Abstract

MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que fisiologicamente modulam a expressão de proteínas e regulam vários mecanismos celulares. A alteração da expressão microARN tenha sido descrita em cancro e está associada a iniciação e progressão do tumor. O microRNA 148a (miR-148a) é frequentemente regulada no cancro. Nós anteriormente demonstrado que a sua infra-regulação por hipermetilação DNA é um evento precoce na carcinogênese pancreática adenocarcinoma ductal (PDAC), sugerindo uma função supressora de tumor. Aqui, nós investigamos o papel potencial do miR-148a sobre-expressão em PDAC como uma ferramenta terapêutica. Em primeiro lugar, comunicar as consequências de miR-148a sobre-expressão em linhas celulares PDAC. Nós demonstramos que o miR-148a sobre-expressão não tem efeito dramático sobre a proliferação celular e células quimio-sensibilidade, em quatro linhas celulares PDAC bem descritos. Nós também investigar a modulação da expressão da proteína por uma abordagem proteómica global (2D-DIGE). Mostra-se que, apesar da sua enorme sobre-expressão, o miR-148a fracamente modula a expressão de proteínas, prevenindo assim a identificação de alvos de proteínas em linhas de células PDAC. Mais importante ainda,

In vivo

dados demonstram que a modulação da expressão de miR-148a, quer nas células tumorais epitélios e /ou no microambiente tumoral não impedir o crescimento do tumor. Tomados em conjunto, demonstramos aqui que miR-148a não afeta a proliferação PDAC ambos

in vitro

e

in vivo

sugerindo um potencial fraco como uma ferramenta terapêutica.

Citation : Delpu Y, Lulka H, ​​Sicard F, Saint-Laurent N, Lopez F, Hanoun N, et al. (2013) o resgate de miR-148a Expressão em cancro do pâncreas: Uma ferramenta terapêutica inadequada. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10.1371 /journal.pone.0055513

editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 06 de janeiro de 2012; Aceito: 02 de janeiro de 2013; Publicação: 31 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Delpu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Institut National de la Santee et de la Recherche Medicale (INSERM, www.inserm.fr) e da Association pour la Recherche sur le Câncer (ARC, www.arc-cancer.net). estudos de proteômica foram apoiadas pela Infra-estrutura Toulouse Proteomics com o apoio financeiro da «Association pour la Recherche sur le Cancer» (ARC Programa ARECA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte por câncer nos países ocidentais Considerando que representa apenas 3% dos novos casos a cada ano [1]. PDAC prognóstico é frequentemente explicada pela falta de marcadores específicos de diagnóstico precoce e pela ausência de um tratamento eficaz. Até à data, a cirurgia representa a única abordagem curativa para a gestão PDAC, mas diz respeito a um pequeno subgrupo de pacientes devido à agressividade PDAC e fenótipo invasivo. Para os demais pacientes diagnosticados com localmente avançado ou metastático PDAC, a quimioterapia gemcitabina é o tratamento paliativo padrão com efeito modesto sobre a sobrevivência [2]. Por conseguinte, estudos notáveis ​​foram realizadas para elucidar os acontecimentos principais de condução carcinogénese pancreática, para identificar novos alvos e para desenvolver terapias específicas de tumor [3], [4]. As alterações genéticas e ambientais têm sido descritos como um evento precoce na evolução da PDAC [5]. Na última década, obras significativas em destaque o impacto de tais alterações moleculares na expressão de microRNAs no PDAC. MicroRNAs são ARNs de codificação não pequenas que inibem a tradução dos seus mRNAs alvo. Eles desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro, invasão e resistência às quimioterapias [6].

Nós já demonstraram que a expressão microRNA-148a (miR-148a) está regulada para baixo no início do desenvolvimento PDAC por hipermetilação do DNA genômico sequência [7]. Outros estudos relataram o down-regulação da expressão de miR-148a em outros tipos de câncer (

i

:., Esôfago, câncer gástrico colorretais e metástase do câncer) [8], [9], [10], [11]. Vários alvos de ARNm de miR-148a foram descritas em diferentes tipos de cancro. Estes objectivos reagrupar do ciclo celular, a apoptose ou de metilação do ADN efectores.

