Abstract
Fundo
miR-18a é uma das mais miRNAs regulados positivamente em cancro colorectal (CRC) com base em miRNA perfil. Neste estudo, nós examinamos o significado funcional de miR-18a no CRC.
Métodos
A expressão de miR-18a foi investigada em 45 pacientes com CCR. genes-alvo potencial de miR-18a foram previstos pelo
in silico
pesquisar e confirmada pelo ensaio de actividade de luciferase e Western blot. danos no ADN foi medida por ensaio de cometa. a função do gene foi medida pela viabilidade celular, a formação de colónias e ensaios de apoptose.
Resultados
O aumento da regulação do miR-18a foi validado e confirmado em 45 tumores primários CRC comparação com tecidos normais adjacentes
(
p
0,0001). Através de
in silico
pesquisa, o 3’UTR de
Ataxia telangiectasia mutado (ATM)
contém um sítio de ligação conservado miR-18a. Expressão da ATM foi regulada para baixo no CRC tumores (p
0,0001) e inversamente correlacionada com a expressão de miR-18a (r = -0,4562, p
0,01). A sobre-expressão de miR-18a em células cancerígenas do cólon reduziu significativamente a actividade da luciferase da construção com o tipo selvagem, mas não ATM 3’UTR que com mutante ATM 3’UTR, inferindo uma interacção directa de miR-18a com ATM 3’UTR . Isto foi confirmado pelo down-regulação da proteína ATM por miR-18a. Como ATM é uma enzima chave no DNA reparação de danos, que avaliou o efeito de miR-18a no DNA quebras de cadeia dupla. A expressão ectópica de miR-18a inibiu significativamente a reparação de danos no ADN induzida por etoposido (p
0,001)., levando a acumulação de danos do ADN, aumento da apoptose celular e sobrevivência clonogénica pobre
Conclusão
miR-18a atenua reparação celular de DNA quebras de cadeia dupla, suprimindo diretamente ATM, uma enzima chave na reparação de danos no DNA
Citation:. Wu CW, Dong YJ, Liang QY, ele xQ, Ng SSM, Chan FKL, et al. (2013) MicroRNA-18a Atenua DNA reparar danos através da supressão da expressão de Ataxia Telangiectasia mutado em câncer colorretal. PLoS ONE 8 (2): e57036. doi: 10.1371 /journal.pone.0057036
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 15 de novembro de 2012; Aceito: 16 de janeiro de 2013; Publicação: 21 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este projecto foi apoiado por uma National Science Foundation Natural da China (NSFC) (código Projeto 81.101.488), um programa China 863 (2012AA02A506) e Fundo ITF Hong Kong (ITS /276/11). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
miRNAs são de 18 a 25 nucleótidos não codificantes moléculas de RNA que regulam a tradução do mRNA. Eles exercem os efeitos alvejando o silenciamento complexo (RISC) aos locais complementares na região 3 ‘não traduzida (UTR) dos seus genes-alvo [1] induzida por ARN. A ligação de um miARN RISC-carregado a uma sequência complementar conduzirá quer a repressão translacional ou decaimento do ARNm alvo [2]. Através deste, miARNs regular uma variedade de processos celulares incluindo apoptose [3], [4], a diferenciação [5], e proliferação de células [6]. perfis de expressão de miRNA alterados foram encontrados na maioria dos tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal (CRC) [7], [8], [9], [10]. Manipulação de miARNs específicos verificou-se ser capaz de modular o desenvolvimento tumoral em modelos animais [6], [11], [12]. Anteriormente, a expressão através de perfis de 667 miARNs em tecidos de cancro colorrectal humano, foram identificados miR-18a como um dos mais miARNs regulados positivamente em CRC humana [13]. Um elevado nível de miR-18a pode ser detectado nas fezes de pacientes com CCR em comparação com indivíduos com colonoscopia normal. Após a remoção do tumor, o nível de fezes de miR-18a caiu significativamente [13].
