Abstract
O resveratrol, um composto polifenólico que ocorre naturalmente, tem sido relatada a exercer actividade anti-cancerígena, afetando diversos alvos moleculares. Neste estudo, nós examinamos os efeitos e os mecanismos subjacentes do resveratrol em câncer gástrico. Verificou-se que o resveratrol inibiu a proliferação de células de cancro gástrico de uma forma dependente da dose. Na concentração de 25 e 50 uM, o resveratrol inibiu a viabilidade celular e diminuiu o potencial clonogénico das células cancerosas gástricas. o tratamento com resveratrol preso células gástricas cancerosas na fase G1 e levou à senescência, em vez de apoptose. Os reguladores do ciclo celular e nas vias de senescência, incluindo ciclina D1, cinase dependente de ciclina (CDK4 e 6), p21 e p16, foram desregulado por tratamento com resveratrol. Os efeitos inibitórios do resveratrol sobre o câncer gástrico também foram verificados
in vivo
utilizando um modelo de ratos de xenotransplante nu. O resveratrol (40 mg /kg /d) exercida actividades inibitórias sobre o desenvolvimento do cancro gástrico e diminuiu significativamente as fracções de células Ki67-positivas nas amostras de tumores de ratinhos nus. Após o tratamento com resveratrol, a indução da senescência e as alterações na expressão dos reguladores envolvidos nas vias do ciclo celular e senescência foram semelhantes ao que foi observado
In vitro
. No entanto, o esgotamento dos Sirtuin (Sirt) 1 reverteu os efeitos acima descritos de resveratrol tanto
in vitro
e
in vivo
. Nossos dados sugerem que o resveratrol inibe câncer gástrico em uma forma dependente da SIRT1 e fornecer provas detalhadas para a possibilidade de aplicação de resveratrol na prevenção do câncer gástrico e terapia
Citation:. Yang Q, Wang B, Zang W, X Wang , Liu Z, W Li, et ai. (2013) Resveratrol inibe o crescimento do câncer gástrico, induzindo G1 Fase Detenção e senescência em um Manner Sirt1-dependente. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627
editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, França |
Recebido: 20 Março, 2013; Aceito: 19 de junho de 2013; Publicação: 21 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81101869, 81100103, 81171536 e 81000868), o Programa de Pesquisa básica Nacional da China (973 Programa, No. 2012CB911202) e Fundação de inovação independente da Universidade de Shandong (2012TS108) .A financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
o câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no mundo. De acordo com uma estimativa global, um total de 989,600 novos casos de GC foram diagnosticados e um mínimo de 738,000 pacientes morreram desta doença em 2008, respondendo por 10% do total de mortes por câncer [1]. Embora a incidência de GC tem vindo a diminuir globalmente, continua a ser elevada nos países em desenvolvimento, especialmente na China [1], [2]. Estudos anteriores revelaram a relação íntima entre a gastrite crônica causada pelo
Helicobacter pylori
infecção eo desenvolvimento de GC [3]. Além disso, o hospedeiro genéticos, ambientais, alimentares e outros factores têm sido implicados no processo oncogénico gástrica [1]. Como ainda é difícil fazer um diagnóstico precoce para a GC, a maioria dos pacientes são diagnosticados em estágios avançados. Apesar da melhoria das terapias convencionais para GC avançado, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia, a duração ou a qualidade de vida de pacientes com GC avançado é ainda pobre [2], [4]. Por isso, é urgentemente necessária a exploração de novos medicamentos preventivos ou alvos terapêuticos da GC.