Estudos anteriores evocado um efeito consequente supressora de tumor a uma sobre-expressão de miR-148a em colorrectal e linhas celulares derivadas de cancro gástrico [8], [10 ]. Consequentemente, o presente estudo teve como objetivo determinar se a restauração impactos expressão de miR-148a proliferação PDAC ambos

in vitro

e

in vivo

e, portanto, poderia ser proposta como uma ferramenta terapêutica.

Materiais e Métodos

cultura celular

Humanos PDAC linhas celulares Capan-2 e IMIM-PC2 foi crescida em meio RPMI suplementado com 100 ml /l de soro fetal de vitelo, L-glutamina (2 mM ) (Life Technologies), cocktail de antibióticos e antimicóticos (Life Technologies) e Plasmocin® (5 ug /mL) (Invivogen). Kidney células HEK-293FT MIA PACA-2 e PANC-1 e células PDAC embrionárias humanas foram cultivadas em DMEM contendo 4,5 g /L de glucose (Life Technologies), 100 ml /l de soro fetal de vitelo, L-glutamina, antibióticos, e Fungizone® Plasmocin® (Invivogen). PDAC derivados de células BxPC-3 humana foram cultivadas em DMEM contendo 1 g /L de glucose (Life Technologies), 100 ml /l de soro fetal de vitelo, L-glutamina, antibióticos e antimicóticos cocktails. As células epiteliais positivas pâncreas humano nestina (HPNE) foram cultivadas em DMEM 75% 4,5 g /L de glucose (Life Technologies), 25% Meio M3 Base (Incell Corp.), soro fetal de bovino a 5%, 10 ng /ml de EGF humano recombinante ( Sigma-Aldrich) e 750 ng /ml de gentamicina (Life Technologies). Todas as linhas celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) exceto para as células HPDE e células HPNE que estão presentes amáveis ​​do Dr. M. S. Tsao (Universidade de Toronto, Canadá) e Dr. M. Ouellette (University of Nebraska Medical Center, Omaha, EUA), respectivamente [12], [13]. células IMIM-PC2 foram obtidos a partir de Dr FX Real (Espanhol Centro Nacional de Pesquisa do Câncer, Madrid, Espanha).

transfecção celular

Para tudo

in vitro

experimentos, miR- 148a precursores ™ miARN-miR pRE (Ambion) a 25 nM e 50 nM foram transfectadas utilizando siPORT ™ ™ NeoFX Transfecção agente (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Cy ™ 3 Pré-miR foi usado como controlo negativo e foi transfectado usando as mesmas condições.

análise do ciclo celular por citometria de fluxo

células transfectadas Capan-2 foram recolhidas, lavadas uma vez marcado com corante em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em gelo frio de 70% de etanol durante a noite a 4 ° C. As células foram recolhidas por centrifugação a 1.000 g, e lavadas com PBS. As células foram marcadas com iodeto de propídio (Life Technologies) seguindo as recomendações do fabricante. a distribuição do ciclo celular foi avaliada utilizando um aparelho de BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) e software de busca Pro celular (Beckton Dickinson) como descrito por Hanoun

et ai.

[14].

2D-DIGE electroforese

a lise celular foi realizada em ureia 8M, Thiourea 2 M, CHAPS 4%, pH 8,5. Após precipitação clean-up (kit 2D Clean Up, GE Healthcare), as proteínas foram novamente suspensas em tampão 2D DIGE amostra (ureia 8M, Thiourea 2 M, CHAPS 4%, pH 8,5). A concentração de proteína foi determinada com kit 2D Quant (GE-Healthcare). Cinquenta microgramas de proteínas foram marcadas com 400 pmol de CyDye DIGE Fluor Corantes mínimas (GE Healthcare) e incubou-se em gelo no escuro durante 30 minutos de acordo com as instruções do fabricante. A reacção foi parada pela adição de 1 ul de lisina 10 mM e incubou-se em gelo durante 10 min. O diferencialmente Cy-3 e Cy-5 amostras marcadas foram misturadas com o padrão interno Cy-2 etiquetado (amostra composta de aliquotas iguais de cada uma das amostras da experiência) e focagem isoeléctrica tampão (IEF) de re-hidratação (ureia 8M, tioureia 2M , CHAPS a 2%, DTT 10 mM, tampão 1,2% IPG (gradiente de pH imobilizado), pH 4-7, GE Healthcare) foi adicionado até 350 mL. Para a análise 2D-DIGE, IEF foi realizada usando um aparelho IPGphor 2 (GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante, com gradiente de pH imobilizado (IPG) de pH 4-7, de 18 cm. As tiras foram incubadas primeiro em tampão de equilíbrio (ureia 6 M, SDS a 2%, Tris-HCl 50 mM pH 8,6, glicerol 30%, azul de bromofenol a traço) contendo 1% de DTT, durante 15 min e em seguida no mesmo tampão com 4,5% iodoacetamida, durante 15 min, no escuro. As tiras foram carregados no topo de geles de acrilamida a 12,5% e correu em 1 W /h para 1,5 h e a 15 W /h até o azul de bromofenol atingir o fundo-extremidade do gel. Os géis foram varridos usando um trio Imager Typhoon (GE Healthcare) com resolução de 100 um com λex /EM de 488/520, 532/580, 633/670 nm para e Cy-2, 3-Cy e Cy-5, respectivamente. A análise das imagens foi realizada utilizando DeCyder 6,5 software (GE Healthcare).

