Abstract

Fundo

Os tumores freqüentemente exibem perda de genes supressores de tumor ou ganhos alélicas de activado oncogenes. Uma proporção significativa de loci de suscetibilidade ao câncer em ratos mostram perdas somáticos ou ganhos consistentes com a presença de uma susceptibilidade tumor ou alelo de resistência. Assim, os ganhos ou perdas somáticas específicas dos alelos em loci pode demarcar a presença de resistência ou susceptibilidade alelos. O objetivo deste estudo foi determinar se previamente mapeados susceptibilidade loci para a evidência de câncer colorretal espectáculo de eventos somáticos específicos de alelo em tumores de cólon.

Métodos

Realizamos a genotipagem quantitativo de 16 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que mostra associação estatisticamente significativa com cancro colo-rectal em estudos de associação do genoma publicados (GWAS). Foram genotipados 194 amostras de DNA de tumores normais e colorretais emparelhados e 296 amostras de validação emparelhados para investigar esses SNPs para ganhos e perdas somáticas específicas de alelo. Nós combinamos a análise dos nossos dados com os dados publicados em sete desses SNPs.

Resultados

Não foi observada evidência estatisticamente significativa para a seleção somática alelo-específico para os polimorfismos testados no conjunto de descoberta. O

rs6983267

variante, que mostrou perda preferencial do alelo de risco não-T e o ganho relativo do alelo de risco G em estudos anteriores, favorecida ganho relativo do alelo G nas amostras combinadas de detecção e validação (corrigido p-valor = 0,03). Quando combinado com os nossos dados desequilíbrio dados específicos de alelo publicados para este SNP, o alelo G de

rs6983267

mostrou evidência estatisticamente significativa de retenção relativo (p-valor = 2,06 × 10

-4).

Conclusões

Nossos resultados sugerem que a maioria das variantes identificadas como alelos de susceptibilidade cancro do cólon através de GWAS não apresentam desequilíbrio alelo-específico somática em tumores de cólon. Nossos dados confirmam os resultados anteriormente publicados mostrando desequilíbrio alelo-específico para

rs6983267

. Estes resultados indicam que o desequilíbrio alelo-específico de alelos de susceptibilidade ao câncer pode não ser um fenômeno comum em cancro do cólon

Citation:. Gerber MM, Hampel H, Schulz NP, Fernandez S, Wei L, Zhou XP, et al . (2012) Avaliação da somáticas Alterações Alelo-específicos de Genome-Wide Association Study susceptibilidade alelos em câncer colorretal humano. PLoS ONE 7 (5): e37672. doi: 10.1371 /journal.pone.0037672

editor: Ludmila Prokunina-Olsson, do National Cancer Institute, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 17 Janeiro, 2012; Aceito: 26 de abril de 2012; Publicado em: 21 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Gerber et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado em parte pelo NIH /NCI (CA134461 a AET e CA67941 para ADLC) ea concessão da Ohio State University Comprehensive Cancer Center Núcleo (CA16058). MMG foi financiado por um Colégio OSU de Sistemas de Medicina e Biologia bolsa de formação integrada. NPS foi financiado por um Colégio OSU da Bolsa Medicina Medical Research Student. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Amanda Toland é membro do Conselho Editorial PLoS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

genes supressores tumorais e oncogenes têm sido reconhecidos para mostrar as perdas no número de cópias e ganhos em tumores, respectivamente [1], [2]. Classicamente, o alelo de tipo selvagem de genes supressores tumorais em tumores é perdido enquanto que o alelo mutado ou não-funcional mostra a retenção selectiva. Da mesma forma, uma mutação activado ou cópia activado de um oncogene é freqüentemente selecionados para ganho ou amplificação em tumores. Estudos anteriores, usando modelos de ratos mostram evidências de que um subconjunto de loci de susceptibilidade para a pele e câncer de cólon demonstram ganhos ou perdas específicas de tensão consistente com estes tumor habitação loci promover alelos ou alelos supressores de tumor [3], [4]. Por exemplo,

PTPRJ

, um gene originalmente identificado como um mapeamento de supressor de tumor candidato ao mouse