miR-18a pertence ao grupo de miR-17-92, que está localizado na região cromossoma 13q31.1. O papel oncogénico do cluster miR-17-92 está bem documentada. A sobre-expressão do cluster está associada com o crescimento do tumor acelerado [6], e proliferação de células [14]. Cromossómica ganho de número de cópias na região de grupos de o miR-17-92 foi associada com a progressão neoplásica a partir de adenoma para carcinoma de [15]. Alta expressão de miR-18A foi implicada no cancro da mama [16], o cancro da bexiga [17] e cancro pancreático [18]. No entanto, o papel funcional de miR-18a no CRC permanece obscura. Neste estudo, objetivou-se identificar o seu gene alvo e seu papel crítico na CRC.
métodos e materiais
amostras de tecidos humanos
tumor retal e ao lado não-tumorais tecidos foram obtidos de 45 pacientes com câncer retal confirmou-histologicamente quando passou por uma cirurgia no Prince of Wales Hospital, Hong Kong durante 1999 a 2003. mucosa rectal normal foi obtido a partir de controles saudáveis durante a colonoscopia no Hospital Príncipe de Gales em 2009. Todos os indivíduos desde que o seu consentimento informado por escrito antes da coleta da amostra. O procedimento de protocolo de estudo e consentimento foram aprovados pelo Comitê da Universidade Chinesa de Hong Kong de Ética.
cultura de células, miRNA precursores e transfecção
linhas celulares de CRC HCT-116 e HT-29 foram adotado para
in vitro
ensaios porque estas duas linhas de células expressam ATM funcional em resposta ao DNA ruptura de fita dupla (LAP) [19], [20]. Ambas as linhas celulares foram adquiridas a partir da American Type Culture Collection e cultivadas em meio de McCoy 5A (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) com soro fetal de bovino 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) em 5% de CO
2 a 37 ° C. O precursor de miR-18a (pré-miR-18-A) e controlo negativo (pré-miR-Ctrl) foram adquiridos a Applied Biosystems (Foster City, CA). A transfecção foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o manual do fabricante.
Dual-luciferase Reporter Assay
O potencial sítio de ligação de miR-18a na região untranslation ATM 3 ‘(3’ UTR) foi prevista por TargetScan (www.targetscan.org) e miranda (www.microRNA.org). Sequências com as regiões de sementes mutantes de tipo selvagem ou foram clonados no vector RELATÓRIO PMIR-luciferase (Applied Biosystems). A sequência de ATM 3’UTR mutante foi preparado por mutação 5 nucleótidos na região da semente. Os oligos foram sintetizados como segue:
de tipo selvagem sentido vertente:
5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTGCACCTTAATGAAATTATCGAGCT-3 ‘
Wild-type anti-sense vertente:.
5′-CGATAATTTCATTAAGGTGCAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ‘
sentido vertente Mutant:.
5′-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTTCGTATCAATGAAATTATCGAGCT-3′
Mutant vertente anti-sentido:.
5′-CGATAATTTCATTGATACGAAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 ‘.
As linhas de células transfectadas de forma transiente com o pré-miR-18a ou controlo negativo pré-miR (a 15 nM de concentração final) em placas de 24 poços foram co- transfectada com
Renilla luciferase
relatório de vetor (195 ng /cavidade) e
Firefly luciferase
vector (5 ng /poço) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células foram colhidas 48 horas após transfecção e actividades de luciferase foram analisados pelo sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega, Madison, WI).
miARN Quantificação por transcrição reversa quantitativa Polymerase Chain Reaction
reversa quantitativa transcrição com polimerase de reacção em cadeia (qRT-PCR) de miARN indivíduo foi realizada utilizando o kit TaqMan miARN de transcrição inversa (Applied Biosystems) e o ensaio de miARN humano TaqMan (RNU6B: 001093; miR-18a: 002422; miR-16: 000391), com base em um protocolo modificado a partir de Applied Biosystems [21]. nível de expressão miRNA foi normalizada para controle interno. Os operadores experimento desconheciam os dados clínicos no momento da quantificação de miRNA foi realizado.