Os plasmídeos

O plasmídeo pLVMND-SLUC que codifica a luciferase secretado Gaussia (Gluc) foi gentilmente cedido por Cayla-Invivogen (Toulouse, França ). Lentiviral vector de expressão que codifica o miR-148a e o copGFP (pMIRNA1-miR148a) ou copGFP sozinho (pMIRNA1-GFP) foram obtidas a partir de Biovalley (Marne-la-Vallee, França). Plenti6-TR, que codifica o repressor tet foi obtido a partir de Life Technologies. Para a expressão induzível de miR-148, dois oligonucleótidos parcialmente complementares correspondentes para amadurecer o miR-148a ou um controlo scrambled miR (miR-CT) foram hibridados e clonados no vector pcDNA6.2-GW /emGFP miR-(Life Technologies) antes de recombinação em pLenti4 /TO /vetor V5 DEST (Life Technologies) usando a estratégia Gateway®. Para a produção lentivectores, plasmídeos embalagem pHCMV-G, de codificação para a proteína VSV-G, e pCMVΔ8.91, de codificação para as proteínas do HIV-1 acessório, foram gentilmente doados pelo Dr. A. Dubart-Kupperschmitt (Paris, França).

Lentivirus vector de produção

Todos os replicação defeituosos, lentivirais auto-inativação foram gerados em uma facilidade BSL-3 (plataforma Vectorology, INSERM U1037 Cancer Research Center, de Toulouse, Toulouse, França) como previamente descrito por Torrisani

et al.

[15]. Resumidamente, a transfecção transiente de células HEK-293FT com embalagem e plasmídeos vectores lentivirais foram realizadas utilizando precipitação com fosfato de cálcio. pLenti4 /AO /GFP-miR-148a, pLenti4 /AO /GFP miR-TC foram usadas para se obterem partículas de lentivírus que codificam indutível miR-148a ou o miR-TC (ou seja, LV-A-miR-148a ou LV-A-miR- TC, respectivamente). Por outro lado, pMIRNA1-miR148a e pMIRNA1-GFP foram usados ​​para obter partículas lentivirais que codificam constitutivamente miR-148a ou o miR-CT (LV-miR-148a ou LV-GFP, respectivamente). Plenti6-TR e pLVMND-SLUC plasmídeos foram usados ​​para obter partículas lentivirais que codificam o repressor Tet ou a luciferase secretada (LV-TR ou LV-Gluc, respectivamente). Todos os lotes foram verificados livre de vírus replicativo. Os títulos virais foram determinados em células HT-1080 e expresso em unidades /ml de transdução (TU /mL) como descrito em outro lugar. Além disso, as concentrações de vetor foram quantificados por p24 ELISA (Innotest, Ingen, Paris).