O consumo de frutas e vegetais frescos contribui para a diminuição da incidência de cancro, incluindo o GC [2], [5]. Aplicações clínicas sugerem também que algumas moléculas bioactivas dietéticas têm a capacidade de inibir várias etapas oncogénicos [5] – [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4′-trihidroxiestilbeno) é um composto de polifenóis que ocorrem naturalmente presente em quase 70 espécies de plantas, incluindo a pele das uvas vermelhas, amendoim, frutos e outros [6] – [8]. Res foi relatada pela primeira vez para exercer actividades anti-tumorais, em 1997 [8]. relatórios posteriores mostraram que Res confere efeitos inibidores sobre vários tipos de cânceres, como câncer de cólon, câncer de mama e linfoma, e afeta diversos alvos moleculares [9] – [11]. Sirtuína 1 (SIRT1), uma classe III nicotinamida adenina nucleotídeo (NAD
+) – histona deacetilase /proteína dependente, tem sido relatada a ser um alvo chave da Res em vários modelos de tumor [9], [10]. No entanto, alguns dados mostram resultados contrários sugerindo que Res exerce efeitos quimioprotectores independente de Sirt1 [11]. Os efeitos inibitórios da Res sobre GC eo mecanismo subjacente não são bem estudadas.
No presente estudo, mostramos que a Res inibiu a proliferação de células GC
in vitro
. Res tratamento induziu a paragem do ciclo celular na fase G1 e levou a senescência celular. Estes efeitos da Res foram revertidos pela depleção de SIRT1. Os inibidores actividades dependentes da SIRT1 de Res em células GC também foram verificados
in vivo
. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a Res exerce efeitos inibidores dependentes da SIRT1 no GC e sugere um papel terapêutico para Res no GC.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Todos estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Shandong University School of Medicine (No. 001 em 2011 para Aprovação Ética animal) Ética e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Linhas Celulares e Condições Cultura e Res Tratamento
linhas celulares GC Humano AGS (obtidos a partir de celular Resource Center, Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia celular da Academia chinesa de Ciências), BGC-823 e SGC-7901 (adquirido a partir do Centro China para Type Culture Collection, Wuhan, China) foram utilizados neste estudo. As células foram cultivadas em meio F12 (AGS) ou meio RPMI 1640 (BGC-823 e SGC-7901) contendo 10% de FCS, 100 unidades /ml de penicilina e 2 mmol /l de L-glutamina, a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% CO
2. Alta pureza Res foi adquirido a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA), dissolvido em DMSO e adicionado ao meio de cultura na concentração indicada. Todos os experimentos foram realizados 24 h após a suplementação Res, salvo indicação em contrário.
pequeno RNA de interferência transfecção
quimicamente modificado pequena interferência RNA (siRNA) de segmentação SIRT1 e controle siRNA foram adquiridos de GenePharma (Shanghai , China). A sequência do Sirt1 siARN foi 5′-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 ‘. As células foram incubadas durante a noite e, em seguida, transfectadas com ARNsi utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, as células foram tratadas com 50 um Res durante 24 h antes de um estudo mais aprofundado.
Ensaio de viabilidade celular
A proliferação foi avaliada utilizando o Cell Titer 96 Aqueous One Solution ® Ensaio de Proliferação celular (Promega, Madison, WI, EUA). Resumidamente, 2 × 10
3 células foram semeadas numa placa de 96 poços e deixou-se crescer durante 24 h. Vinte e quatro horas mais tarde, 20 ul de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxi-metoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) foi adicionado a cada bem. Após incubação durante 3 h a 37 ° C, a absorvância a 490 nm foi registada num leitor de Multiplate Varioskan flash (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). A viabilidade celular foi calculada pela seguinte fórmula: viabilidade celular relativa = (absorvância média do grupo tratado – absorvância média de espaço em branco) /(absorvância média de absorvância média de controlo grupo- em branco). Os ensaios foram realizados em triplicado e repetidas três vezes.
Ensaio de formação de colónias
As células foram semeadas em placas de 6 poços (300 ou 500 células por poço) e incubou-se durante 10 dias até as colónias eram suficientemente grande para ser claramente discernida. As células foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal, e o número de colónias com mais de 50 células foram contadas manualmente. As experiências foi realizada em triplicado e repetidas três vezes.
Análise do Ciclo Celular
As células foram colhidas, fixadas com pré-arrefecida de etanol a 70% a 4 ° C durante a noite e, em seguida, coradas com iodeto de propídio (Beyotime , Jiangsu, China) contendo ARNase a a 37 ° C durante 30 min no escuro. A distribuição do ciclo celular foi determinada utilizando um citómetro de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e os dados foram analisados com o software Multicycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, EUA). As experiências foram realizadas três vezes, independentemente.