qRT-PCR para mRNA
Para mRNA ATM quantificação, o RNA total foi transcrito de forma inversa com iniciadores aleatórios usando transcrição reversa Kit (Applied Biosystems) e PCR em tempo real foi definido com Power Mix SYBR Green PCR master (Applied Biosystems). expressão ATM foi normalizada para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) As sequências dos iniciadores são como se segue: ATM: Para a frente: 5′-GGAGAGCTGGAAAGCATTGG-3 ‘; Reverso: 5’TGAGAAGCTGGGAGTGTTTCTG-3 ‘. GAPDH: Para a frente: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘reverso: 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
Análise Western Blot
A proteína total foi extraída e a concentração de proteína foi medida pelo CC de proteínas de Bradford. ensaio (Bio-Rad, Hercules, CA). 20 a 40 ul de proteína de cada amostra foram separados em 8% de gel de Bis /Tris-poliacrilamida por meio de electroforese e transferidas para membranas de nitrocelulose (GE Healthcare, Piscataway, NJ). As manchas foram imunocoradas com anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite e o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 hora. Anti-ATM anticorpo (2C1) foi adquirido a partir de Genetex (Irvine, CA). Anti-fosfo-cinase 2 Ponto de verificação de anticorpo (Thr68) foi adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-GAPDH (SC-25778) anticorpo foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).
Comet Ensaio
HCT-116 células foram transfectadas transientemente com o pré-miR-18a ou controlo pré-miR negativo (a 15 nM de concentração final) em placas de 24 poços. Após uma hora de incubação com 2 uM de etoposido ou de DMSO, as células foram colhidas, quer ou mudadas para meio sem etoposido durante 2 horas para permitir a reparação de danos no ADN. No final da experiência, as células foram colhidas para o ensaio de cometa de acordo com o manual do fabricante (Trevigen, Gaithersburg, MD). Os momentos da cauda dos cometas celulares foram analisados automaticamente usando um software de análise de cometa, CometScore (Tri Tek Corp, Sumerduck, VA). foram determinados momentos da cauda de 50 ou mais células por lâmina.
Formação de Colónias e de viabilidade celular Assay
Cells (1 × 10
5 por poço) foram semeadas em uma placa de 24 poços e transfectadas com pré-miR-18a ou pré-miR-ctrl a 15 nM. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram incubadas com 2 uM de etoposido ou DMSO durante 1 hora, recolhido e semeadas (500-1000 /poço) numa placa de 24 poços frescas durante 9 dias. As colónias foram contadas após coloração com
hematoxilina de Harris
solução. A viabilidade celular foi determinada pelo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) (Promega) de acordo com o manual do fabricante. Resumidamente, a solução de MTT foram adicionados a cada poço a uma concentração final de 1 mg /ml por poço e as placas foram incubadas a 37 ° C durante mais 3 h. Após a incubação, 200 uL de DMSO foi adicionado a cada cavidade para dissolver o formazano formado e a absorvância foi lida a 570 nm utilizando um espectrofotómetro. Todas as experiências foram triplicado.
Anexina V Ensaio de Apoptose
As células (1 x 10
5 por po) foram semeadas numa placa de 24 cavidades e foram transfectadas, com o pré-miR-18a ou pré-miR-ctrl a 15 nM. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram incubadas com 2 uM de etoposido ou DMSO durante 1 hora. A apoptose foi avaliada por citometria de fluxo, após coloração com anexina V (conjugado com FITC) (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) e 7-amino-actinomicina (7- AAD; BD Biosciences)
Estatísticas
Associação entre miR-18a e expressão ATM foi analisada pelo teste de correlação de Spearman r. Diferença entre dois grupos de ensaio de repórter de luciferase, Ensaio de ensaio e a formação de colónias cometa foi determinada pelo teste t de Student. Associações de nível de expressão de miR-18a com características clinicopatológicas foram analisados pelo teste exato de Fisher. A análise de regressão foi analisado por SPSS (IBM, Nova Iorque, EUA). Diferença nas curvas de crescimento celular foi determinado por medidas repetidas ANOVA. análise de sobrevida livre de progressão foi feita pelo método de Kaplan-Meier e os resultados foram testados pelo teste de Log-rank. p 0,05 foi tomado como significado estatístico. Todos os testes estatísticos, exceto a análise de regressão foram feitas por Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Resultados
miR-18a é regulada para cima no tumor retal
Entre os 45 pares de amostras de tecido de cancro rectal, 44 pares teve maior expressão de miR-18a no tumor do que no tecido normal adjacente (p 0,0001; Figura 1A), com uma diferença média de aumento de 11,46 vezes (IQR 4.73- 26,00). A alta expressão de miR-18a no tumor foi associado com maior taxa de recorrência, dos quais 9 em cada 15 casos com alta tumor miR-18a recorreram em comparação com apenas 6 dos 29 casos com baixa tumor miR-18a recorreram após a ressecção cirúrgica (p 0,05, tabela 1). A análise multivariada confirmou ainda que a associação entre nível de miR-18a e recorrência foi independente de idade, sexo e estágio do câncer (Tabela 1). análise de sobrevivência livre de progressão mostrou que pacientes com alta tumor nível de miR-18a tendem a ter recorrência mais rápido após a cirurgia, em comparação com pacientes com baixo nível de tumor miR-18a (p
=
0,005, Figura 2).