SCC1

lugar, foi mostrado a perder preferencialmente um alelo de resistência suspeita em um subconjunto de adenocarcinomas colorretais humanos heterozigotos mostrando perda de heterozigosidade em

PTPRJ

[3]. ganhos específicos de alelo de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em

AURKA

,

rs2273535

, têm sido observadas em vários estudos de tumores colorretais [5], [6]. ganhos alélicas preferenciais ou perdas em várias regiões do genoma foram identificados em rastreios de todo o genoma olhando para indivíduos com tumores primários independentes múltiplos [7] e em estudos genómicos de amostras de glioblastoma através da comparação da linha germinal e dados de genótipos somáticas [8].

Vários estudos de associação do genoma revelaram alelos associados com o cancro colorectal risco (CRC) [9] – [16]. O SNP

rs6983267

em

8q24

tem sido associada a ambos colo-rectal e cancro da próstata risco ao nível de significância do genoma [9], [17], [18]. A análise do número de cópias específica de alelo mostrou que o alelo G (o alelo de risco putativo) dessa variante preferencial mostra os ganhos em tumores do cólon e leucemia mielóide [19] – [21]. Para nosso conhecimento, não há outros SNPs da literatura GWAS publicado mostraram definitiva e reprodutível desequilíbrio alelo-específico em tumores colorretais, embora estudos individuais têm descrito desequilíbrio alélicas no CRC para outros loci [7], [22]. No presente estudo, foi realizada genotipagem quantitativo de 16 variantes estatisticamente significativas de GWAS publicado (incluindo

rs6983267

) no ADN do tumor colorretal normal e emparelhado. O objetivo deste estudo foi investigar esses SNPs para ganho somática do alelo de susceptibilidade ou perda do alelo de resistência usando desequilíbrio alélico análises.

Métodos

amostras humanas

Ética declaração.

Este estudo foi aprovado pela The Ohio State University (OSU) Institutional Review Board. Todos os participantes do estudo desde consentimento informado por escrito para o uso de seus tecidos em pesquisa.

Descoberta Set.

Emparelhado normal e (FFPE) blocos de tecido de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina foram obtidos através da OSU Human Tissue Research Network eo tecido Rede Centro-Oeste Cooperativa humana. Os tumores que exibiram estabilidade de microssatélites e /ou marcadas positivamente para as proteínas síndrome de Lynch MSH2, MLH1, PMS2 e MSH6 por imuno-histoquímica (IHQ) foram priorizados para inclusão no estudo. Quando microssatélites ou dados IHC não estavam disponíveis, os tumores que apresentavam características sugestivas de síndrome de Lynch, como localização do lado direito, pobre diferenciação, e uma alta porcentagem de mucina foram excluídos [23]. Após a seleção, confirmação da extração de diagnóstico e DNA, 194 pares de DNA histologicamente normais /tumorais estavam disponíveis para estudo.

Validação definido.

Um conjunto de validação de 296 amostras duplas de não-tumorais /DNA tumor foram obtidos de duas coleções de estudo existentes. Amostras de 196 indivíduos foram adquiridos a partir de um estudo de coorte de base populacional de câncer de cólon diagnosticado incidente na área metropolitana Columbus [24], [25]. DNA de sangue estava disponível para todos os casos. Um 100 amostras de tecido adicionais frescos congelados emparelhados normais e tumorais foram obtidos através da Rede Tissue Cooperativa Humana da Universidade do Estado de Ohio Medical Center. Os espécimes foram snap-congelados logo após a cirurgia e recebeu anonimamente, juntamente com um relatório de patologia completo. Os 296 casos de CRC foram todos classificados como provável que seja microssatélites estável, o conjunto de 196 amostras foi estável por testes de instabilidade de microssatélites, e os tumores congelados frescos 100 todos mostraram proteínas de reparo incompatibilidade intactas por coloração imuno-histoquímica.