Geração de PACA-2 linha celular estável miR-148a

MIA células PaCa-2 sobre-expressar MIA foram incubadas com as partículas de lentivírus LV-tr (multiplicidade de infecção = 5), durante 24 h e, subsequentemente, seleccionadas com blasticidina (Invivogen, Toulouse, França), a 100 ug /mL durante 2 semanas e clonadas por diluição em série para obtenção de MIA PaCa-2 células Tr. MIA PaCa-2 TR células foram adicionalmente transducted por LV-Gluc (multiplicidade de infecção = 5) e clonadas por diluição em série para dar células MIA PAC-2 TR-gluc. Estas últimas células foram incubadas com LV-A-miR-148a ou LV-A-miR-CT (multiplicidade de infecção = 5), durante 24 h e seleccionadas com zeocina (Invivogen) a 100 ug /mL durante 3 semanas e clonado pelo serial diluição para gerar MIA PaCa-2 TR-Gluc miR-148a e PaCa-2 TR-Glic linhas celulares miR-CT MIA, respectivamente. Uma concentração de doxiciclina óptima de 1 ng /ml foi determinada para induzir uma expressão máxima de miR-148a. As diferentes linhas celulares estáveis ​​foram então constantemente cultivadas na presença ou ausência de doxiciclina.

Medição da expressão de miR-148a por qRT-PCR

As células foram primeiro transfectados transientemente ou estavelmente transducted como descrito acima. O ARN total foi isolado a partir de linhas celulares com TRIzol Reagent (Life Technologies) de acordo com as instruções do fornecedor. A concentração de RNA foi medida com um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). O sistema de PCR miScript (Qiagen) foi usada de acordo com as instruções do fabricante para quantificar microARNs maduros a partir de 1 ug de ARN total. U6 e 5S ARNs foram utilizados como controlos internos. amostras de cDNA foram diluídos 1 em 100 para detecção de microARN ou U6 e 1 em 10.000 para a detecção de RNA 5S. ensaios duplicado qRT-PCR foram realizadas num StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com SYBR Verde PCR Master Mix (Qiagen). As quantidades relativas de miARN foram calculados pelo método de ciclo limiar comparativa (CT), como 2-ΔCT, onde ΔCT CTmiRNA = -. CT média geométrica de U6 e 5S

Ensaio de Proliferação

miR-148a 3 células precursoras transfectada controle negativo marcadas com corante precursoras ou Cy ™ foram semeadas a 6 x 10

3 células por poço de um prato de 96 poços e cultivadas em meio completo. Número de células viáveis ​​foi determinado pelo método colorimétrico usando celular CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Ensaio de Proliferação (Promega) de acordo com as instruções do fabricante no dia 4. Para a medição da proliferação, as células foram semeadas a 5 x 10

4 culas por po de a 35 mm pratos. As células foram cultivadas em meio completo suplementado com 1 ug /mL de doxiciclina. Quinhentos ng de doxiciclina foram adicionados a 48 h para impedir a sua decomposição em meio de cultura. As células foram contadas com um contador Coulter modelo ZM (Beckman Coulter) após 24 h, 48 h, 72 h e 96 h de cultura.

sensibilidade gemcitabina ensaio

Vinte e cinco mil em crescimento exponencial MIA PaCa -2 as células que expressam de forma estável o miR-148a ou controlar microARN cultivadas com ou sem doxiciclina foram plaqueadas em pratos de 35 mm. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com gemcitabina (Eli Lilly) em doses diferentes, variando de 1 × 10

-9 M a 1 x 10

-4 M. Depois de 72 h de tratamento, as células foram contadas usando o Coulter contador modelo ZM (Beckman Coulter). A gemcitabina “Concentração Letal 50” (LC

50) é a concentração de gemcitabina para o qual 50% das células tratadas morreram comparativamente com células não tratadas durante 96 horas. Para a medição da sensibilidade gemcitabina na célula transitoriamente que sobre-expressam o miR-148a, 1000 em crescimento exponencial de células transientemente PDAC que sobre-expressam o miR-148a ou um microRNA controlo (miR-CT) foram semeadas em placa de 96 cavidades. As células foram tratadas com diferentes doses de gemcitabina que variam de 1 × 10

-9 M a 1 x 10

4 M durante 72 h. Para cada linha celular, a viabilidade celular foi avaliada por um método colorimétrico, em comparação com a viabilidade medida em 1 × 10

-9 M poços tratados e representada como uma percentagem de células sobreviventes.