a expressão de (a) miR-18a, normalizados para miR-16a e (B) ATM, normalizados para GAPDH em 45 pares de tumores do reto e tecidos normais adjacentes. Os valores de p indicam diferenças significativas entre amostras emparelhadas determinado pelo teste de Wilcoxon de pares combinados. parcelas (C) de dispersão que mostram a associação entre nível de miR-18a e expressão ATM. (D) Expressão da ATM normalizados para GAPDH em 8 linhas de células colorretal e três biópsias de cólon normais (N1, N2 e N3).
High expressão de miR-18a nos tumores foi definida com base no maior tertile. expressão de miR-18a foi normalizada para a do miR-16 e referenciado para o nível de miR-18a no tecido normal adjacente. valor de p foi determinada pelo teste Log-rank.
In Silico Previsão do Target miR-18a e Validação de ensaio de luciferase
Usando algoritmos para predição de genes alvo, TargetScan [ ,,,0],22] e miranda [23], a enzima chave na reparação de danos no ADN, Ataxia Telangiectasia Mutante (ATM), foi identificado como um dos alvos potenciais de miR-18a. O alinhamento de sequências de miR-18a com diferentes espécies de ATM 3’UTR também foi conservada (Figura 3A), o que indica que a ATM é um dos potenciais alvos directos de miR-18a. O previu ligação de miR-18a com
Homo sapiens
ATM 3’UTR é ilustrada na Figura 3B. Para confirmar ainda que a ATM é o alvo directo de miR-18a, um segmento da 3’UTR da ATM consiste região da semente, com ou sem mutações de ponto, foi sub-clonado a jusante do repórter de luciferase de pirilampo (Figura 3B). As construções foram depois co-transfectados com pré-miR-18a ou com pré-miR controlo para ensaios de actividade de luciferase. A expressão ectópica de pré-miR-18a em células HCT-116 foi confirmada por qRT-PCR (p 0,0001, Figura 3C). A actividade de luciferase relativa da construção de tipo selvagem de ATM 3’UTR no HCT-116 foi significativamente reduzida na presença de miR-18a (p 0,001; teste U de Mann-Whitney), ao passo que um tal efeito supressivo de miR-18a sobre a actividade da luciferase não foi observada na presença do mutante ATM 3’UTR (Figura 3D), indicando uma interacção directa e específica de miR-18a em ATM 3’UTR. A interacção foi ainda confirmada pela observação de que a sobre-expressão de miR-18a foi capaz de reduzir o nível de proteína ATM e a fosforilação da cinase ponto de verificação (CHK-2), um alvo a jusante fosforilação directa de ATM
In vitro
(Figura 3E). Sob tratamento etoposídeo durante 1 hora, o nível pCHK-2 foi significativamente up-regulada independentemente de miR-18a sobre-expressão.