Extração de DNA

Test Set.

hematoxilina e eosina manchas de seções normais e tumorais FFPE foram avaliadas por um patologista para confirmar o diagnóstico e para marcar tecidos para perfuração. núcleos de tecidos, de 1,6 mm de diâmetro foram preparados a partir de regiões que consistem em 70% ou mais das células tumorais para recolha de ADN de tumor, ou a partir de regiões com histologia normal para o isolamento de ADN normal (não-tumoral). O ADN genómico foi extraído de núcleos de tecidos como descrito anteriormente [26] e quantificado com um espectrofotómetro Nanodrop-1000. A maioria dos ADNs foram de boa qualidade, tal como indicado por razões A260 /A280 maiores do que 1,8.

Validação Conjunto.

ADN tumor do estudo área metropolitana-Columbus foram isolados como descrito [26] . ADN normal a partir destes indivíduos foram isolados a partir de amostras de sangue no banco de exemplo OSU Human Genetics por protocolos padrão. Os DNAs das 100 amostras de DNA emparelhado normais /tumorais de Cooperative Tissue Network humano foram isolados a partir do tecido fresco congelado pelo mesmo protocolo de extracção usado para as amostras de conjunto de teste. DNAs normais das três fontes (FFPE, sangue e tecido fresco congelado) apresentaram frequências semelhantes de heterozigosidade e proporções A260 /A280 semelhantes, sugerindo qualidade do DNA comparáveis ​​entre origens da amostra.

Inclusão de SNPs de Estudos

para testar a nossa hipótese de que a CRC susceptibilidade loci iria mostrar eventos somáticos específicos de alelo em tumores, buscamos a literatura recente para identificar variantes que mostram evidência de risco CRC de estudos GWA [9], [10], [13] – [ ,,,0],15], [27] – [32]. Dezessete SNPs (

rs10411210

,

rs10936599

,

rs11169552

,

rs16892766

,

rs3802842

,

rs4444235

,

rs4779584

,

rs4925386

,

rs4939827

,

rs6687758

,

rs6691170

,

rs6983267

,

rs7014346

,

rs7136702

,

rs719725

,

rs961253

,

rs9929218

) reunião ou se aproximando de todo o genoma de significância (valor-p 10

-7) para o risco de CRC em estudos publicados GWA foram escolhidos para análise de desequilíbrio específica de alelo no conjunto descoberta inicial de pares de tumor /ADN normais (Tabela 1). Outros critérios de inclusão para estudo incluiu a identificação de populações caucasianas e uma freqüência do alelo menor suficientemente elevado documentado (MAF 20%) para a identificação de heterozigotos suficientes para poder estatístico. O SNP

rs16892766

foi a única excepção a este critério, pois tem um MAF documentado de 7%.

rs4925386

foi eliminado pós-genotipagem da amostra original definido devido a uma taxa de insucesso superior a 15%.

Quantitative Genotipagem

primers multiplexado para amplificação por PCR e reações de extensão de base única alelo-específicos foram projetados usando o software Sequenom® MassARRAY Ensaio projeto 3.1 e estão disponíveis mediante solicitação. Massa genotipagem baseada em espectrometria de 20 ng emparelhado tumor e DNA normal foi realizada usando Sequenom® MassARRAY Iplex ouro (Sequenom Inc., San Diego, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Cada placa Sequenom® 384 poços incluiu quatro controles negativos modelo (DH

2O), duas amostras testadas em duplicado, e quatro DNAs de controlo positivo.

Verificação de Técnica Genotipagem

Para validar o uso de Sequenom® genotipagem quantitativo para a sua sensibilidade para a identificação de desequilíbrio alélico, geramos naturais N-rácios de transformação logarítmica (N-ratio = normal área do pico alelo 1 /normal, área do pico alelo 2) para as misturas de ADN de amostras de DNA homozigotos conhecidos representando 0, 20, 40, 50 contribuições, 60, 80 e 100% alélicas. Nós não têm DNAs homozigotos apropriadas para três dos SNPs assim que estes não foram avaliados. A maioria de declives e R-valores para estes eram muito perto de curvas padrão para “dados perfeita”, sugerindo um elevado grau de sensibilidade para o nosso método de detectar desvios alélicas de 50% (Figura S1).