Migração e ensaios de invasão

Cem mil células em crescimento exponencial sobre-expressão de miR-148a ou a proteína repórter GFP foram privadas de soro durante 24 horas e semeadas em 24 inserções de tamanho bem-placa (8 mm porosos 24 inserções formato bem para os ensaios de migração e Biocat câmaras de invasão Matrigel para ensaios de invasão, BD Falcon) de acordo com as instruções do fabricante. Após 15 h, as células migradas foram coradas com violeta de cristal a 1% em solução de metanol a 20%, lisadas e a densidade celular foi determinada por medida da densidade óptica de lisados ​​celulares a 560 nm. Os resultados são expressos como percentagem de migração ou invadir o miR-148a sobre-expressando células em comparação com células que expressam GFP.

enxerto de células ortotópico

SCID /bege ratinhos pingado com oito semanas de idade, CB 17 ( TAKONIC) foram utilizados para experiências de enxerto de células. Cada ratinho recebeu 12 × 10

6 em crescimento exponencial de células MIA PaCa-2 que sobre-expressam de forma estável o miR-148a em 100 ul de PBS injectados na cauda do pâncreas. As injecções foram realizadas com um cateter de calibre 29 a linfografia conjunto com uma agulha de calibre 29. insulina. Os ratos enxertados com células que expressam o miR-148a receberam água

ad libitum

suplementado com sacarose (25 g /L) e doxiciclina (2 g /L). Os ratinhos de controlo receberam água

ad libitum

suplementado com sacarose única (25 g /L). Trinta dias depois de xenoenxerto, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram removidos, pesados ​​e medidos. O volume do tumor foi determinado pela fórmula ((tumor comprimento) x (largura do tumor

2)) /2. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do gráfico para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do INSERM. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano, e todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento. Todos os protocolos, incluindo animais foram aprovados pelo comitê de ética ANEXPLO. A observação macroscópica de tumores foi realizada por um patologista qualificado.

In vivo

transdução de tumor de MIA PaCa-2 tumores

tumores ortotópicos foram estabelecidos em SCID CB17 pâncreas ratos por injecção de 12 × 10

6 de crescimento exponencial MIA PaCa-2-Gluc (como descrito acima). Os tumores foram cultivadas por 15 dias antes da injecção de 250 ng p24 de LV-miR148a lentivector usando um linfografia cateter calibre 29 set com uma agulha de insulina 29 gauge. LV-GFP foi injectado em ratos de controlo. a progressão do tumor antes e depois de transdução foi monitorizada por meio de Medição de nível Gluc em soro de ratinhos (como descrito abaixo) e por palpação abdominal.

A actividade da luciferase em ratinhos soro

A actividade de luciferase foi medida no soro de murganhos . O sangue foi recolhido a partir de amostras retro-orbital usando uma pipeta Pasteur capilar (VWR) previamente cheio com 10 uL de uma solução de EDTA a 20%. As amostras de sangue foram mantidas em gelo até à centrifugação. As amostras foram centrifugadas 3.000 g durante 15 min a 4 ° C e de soro foram recolhidas e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. A actividade de luciferase foi determinada a partir de 5 uL de soro e 45 uL de uma solução 50 uM de coelenterazina (Fluka analítica) em um dispositivo de subida Luminoskan (Thermo Scientific).

A análise estatística

Os resultados são expressos como a média ± erro padrão. A significância estatística das diferenças foi medida com o teste não paramétrico de Mann-Whitney, com uma

P

valor 0,05 considerado estatisticamente significativo. O símbolo * indica um

p

valor 0,05, ** indica um

p

valor 0,01 e *** indica um

p

valor. 0,005

resultados

Efeito da transitória miR-148a sobre-expressão no PDAC linha de células de crescimento