(A) O site alinhamento miR-18a (sublinhado) no prazo de ATM 3’UTR de diferente espécies é conservada. (B) humana madura sequência de miR-18a e a região de 3 ‘UTR da ATM humana contendo o sítio de reconhecimento, o qual foi clonado em uma construção com
Renilla luciferase
. O mutante de 3′-UTR contém uma região de sementes com 5 nucleótidos mutados (sublinhado). (C) A expressão de miR-18a no HCT-116 células transfectadas com miRNA controle precursor (pré miR-ctrl-) ou miR-18a precursor (pré-miR-18a) a 15 nM. (D) A actividade da luciferase em células HCT-116 co-transfectadas com o
Renilla
construção luciferase (contendo tipo selvagem ou região de semente de miR-18a mutante),
Firefly
construção luciferase e pré-miR- ctrl ou pré-miR-18a em 15 nM. Nível de atividade foi calculado através da normalização
Renilla luciferase
para
Firefly
luciferase. NS indica nenhuma significância estatística. valor de p foi determinada pelo teste t de Student. média e desvio padrão (SD) foi calculado a partir de três experiências independentes. (E) Immunoblot de expressão ATM endógeno no HCT-116 células 48 horas após a transfecção de pré-miR-ctrl e pré-miR-18a. (F) de imunotransferência da forma fosforilada da proteína de CHK-2, um alvo a jusante directa da ATM, em células HCT-116, após a transfecção de pré-miR-ctrl ou pré-miR-18a sob o tratamento com etoposido DMSO ou 2 fiM por 1 hora.
ATM é regulada em rectal linhas celulares tumorais e CRC
expressão
ATM foi avaliada em 45 pares de tumor retal e tecidos normais adjacentes. Em contraste com o miR-18a, a expressão de ATM foi significativamente menor do que em tumores em tecidos que não de tumor (p 0,0001; Figura 1B), com uma diferença média de 0,369 vezes (IQR 0,127-0,575). Expressão de miR-18a e que de ATM foram inversamente correlacionada com uma Spearman R = -0,4562 (p 0,01; Figura 1C). A sub-regulação aberrante da ATM também foi observada em linhas celulares de CRC em comparação com as biópsias do cólon normais (p 0,05, Figura 1D).
miR-18a Regula de cadeia dupla de DNA de recuperação de danos
activação ATM representa um evento precoce e importante para reparo de DNA em reponse a DSB de ADN [24]. Como o miR-18a é capaz de suprimir a expressão do ATM, a hipótese de que a sobre-expressão de miR-18a em células iria inibir o mecanismo de recuperação. O nível de LAP foi investigado por ensaio de cometa. Sem a indução de dano do ADN, as células HCT-116 teve um momento de cauda da linha de base de 7,75 ± 4,37 unidades. A exposição a 2 etoposido uM durante 1 hora resultou em um momento de cauda significativamente maior (15,46 ± 6,07 unidades, p 0,0001), indicando a indução de DSB de ADN por etoposido. Quando permitido durante 2 horas em meio normal suplementado com FBS a 10% para a recuperação, momento de cauda de etoposido tratada HCT-116 células restituídas ao nível da linha de base (7,69 ± 5,14 unidades), enquanto momento de cauda de células HCT116 que sobre-expressam o miR-18a permaneceu significativamente maior do que o nível da linha de base (p 0,001), indicando miR-18a induziu um efeito proibir reparo do DNA (Figura 4)
(a) a linha de tempo da ordem de tratamento (B) Amostras de caudas de cometas de. cada grupo, a partir da esquerda para a direita, as células transfectadas com percursor controlo miARN (pré-miR-ctrl) e sem tratamento com fármaco, as células transfectadas com o pré-miR-Ctrl e tratados com 2 uM de etoposido, as células transfectadas com o pré-miR-Ctrl e tratou-se com 2 uM de etoposido, e células transfectadas com pré-miR-18a e tratou-se com 2 uM de etoposido, os últimos dois grupos de células foram deixadas durante duas horas em meio normal após o tratamento com fármaco. (C) Box lote de momento de cauda de células sob tratamento diferente com base na análise de 50 células de campos microscópicos aleatórios. A caixa representa o intervalo interquartil, a linha do outro lado da caixa indica os valores medianos e bigodes representam 5-95 valores percentuais. valores de p foram avaliados por não paramétrico t-teste.