Análise de desequilíbrio

o software Sequenom® MassARRAY Iplex quantifica a área sob cada um dos picos de alelos e atribui qualquer uma chamada heterozigótica ou homozigótica para o SNP calculando a razão das áreas dos picos relativos aos dois alelos. Conforme descrito anteriormente [7], para todos os SNPs testados marcámos desequilíbrio alélico preferencial pelo cálculo do R-ratio para cada par de DNA. Definiu-se o R-razão como a razão entre as duas áreas de alelo de pico no ADN normal, dividida pela razão das duas áreas alelo de pico no ADN do tumor emparelhados (R-rácio = Normal

(alelo 1 /alelo 2) /Tumor

(alelo 1 /alelo 2)). As amostras foram classificadas como tendo desequilíbrio, definida como a perda de qualquer um do primeiro ou segundo alelo na amostra do tumor, se o R-razão era maior do que 1,5 ou menos do que 0,67, respectivamente. Os limiares de R-razão usada para determinar desequilíbrio foram descritos anteriormente [33], [34]. Um teste de qui-quadrado (df = 1) foi utilizado para avaliar os desequilíbrios observados para desvio estatisticamente significativa relativamente ao esperado 50:50 distribuição de desequilíbrios de alelos. Nos casos em que um tumor era heterozigótica para um SNP por genotipagem, mas a amostra normal emparelhado falhou ao genótipo, uma média dos dois alelos normais para amostras normais heterozigotos em que SNP foi usado no lugar da amostra normal não conseguiu calcular uma R- proporção. SNPs com valor de p 0,10 foram considerados sugestivos de desequilíbrio alélico preferencial e, portanto, foram submetidas a testes no conjunto de amostra de validação para excluir falsos positivos. teste de Bonferroni foi utilizado para ajustar o número de testes estatísticos. Além disso a determinação qualitativa de desequilíbrio, geramos gráficos de caixas de distribuição de R-rácios para cada SNP para amostras que mostram a perda relativa de um alelo, perda relativa do alelo 2, e nenhum desequilíbrio (Figura S2). As amostras foram excluídos das parcelas se tivessem um R-razão superior a 10 ou se um R-razão não pôde ser calculado porque um dos dois alelos na amostra de tumor tinha um valor de 0.

Validação Estudos

Após a análise estatística de desequilíbrio alelo-específico no conjunto de amostras descoberta, três variantes com valores de p 0,1 (

rs16892766

,

rs6983267

e

rs7136702

) foram genotipados por Sequenom® MassARRAY Iplex ouro em um conjunto de exemplo de replicação de 296 DNAs normais /tumorais emparelhados. O mesmo protocolo genotipagem quantitativa e análises estatísticas utilizadas para o conjunto da amostra descoberta foram empregados com o conjunto de amostra de validação. correção de Bonferroni foi usada para ajustar o número de testes estatísticos (n = 3).

compilação de alelo-específico Desequilíbrio dados de estudos múltiplos

desequilíbrio alelo específico-análises foram anteriormente realizados em sete dos SNPs GWAS testados no presente estudo [19], [35]. Estes estudos empregada medição manual dos picos do cromatograma de sequenciamento para tumorais e normais DNAs para calcular R rácios. Ambos os estudos publicados utilizados valores de corte R-relação de 0,60 e 1,67 para a análise de desequilíbrio alelo-específico. Para ambos os estudos publicados anteriormente, o ADN do tumor foi isolado a partir de tumores do cólon congelados frescos, e o sangue foi usado como a fonte de DNA normais [19], [35]. A fim de testar as sete variantes que se sobrepunham com o nosso estudo, nós combinamos os dados dos estudos publicados com nossos resultados desequilíbrio específicos de alelo para

rs6983267

,

rs961253

,

rs3802842

,

rs10411210

,

rs4444235

,

rs4779584

, e

rs9929218

. Nós combinamos nossos números de perdas alélicas relativos com os números dos estudos publicados e realizou um teste do qui-quadrado com correção de Bonferroni (n = 7) para determinar a significância estatística dos desequilíbrios combinados.

