expressão destes genes foi prevenida através de níveis muito elevados de Mcl-1

L e Bcl-x

L e C-flip

L.

Mais uma vez foram utilizados dados de transcriptoma TCGA de 221 cancros do pulmão de células escamosas de determinar a generalidade dos nossos genes apoptose resultados da análise isoforma. Como acima para ABCG2 e ICAM4, atribuímos a expressão aparentemente baixo de todo o tumor de L-Myc (MYCL1) (Figura 4B, 4C) para a possibilidade de que no SCC-se robustamente expresso apenas em células CD133 +, as quais constituem uma fracção menor de as células tumorais.