miR-18a aumenta a sensibilidade das células CRC para Genotoxin
Sem resposta rápida e reparação, o dano ao DNA acumula e reduz o crescimento celular e a viabilidade celular. Investigou-se o efeito de miR-18a sobre o crescimento de células de CRC por ensaio de formação de colónias em duas linhas celulares de CRC (HT-29 e HCT116). Sem a indução de dano do ADN, a sobre-expressão de miR-18a não tem efeito significativo no crescimento celular, em comparação com células transfectadas com o controlo de precursores, tanto em HT-29 (Figura 5A) e em HCT-116 (Figura 5C). Expostos a 2 uM etoposido, as colónias formadas foram significativamente reduzidos em HT-29 (Figura 5A) e em HCT-116 (Figura 5C). a viabilidade celular de forma consistente, a expressão ectópica de miR-18a significativamente suprimida quando comparada ao precursor controle sobre-expressando HT-29 (p 0,001; Figura 5B) e HCT-116 (p 0,05; Figura 5D).
o efeito da expressão ectópica de miR-18a no crescimento celular de células HT-29 (a) ou (C) células HCT-116, com ou sem tratamento de 2 uM etoposido. Média ± SD foi calculada a partir de três experiências independentes. diferença significativa foi determinada pelo teste t de Student. NS indica nenhuma significância estatística. Efeito de miR-18a em (B), HT-29 e (D) a viabilidade das células HCT-116 após tratamento com 2 uM de etoposido. Média ± SD foi calculada a partir de três experiências independentes. diferença significativa foi determinada por medida repetida ANOVA.
miR-18a Promove Genotoxin induzida apoptose
Sem a indução de danos no DNA, a sobre-expressão de miR-18a não induziu efeito significativo na apoptose de células HT-29 na e em HCT-116 (Figura 6). A exposição a 2 uM etoposido induzida significativamente a quantidade de células apoptóticas em ambas as células HT-29 e HCT-116 (ambos p 0,001; Figura 6A2 e 6B2). A sobre-expressão de miR-18a induzida ainda apoptose sinergicamente com etoposido em ambos HT-29 (p 0,0001) e HCT-116 (p 0,01). As células
células HT-29 (A) ou (B ), as células HCT 116, com ou sem tratamento de 2 uM etoposido. Média ± SD foi calculada a partir de três experiências independentes. diferença significativa foi determinada pelo teste t de Student. NS indica nenhuma significância estatística.
Discussão
Neste estudo, uma ligação clara entre o miR-18a ea ATM gene foi estabelecida. ensaio de repórter de luciferase e a análise Western blot confirmou a interacção, que foi através da ligação de miR-18a a região não traduzida 3 ‘do ARNm de ATM e subsequentemente suprimiu a sua proteína de tradução e a sua actividade. Esta associação foi mais evidente a partir da correlação inversa entre o miR-18a e ATM em tecidos de tumor do recto (p 0,01).
ATM é uma cinase de proteína de elevado peso molecular que desempenha um papel central e cedo na promoção da reparação de DSB de ADN, que são uma forma de as lesões de DNA mais citotóxicas que surgem através tanto endógena (por exemplo, o estresse oxidativo) e exógenos (por exemplo, radiações ionizantes e agentes genotóxicos) fontes. Em células não estimuladas, ATM existe principalmente como um homodímero inactivo ou multímero, com o domínio da quinase de uma proteína ATM ligado ao domínio interno de uma outra proteína ATM contendo o local serina-fosforilação 1981 [24]. Esta estrutura é essencial para manter a proteína ATM inativas e estável quando não há danos no DNA. Portanto, sob nenhum estímulo externo que leva a danos no DNA, miR-18a sobre-expressão induzida nenhuma mudança fenotípica significativa no HT-29 e células HCT-116, como é evidente pela viabilidade celular, proliferação e apoptose análise em comparação com grupos de controle. No entanto, em resposta a danos no ADN induzida por etoposido, um agente genotóxico que induz especificamente LAP, verificou-se que as células que sobre-expressam o miR-18a foram menos capazes de restaurar a partir de danos em comparação com células transfectadas com percursor controlo miARN, reflectindo uma DSB de ADN comprometidos mecanismo de reparo. Sob estímulo danificam o DNA, o domínio de quinase de uma proteína ATM fosforilada a 1981-domínio da proteína ATM interagir, o que resulta na quinase activa em forma monomérica [24]. Activado ATM é liberado e pode fosforilar um diversificado leque de alvos a jusante que participam de eventos para reparar o dano ao DNA [25]. A sobre-expressão de miR-18a quantidades reduzidas de proteína ATM e, assim, a disponibilidade de activado ATM para a reparação do ADN. Portanto, como o dano ao DNA acumula sem reparo rápido, miR-18a sobre-expressando células eram mais propensos a cometer apoptose, reduziu a sobrevivência clonogênica ea taxa de proliferação, como é evidente em ambas as células HT-29 e HCT-116.