Nós relatado anteriormente que a expressão de miR-148a é reprimido por hipermetilação DNA de sua seqüência genômica em células PDAC linhas e tumores [7]. Pode-se especular que a perda de expressão de miR-148a é crucial para o desenvolvimento PDAC. Para avaliar tumorais efeitos supressores de miR-148a em PDAC, Capan-2, PANC-1, Mia PaCa-2 e BxPC-3 linhas celulares PDAC foram transfectadas por um precursor de miR-148a oligonucleótido (miR-148a) ou um precursor de controlo ( miR-CT). HPNE células que são células pancreáticas humanas que exibem um fenótipo normal foram utilizadas como células de controlo “não-cancerosas”. A proliferação celular foi medido pelo método colorimétrico de 4 dias após a transfecção. células transfectadas miR-CT foram usados ​​como referência interna para cada linha de células (Figura 1A). A eficiência de transfecção foi avaliado para cada linha de células pela medição de fluorescência com Cy3 e atingiu 90-100% (dados não mostrados). Resultando a expressão de miR-148a foi medida por qRT-PCR (Figura S1A). MiR-148a sobre-expressão em células normais pancreáticas HPNE não induziu alterações significativas na proliferação de células. Do mesmo modo, qualquer alteração significativa na proliferação das células foi observada nas quatro linhas celulares PDAC em comparação com células de controlo transfectadas Cy3. Em paralelo, a distribuição do ciclo celular em células Capan-2 foi determinado por análise de FACS (Figura 1B). De acordo com a ausência de efeito da proliferação celular, sem alteração da distribuição do ciclo celular foi observado em células transfectadas miR-148a em relação às células de miR-CT. Estes resultados indicam que o transiente de miR-148a sobre-expressão não tem qualquer efeito particular sobre a proliferação de células de quatro linhas celulares PDAC.

(A), Capan-2, PANC-1, Mia PaCa-2 e BxPC-3 PDAC linhas celulares derivados e linha de células HPNE não-cancerosas foram transitoriamente transfectadas com precursores de miR-148a miR-CT ou. Quatro dias após transfecção, a viabilidade celular foi avaliada através de métodos colorimétricos. Para cada linha celular, a viabilidade das células-148a miR foi comparada com a viabilidade das células de miR-CT (100%). Os resultados são a média de três experiências independentes (± SEM) e são expressos como percentagem de viabilidade celular de células de controlo. (B), a distribuição do ciclo celular foi medido por coloração com iodeto de propídio, seguido de análise de FACS 72 horas após a transfecção de células Capan-2 com precursores de miR-148a miR-TC ou.

Efeito do miR- estável 148a sobre-expressão no PDAC linha de células comportamento

Além de experiências de transfecção transiente, geramos partículas lentivirais baseados em Tet-on para expressão estável de miR-148a para prevenir a cárie oligonucleotídeo rápida e permitir um acompanhamento a longo prazo -up de eventos celulares em linhas celulares PDAC. Nós transducted células MIA PaCa-2 devido ao seu nível de baixa expressão de miR-148a endógena [7]. Nestas células, o tratamento com doxiciclina leva a um aumento de cinco vezes na expressão de miR-148a, em comparação com o miR-TC sobre-expressando células (Figura S1B). No entanto, a expressão estável de miR-148a não conduzir a alterações significativas na proliferação celular nestas células, quando comparado com células de controlo (Figura 2). Além disso, a migração e invasão potencial de células que sobre-expressam o miR-148a foi medido e comparado com culas de controlo (Figura S2). Aqui, observamos que miR-148a sobre-expressão não modifica essas duas funções celulares em nosso modelo de linha de células MIA PACA-2. Tomados em conjunto, demonstramos que de forma semelhante ao transitórias de expressão, expressões de miR-148a longa duração é ineficaz para a inibição da proliferação de células PDAC e não afeta o comportamento das células

in vitro

.

células MIA PaCa-2 foram incubadas com inducible lentivirais codificação para corrida microRNA (miR-CT) ou miR-148a (miR-148a). MIA PaCa-2 miR-TC ou a taxa de proliferação de miR-148a foi avaliada na presença ou na ausência de doxiciclina em meio de cultura. Para cada condição, a contagem de células foi realizada a cada 24 h e em comparação com o número de células aderentes no dia 1. Os resultados são a média de três experiências independentes (± SEM).

sensibilidade de gemcitabina PDAC linhas de células que sobre-expressam o miR-148a

foi proposto anteriormente que microARNs pode afectar a quimiossensibilidade por segmentação transportadores de droga ou alterar a via celular essencial para o metabolismo da droga ou a sobrevivência das células [16]. Como descrito acima, gemcitabina é a quimioterapia de referência para PDAC. Foi avaliado se miR-148a participa PDAC sensibilidade células contra esta droga. Nós primeiro notou nenhuma correlação significativa entre os níveis de miR-148a endógena (Figura 3A) e sensibilidade gemcitabina em várias linhas celulares PDAC (Figura 3B). Em paralelo, foi avaliada a sensibilidade gemcitabina em células MIA PaCa-2 que sobre-expressam de forma estável o miR-148a ou um miR-CT (Figura 3C). Os resultados obtidos a partir de três ensaios independentes indicam uma redução não significativa do valor de concentração letal 50 (CL50) de gemcitabina na presença de miR-148a, em comparação com células de controlo. Resultados semelhantes foram obtidos após a transfecção transiente de miR-148a em várias linhas de células (Figura PDAC S3). No seu conjunto, estes resultados indicam que o miR-148a não influencia dramaticamente PDAC sensibilidade contra linhas celulares de gemcitabina.