Análise de Correlação de Allelic desequilíbrios e idade, sexo, e tumor Stage

para cada SNP avaliadas com sucesso para o desequilíbrio de alelos, foi investigada a associação entre a presença de desequilíbrio alélicas e idade do diagnóstico, sexo e estágio do tumor do paciente. teste estatístico Qui-quadrado foi utilizado para detectar associação entre o desequilíbrio alélicas e sexo. teste estatístico exato de Fisher foi utilizado para detectar associação entre o desequilíbrio alélicas e estágio do tumor. Para o estágio do tumor, classificamos tumores como TNM fase I-IV de acordo com tamanho disponíveis tumor, propagação nodal, e informações de metástase. A amostra de t-teste foi utilizado para comparar a idade média dos pacientes cujos tumores mostrou desequilíbrio alélico ao dos pacientes cujos tumores mantida heterozigosidade. Correlações com valores de p 0,05 corrigidos foram consideradas estatisticamente significativa

Resultados

Descoberta Set Genotipagem

Para determinar se qualquer um dos 17 SNPs CRC-associados mostram evidências de alelo. desequilíbrio -específica, que lhes genotipados em 194 pares de ADN normal /tumor. Todos menos um SNP,

rs4925386

, foram genotipados com sucesso em mais de 85% das amostras no conjunto de descoberta. Devido a uma elevada taxa de falhas de genotipagem (24%),

rs4925386

foi excluído de análises posteriores. O número de ADN normais heterozigotos identificados para cada SNP (para o qual o ADN do tumor também foi emparelhado genotipados com sucesso) variou de 27 a 84 das 194 amostras (14-43%; Tabela 2). A frequência da perda de alelo relativo global (para ambos de risco e não risco alelos combinados) variou de 2% para 44%. Embora nenhum dos SNPs atingiu significância estatística para o desequilíbrio específica de alelo em α = 0,05, três SNPs (

rs16892766, rs6983267, rs7136702

) mostrou uma tendência para (valores de p 0,10) específico para o alelo desequilíbrio antes correcção de Bonferroni para comparações múltiplas (n = 16). O SNP

rs6983267

apresentaram maior freqüência de perda relativa do alelo T não-risco, em comparação com o alelo de risco G. Curiosamente,

rs16892766

e

rs7136702

ambos demonstraram freqüências mais elevadas de perda relativa do alelo de risco em comparação com o alelo não-risco nos tumores conjunto descoberta. As variantes

rs16892766

,

rs6983267

e

rs7136702

foram priorizados para validação em um segundo conjunto de amostras. Além de causar qualitativamente os SNPs como mostrando desequilíbrio ou nenhum desequilíbrio, a distribuição de R-ratios de perda relativa do alelo de risco, a perda relativa do alelo não-risco e nenhum desequilíbrio foram representados graficamente como boxplots para cada SNP (figura S2) . As amostras para a qual o R-ratio foi maior do que 10 ou para o qual o R-razão não pôde ser calculado foram excluídos das parcelas.

Validação Set Genotipagem

O SNPs

rs16892766

,

rs6983267

e

rs7136702

, que todos mostraram evidência de desequilíbrio alelo-específico no conjunto de descoberta original, foram ainda testados no conjunto de amostra de validação de 296 normais /tumor pares de DNA. Tal como com o conjunto de teste, estes três SNPs genotipados com êxito em mais de 85% das amostras de validação. Com 22% de validação definido heterozigotos que mostra a perda relativa de um alelo,

rs6983267

apresentaram uma frequência de perda global relativa alelo menor do que a observada no conjunto de ensaio original (30%; Tabela 3). A menor freqüência de heterozigotos amostras no conjunto de validação mostrou relativa perda de um alelo de

rs7136702

(11%) em comparação com o conjunto de teste (23%; Tabela 3). Da mesma forma, uma menor frequência de perda alélica do

rs16892766

foi observada no conjunto de amostra de validação (16%) em comparação com o conjunto original de teste (26%; Tabela 3).