comprometida mecanismo de reparação do ADN devido a perda de função do ATM é uma predisposição conhecida para várias doenças. O exemplo mais evidente sendo o autossómica recessiva desordem hereditária, ataxia-telangiectasia (A-T), que resulta da perda de expressão da proteína de ATM ou um produto proteico funcional. A doença é caracterizada por ataxia cerebelar progressiva, neuro-degeneração, radiossensibilidade, defeitos do checkpoint do ciclo celular, a instabilidade do genoma, e uma predisposição para várias formas de cancro [26], [27], [28]. ganho cromossómica em 13q31.1 região, em que o miR-17-92 está localizado, é um evento precoce na sequência adenoma-carcinoma. Consistentemente, a regulação positiva de miR-18a é encontrada desde estágio pré-canceroso do CRC [13]. O mecanismo de reparação do ADN induzida suprimida por sobre-regulada miR-18a poderia servir um papel catalisador na formação de carcinoma.
Actualmente, estágio do tumor é o indicador mais importante de prognóstico para pacientes de CRC. No entanto, muitos pacientes desenvolveram recorrência após ressecção cirúrgica, independentemente do estágio ou a prestação de quimioterapia adjuvante. biomarcadores de prognóstico adicionais são necessários para proporcionar uma melhor avaliação do risco de recorrência para que os pacientes podem se beneficiar de acompanhamento de perto. Encontramos alto nível de miR-18a está associada com maior taxa de recidiva e recorrência mais rápido. Ele continua a ser elucidado se este fenômeno é mediada através de ATM ou de outros genes alvo miR-18a. No entanto, o papel de ATM em predizer resistência à quimioterapia /terapia rádio-em um ambiente clínico não permanece claramente estabelecida. Roossink et ai. relatado que a ativação ATM induzida papel protetor à quimioterapia /radioterapia em uma coorte de pacientes com câncer cervical [29]. Jiang et al., No entanto, mostrou que a ATM pode sensibilizar e proteger contra a citotoxicidade induzida por doxorrubicina, dependendo da proficiência de outros genes de reparação de ADN, tal como p53 e CHK-2 [30]. Huehls et ai. mostraram que a depleção da ATM não sensibilizar as células a 5-FU, o qual é o principal regime utilizado no CRC [31]. Admansen et ai. também mostraram que a dose clinicamente relevante de 5-FU, a ATM da via não é activada durante a reparação do ADN em células de CRC [32]. Portanto, embora os
In vitro
dados demonstraram claramente a supressão da ATM por miR-18a sensibilizados células cancerosas para o etoposido, o papel do papel de ATM em quimio-resistência pode variar de um modo específico e-quimioterapêutico específico de tumores
in vivo
. Além disso, a recorrência miR-18a-associado também pode ser mediada através de outros genes alvos potenciais que induzem a sua natureza oncogênico
in vivo
. Esta hipótese, no entanto, precisa de mais investigação e validação. O estabelecimento de miR-18a como marcador de recorrência também precisa ser validado em uma coorte de maior tamanho da amostra.
Em conclusão, nós identificamos ATM, uma proteína essencial para a reparação do ADN, como o alvo de miR-18a. Nos tecidos do cancro retal, expressão de miR-18a e ATM correlação inversa. A expressão ectópica miR-18a suprime a expressão ATM e atenua a reparação do ADN DSB. miR-18a, um miRNA freqüência-regulada no CRC, induz o seu efeito oncogénico, pelo menos em parte, através da repressão ATM. Além disso, o nível de tumor miR-18a é um marcador potencial para a recorrência do câncer retal.