(A) miR-148a nível de expressão endógeno foi medida por qRT-PCR em várias linhas celulares e em PDAC e hPDE hPNE linhas de células pancreáticas normais. (B) Sensibilidade a gemcitabina celular foi medida após um tratamento de 72 h-em várias linhas celulares PDAC e em células pancreáticas hPNE normais. Fracção sobrevivente de células representa o número de células tratadas durante 72 h, em comparação com o número de células não tratadas (representados como 100%). A concentração letal 50 (CL50) representa a dose de gemcitabina suficiente para obter 50% de células sobreviventes em comparação com células não tratadas. Os resultados são a média de três experiências independentes (± SEM). (C) A sensibilidade celular a gemcitabina foi medida em células MIA PaCa-2 estavelmente sobre-expressando o miR-148a (LV-A-miR-148a) ou um controlo de miR (LV-A-miR-CT) a gemcitabina na presença de doxiciclina após um tratamento de 72 h-. Fracção sobrevivente de células representa o número de células tratadas durante 72 h, em comparação com o número de células não tratadas (representados como 100%). Os resultados são a média de três experimentos independentes (± SEM).

análise Proteína perfil de expressão após transitória miR-148a sobre-expressão

Cada microRNA podem potencialmente afetar a tradução de dezenas de alvos de mRNA de acordo com a conservação de sua sequência alvo [6]. A ausência de efeitos celulares após o miR-148a sobre-expressão pode ser explicado tanto por uma mudança fraco no perfil de expressão de proteínas, insuficiente para produzir um efeito celular, ou pela sobre-regulação de uma via molecular emergência, consequente ao alvo miR-148a decair. Consequentemente, foi realizada uma análise em larga escala de perfis de expressão de proteínas por 2D DIGE após transitória miR-148a sobre-expressão em células Capan-2. células Capan-2 transfectadas com miR-CT foram utilizados como controle. análise de fluorescência de 2D-gel revelou que miR-148a sobre-expressão única resulta em uma modulação fracos de cerca de 2.200 a expressão da proteína quando comparado com células de controlo (Figura S4). Nenhuma destas variações atingiu o valor de cut-off (1,5 mudança vezes em comparação com células de controlo transf ectadas), apesar de uma sobre-expressão em massa de miR-148a (Figura S1A). Em consequência, não há espécie de proteína foram identificados por espectrometria de massa.

Estes resultados indicam que o miR-148a não afecta dramaticamente perfis de expressão de proteínas em células Capan-2 que podem ser responsáveis ​​pela ausência de efeitos biológicos a sua consequente sobre -expression.

In vivo

efeitos de miR-148a sobre-expressão

Para determinar se miR-148a pode influenciar o crescimento do tumor

in vivo

, geramos tumores PDAC ortotópicos em camundongos SCID CB17 usando células MIA PaCa-2 de forma estável sobre-expressão de miR-148a por 5 vezes (Figura S1B). Estas células expressam constitutivamente Gaussia luciferase (Gluc) para rastreamento não-invasivo do crescimento do tumor. Tal como descrito por Chung e colaboradores, Gluc quantificação no soro reflecte com precisão a quantidade de células viáveis ​​cancerosas em tumores de xenoenxerto [17]. Para

in vivo

estudos, Gluc foi amostrado a cada 5 dias e os ratos foram sacrificados após 33 dias, de acordo com o tamanho do tumor estimado por palpação abdominal. A correlação entre o peso do tumor e de sinal Gluc (R

2 = 0,79) foi confirmada após a ressecção do tumor e comparação com a dose Gluc no soro amostrados no dia da cirurgia (Figura S5).