rs6983267

mais uma vez mostrou uma tendência preferencial de alelos desequilíbrio estatisticamente significativa (p = 0,06), favorecendo a perda relativa do alelo T não-risco e retenção relativo do alelo de risco G no conjunto de amostra de validação. No entanto, nem

rs7136702

nem

rs16892766

mostraram uma tendência estatisticamente significativa no sentido de desequilíbrio alélico preferencial no conjunto de amostra de validação (valores de p = 0,59 e 1,00, respectivamente).

combinada Genotipagem Resultados da detecção e validação conjuntos de amostras

Quando os genótipos de teste e conjunto de validação foram combinadas, 48 ​​de 192 amostras de heterozigotos (25%) apresentaram perda relativa de um alelo do

rs6983267

(Tabela 3). Para o SNP

rs7136702

, 31 de 208 heterozigotos combinados mostraram perda relativa de ambos os alelos (15%). Quando genótipos do conjunto de teste criado e validação foram combinados para

rs16892766

, 13 dos 65 heterozigotos (20%) apresentaram perda de alelos. Por análise agrupada

rs6983267

mostrou forte evidência estatística de desequilíbrio alélico preferencial (valor-p = 0,01). Após a correção de Bonferroni para testes de comparações múltiplas (n = 3),

rs6983267

mantido um p-valor ajustado estatisticamente significativo de 0,03. Em contraste, tanto

rs16892766

e

rs7136702

não conseguiu mostrar qualquer tendência desequilíbrio significativo alelo-específico pela análise combinada (p-valores não ajustados = 0,17 e 0,37, respectivamente).

Compilação de alélicas desequilíbrio dados de estudos múltiplos

Porque os outros têm publicado dados desequilíbrio específicos de alelo em sete variantes de nosso estudo [19], [35], decidimos realizar a análise combinada do presente estudo e os estudos publicados anteriormente para aumentar o poder de identificação de SNPs que demonstram desequilíbrio específico de alelo. Quando os desequilíbrios observados nas nossas amostras no SNPs

rs6983267

,

rs961253

,

rs3802842

,

rs10411210

,

rs4444235

,

rs4779584

, e

rs9929218

foram combinados com os publicados anteriormente [19], [35], observamos uma relativa perda muito significativa do alelo T não-risco de

rs6983267

(valor-p = 2,94 × 10

-5). Após a correção de Bonferroni (n = 7), a perda relativa preferencial do alelo T do

rs6983267

mantido um p-valor altamente significativo de 2,06 × 10

-4. Nenhuma das outras variantes mostraram evidência estatisticamente significativa de desequilíbrio alélico preferencial (Tabela 4).

Análise de Correlação de desequilíbrios alélicas e idade, sexo e estádio do tumor

Para testar se as amostras mostrando desequilíbrio alélico para o GWAS SNPs tinha características clínicas diferentes em comparação com as amostras não mostrando desequilíbrio, foi realizada uma análise de correlação de desequilíbrio com a idade, sexo e estágio do tumor usando dados do nosso conjunto de amostras descoberta. A presença de desequilíbrio alélico foi significativamente associada com o estágio do tumor para

rs719725

(p-valor não ajustado = 0,0098), e significativamente associada com a idade mais jovem para o

rs7014346

(p-valor não ajustado = 0,033) . No entanto, após o ajuste para comparações múltiplas (n = 16), não houve associação significativa entre a presença de desequilíbrio alélico e idade, sexo e estágio do tumor (ajustado p-valores 0,05). Para qualquer um dos SNPs testados

Discussão

neste estudo, nós investigamos 16 SNPs previamente associados com o risco de CRC para o desequilíbrio alelo-específico usando a plataforma de genotipagem Sequenom® MassARRAY Iplex Gold. Enquanto 15 dos 16 testados SNPs não mostraram evidências estatisticamente significativa (p 0,05) de desequilíbrio alélico preferencial no nosso conjunto de amostras descoberta, o SNP

rs6983267

demonstrado uma tendência para a perda somática estatisticamente significativa do não alelo -risco T e retenção do alelo de risco G, tanto no conjunto descoberta original e o conjunto de amostra de validação (valores de p = 0,07 e 0,06, respectivamente; Tabelas 2 e 3). Isto é consistente com os relatórios previamente publicados [19], [20]. Curiosamente, apesar de estar em alta desequilíbrio de ligação com

rs6983267

em 8q24 (D ‘= 0,99) [9], [13],

rs7014346

não mostraram evidência de desequilíbrio alélico preferencial (p- value = 0,53) no conjunto de amostras descoberta. No maior estudo anterior para avaliar o desequilíbrio alélico para

rs6983267

, 466 tumores heterozigotos de pacientes com CCR finlandeses foram avaliadas com sucesso e 101 destas amostras heterozigotos (22%) mostraram desequilíbrio alélico [19]. Entre estes 101 amostras, houve um número significativamente (p-valor = 0,0007) mais tumores mostrando a perda relativa do alelo T (66% dos tumores) versus perda relativa do alelo G (34% de tumores). A partir de nossa descoberta e validação conjuntos combinados, foram avaliados tumores de indivíduos heterozigotos para o

rs6983267

variante, e 48 (25%) desses heterozigotos mostraram desequilíbrio alélico. Observou-se uma percentagem quase idêntica de tumores mostrando a perda relativa do alelo T (33 de 48; 69%) versus o alelo G (15 de 48; 31%). Este foi significativa mesmo após o ajuste para o teste de comparações múltiplas (p-valor = 0,03; Tabela 3). Assim, nossos dados suportam a observação de desequilíbrio alélico preferencial para

rs6983267

e validar o nosso método experimental. Por outro lado, quando combinada com os nossos dados o de Tuupanen et ai. [19], observou-se uma perda relativa altamente significativa do alelo T e o ganho relativo do alelo G que resistiram a múltiplos testes de comparações (p-valor = 2,06 × 10

-4; Tabela 4). Mais importante, a descoberta de que o alelo de risco G podem ser selectivamente retidas ou adquirida em tumores colorrectais é consistente com um estudo que demonstra que o alelo G de

rs6983267

demonstra aumento da ligação do factor de transcrição de Wnt-regulada TCF4, talvez levando para o aumento da capacidade de resposta à sinalização Wnt em indivíduos portadores do alelo de risco G [20]. Além disso, estes dados confirmam que o desequilíbrio alelo-específico ocorre para CRC susceptibilidade loci, embora com uma frequência baixa.

Em outro estudo recente, o desequilíbrio alélico somática foi investigado em sete susceptibilidade loci de baixa penetrância CRC [35] . Os SNPs-tagging loci

rs4779584

,

rs3802842

,

rs4444235

,

rs9929218

,

rs10411210

, e

rs961253

que foram genotipados em nosso estudo estavam entre as sete variantes testadas para o desequilíbrio específico alelo no estudo de Niittymäki et al. [35]. Enquanto nenhum desses SNPs mostraram evidência de desequilíbrio alélico preferencial na análise combinada com os nossos dados, um desses SNPs (

rs961253

) demonstraram tendências de desequilíbrio alélico semelhantes aos observados em nosso conjunto de amostras descoberta, com o

rs961253

mostrando perda relativa mais frequente do alelo a em ambos os estudos (Tabela 4). Taxas de heterozigosidade e desequilíbrio foram muito semelhantes entre os dois estudos com exceção de nosso estudo que mostra um maior grau de desequilíbrio alélico para

rs4779584

.A análise combinada de nossos dados e os dados do Niittymäki et al. [35] para as seis variantes em comum não revelou quaisquer SNPs com evidência de desequilíbrio alelo-específico. A ressalva a combinação de dados de estudo com que a partir de conjuntos de dados publicados é que a percentagem de células tumorais nas amostras, bem como métodos de genotipagem e cortes de R de valor para determinar o equilíbrio alélico diferem entre os estudos. No entanto, o nosso estudo reproduz a constatação de que esses seis SNPs-tagging loci não mostram nenhuma evidência de desequilíbrio alélico preferencial em populações de estudo predominantemente caucasianos.