Durante o curso desta experiência, descobrimos que os níveis Glic não foram alterados pela expressão de miR-148a indicando que miR-148a não inibe a progressão do tumor PDAC

in vivo

(Figura 4A). Consistente com estes resultados, a análise de tumores após a cirurgia não revelaram efeitos inibidores de miR-148a sobre o peso do tumor (Dox: 0,368 g ± 0,16 g

vs não tratado: 0,348 g ± 0,22 g) (Figura 4B). Além disso, o estudo histológico dos tumores indica que não há diferença na organização do tecido entre os diferentes grupos (Figura S6). Estas observações não revelam o efeito dramático de expressão de miR-148a no crescimento do tumor ou desenvolvimento do tecido tumoral

in vivo

(A)

In vivo

acompanhamento da progressão do tumor xenoenxerto.: células MIA PaCa-2 que expressam o miR-148a e segregada da luciferase Gaussia (Glic) foram injectados no pâncreas de ratinhos SCID. Os ratinhos receberam água normal (não tratado, n = 10) ou água suplementada com doxiciclina (doxiciclina, n = 12) para a indução de expressão de miR-148a até ao sacrifício. GLIC foram medidos no soro de ratinhos. Os resultados são a média de actividades Glic (± SEM) e são expressos como arbitrária unidade de luz (A.L.U.). (B) Os tumores foram removidos e pesados ​​no dia da cirurgia. Os resultados são a média (± SEM) do peso do tumor no grupo não tratado (n = 10) e o grupo de doxiciclina tratado (n = 12) (C)

In vivo

monitorização da progressão do tumor de xenoenxerto: MIA PaCa-2 as células que expressam a luciferase Gaussia secretado foram injectados no pâncreas de ratos SCID (n = 10). Quinze dias mais tarde, os vectores lentivirais que codificam o miR-148a (miR-148a, n = 7) ou GFP única (GFP, n = 3) foram injectadas nos tumores (a seta indica a injecção de partículas lentivirais). A quantidade de Glic foi medido no soro de ratinhos e comparada com a quantidade Gluc medido no dia da injecção lentivector (Dia 0). Os resultados são a média da razão de nível Gluc em cada grupo (± SEM) e são expressos como relação de unidade arbitrária luz. (D) Os tumores que receberam o miR-148 (miR-148a, n = 7) ou GFP (GFP, n = 3) foram removidos 10 dias após a injecção de lentivírus e foram pesados. O gráfico representa a comparação do peso do tumor que expressa o miR-148a (n = 7) ou GFP (n = 3). Os resultados são a média de peso do tumor em cada grupo (± SEM).

In vivo

medição do miR-148a potencial terapêutico

Para avaliar um anti -tumor potencial de um miR-148a aguda sobre-expressão em ambas as células tumorais eo microambiente, injetamos partículas lentivirais que codificam miR-148a (LV-miR-148a) em pré-estabelecidos tumores Glic PACA-2 MIA enxertados no pâncreas de ratinhos SCID CB17. partículas lentivirais que codificam proteínas repórter GFP (LV-GFP) foram utilizados como controle. MiR-148a sobre-expressão em tumores LV-miR-148a injectados foi verificada por meio de qRT-PCR (Figura S7). a progressão do tumor foi monitorizada por amostragem do soro Gluc em ratinhos. A diminuição do sinal de Glic foi observado no prazo de 5 dias após a transdução do tumor para ambas as partículas (Figura 4C). A partir do dia 5 ao dia 10, os níveis de Glic eram estritamente semelhante em miR-148a e tumores transducted de controle, que indicam nenhuma diferença na viabilidade do tumor após a injecção de vetores lentiviral. De acordo com a dosagem Gluc, os pesos dos tumores ressecados no dia 10 são semelhantes em LV-miR-148a e grupos de transducted-GFP do VE (miR-148a: 1,77 g ± 0,30 g

vs

LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (Figura 4D). Estes resultados indicam que a transferência de genes de miR-148a em ambos os tecidos do tumor e microambiente não afeta a viabilidade do tumor e não revela potencial terapêutico particular.

Discussão

expressão de miR-148a é alterada em diversos tipos de cancro e a sua infra-regulação é bem descrito em diversos tumores sólidos, tais como colorrectal, do ovário, da próstata e cancros gástricos [8], [11], [18], [19].