Apesar de apenas um dos SNPs testados no presente estudo mostrou uma forte evidência de alelos preferencial desequilíbrio, do outro SNPs podem desempenhar um papel na predisposição para a linha germinal CRC independente de eventos somáticas no tumor. Tem sido proposto que estes SNPs influenciar o desenvolvimento de neoplasias, mas não afectam a subsequente progressão neoplásica somática [35]. Os SNPs funcionais no loci GWAS identificados podem influenciar o desenvolvimento neoplásico, modificando a expressão do gene, metilação, ou padrões de splicing de tal maneira que não é necessária selecção ao nível do DNA durante a tumorigénese. Estes SNPs podem também ter impacto células não tumorais, como as células do estroma ou imunes para modificar o risco de cancro, mas ser independente das próprias células cancerosas. Uma vez que o mecanismo pelo qual estas variantes agir para conferir risco é melhor compreendida, poderemos ser capazes de deduzir que as variantes são mais propensos a mostrar a seleção em tumores.

limitações inerentes à nossa concepção do estudo poderia mascarar ainda mais alelos preferencial existente seleção. Em primeiro lugar, é possível que as células normais foram isolados com células tumorais nos núcleos de tecido de tumor a partir do qual o ADN foi extraído para análise. Apesar selecção inicial de regiões de tumor que contêm 70% ou células tumorais maiores, alguma contaminação de ADN normal da amostra de ADN do tumor poderiam prejudicar a amostra no sentido de mostrar nenhum desequilíbrio. No entanto, o exame histológico das amostras de tecido deve minimizar a possibilidade de contaminação com ADN normal. Similarmente, as nossas amostras histologicamente normais de tecido do cólon FFPE pode não ser normal e podem conter mutações somáticas similares como o tumor, o que poderia resultar em um “undercalling” geral de tumores com desequilíbrio. Sempre que possível, o tecido do cólon normal foi recolhido a partir de locais distantes do tumor. Em segundo lugar, nós empregamos práticas de inclusão de dados conservadores descontando chamadas genótipo agressivas feitas pelo software Sequenom® MassARRAY Iplex e por incutir cutoffs R-proporção de 1,5 e 0,67 para a determinação de desequilíbrio alélico. Os nossos requisitos rigorosos para a inclusão de dados pode limitar a detecção alélica de desequilíbrio significativo limítrofe, particularmente em amostras de tumores que contêm células não tumorais. Além disso, se os tumores são heterogêneos para a perda de alelos que não pode detectar desequilíbrios em que a amostra. Em terceiro lugar, o nosso conjunto de amostras descoberta foi limitada a 194 pares de ADN normal /tumor e pode não ter tido poder estatístico para a detecção de selecção alélicas preferencial em loci mostrando níveis mais baixos de heterozigosidade ou aberração genômica menos frequentes. Com base em dados do rato que mostram que cerca de 40% dos loci de susceptibilidade demonstram desequilíbrio alélico preferencial [4], nós não esperamos que todos os SNPs identificados através de estudos GWA para mostrar a seleção alélicas preferencial em tumores. No entanto, nossos resultados são surpreendentes, em que apenas um SNP,

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, mostrou uma tendência para a seleção somática nos tumores de cólon. Esses resultados podem indicar diferenças entre as espécies, as diferenças entre tumores de cólon e de pele, ou pode ser o resultado das limitações do estudo discutidos.

Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a maioria das variantes identificadas como alelos de susceptibilidade cancro do cólon através de GWAS não apresentam desequilíbrio específica de alelo somática em tumores do cólon. No entanto, nossos dados confirmam os resultados anteriormente publicados mostrando desequilíbrio alelo-específico para

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. Estes resultados indicam que somática desequilíbrio alelo-específico de alelos de susceptibilidade ao câncer pode não ser um fenômeno comum em cancro do cólon, mas que por uma pequena porcentagem de locos (1 de 16, ou 6%, observada no presente estudo), a seleção somática de alelos específicos podem estar dirigindo tumorigênese.

Informações de Apoio

Figura S1. Curvas

padrão para SNPs.