Ensaio de Apoptose
detecção e quantificação de apoptose foram efectuados por marcação das quebras da cadeia de ADN, utilizando uma In Situ Cell Death Detection Kit, TMR vermelho (Roche Applied Science, Basileia, Suíça). As células ou secções de parafina de xenoenxertos foram marcadas com TUNEL de acordo com as instruções do fabricante. Para as células, o tratamento com 0,2 mM de H
2O
2 durante 12 h serviu como o controlo positivo. Para as secções de parafina, os controlos positivos foram adquiridos a Millipore (Billerica, MA, EUA). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (Beyotime) e as lâminas ou secções foram fotografadas por microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão) usando o software cellSens dimensão. As experiências foram realizadas três vezes, independentemente.
β-Galactosidase A coloração
senescência foi avaliada utilizando um senescência β-Galactosidase A coloração Kit (Beyotime). Resumidamente, as células ou secções congeladas de xenoenxertos foram fixadas e, em seguida, incubadas com recentemente preparada β-galactosidase (β-Gal) de solução de coloração a 37 ° C durante a noite. Os experimentos foram realizados de forma independente por três vezes.
estáveis Hairpin RNA (shRNA) Células GC lentivirais de curto
lentivirais contendo controle ou Sirt1 shRNA foram construídos por GenePharma e usados para transfectar células BGC-823. knockdown eficiente da Sirt1 foi verificada por transferência de western. Para a transdução estável, controlo por lentivírus-infectado ou Sirt1 shRNA-lentivírus-infectados BGC-823 células foram cultivadas em meio completo fornecido com 2? G /puromicina ml durante quatro semanas e considerado como LV-C e LV-S, respectivamente.
ratos Nude Xenoenxerto Modelo
/c ratos fêmea atímicos BALB nu (6~8 semanas) foram adquiridos a partir da Universidade de Pequim (Beijing, China) e foram mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos no Key laboratório de Cardiovascular remodelação e Pesquisa Function, hospital Qilu, Universidade de Shandong. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (8 ratos para cada grupo): Grupo I e II, as células BGC-823 (1 × 10
6 células por injecção em 0,1 ml de PBS) foram injectadas subcutaneamente na região do flanco do ratinhos nus; grupo III, LV-C (BGC-823 células) foram injectados; e grupo IV, LV-S (células BGC-823) foi injectada. Após a implantação, os ratos nu de grupos II, III e IV foram tratados com Res (40 mg kg
-1 em 0,1 ml de óleo vegetal, administrados por sonda esofágica, uma vez por dia). O tamanho do tumor subcutâneo foi medido com um compasso de calibre, e os volumes dos tumores foram calculados pela fórmula (comprimento) x (largura
2) /2. Os murganhos foram sacrificados quatro semanas mais tarde. Os tumores foram colhidos e processados para análise por Western blot e de imunoquímica.
Tempo real-quantitativa por PCR (RT-QPCR)
O RNA total nas células foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) e convertida em ADNc utilizando o kit de reagente PrimeScript ™ RT (Takara, Tóquio, Japão). RT-QPCR foi realizada para os genes, incluindo ciclina D1, cinase dependente da ciclina 4 (CDK4), p21 e β-actina como previamente descrito [12]. As sequências dos iniciadores de amplificação está listado na Tabela S1. A expressão de mRNA de ciclina D1, CDK4 e p21 foi normalizada para p-actina em relação ao controlo usando o 2
-ΔΔCt método. Cada experiência foi repetida em triplicado.
Western Blot
A proteína total a partir das células ou as amostras de tumor foi extraída com tampão de lise RIPA (Beyotime) como descrito [12]. A concentração de proteína foi determinada utilizando o Kit de Ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). A membrana foi sondada com anticorpos contra Sirt1 (Abcam, Cambridge, MA, EUA), Bcl-2, Bax, caspases-3, ciclina D1, CDK4 e 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), p16 e p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo secundário utilizado foi uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-coelho ou de anticorpo de ratinho. As bandas de proteína foram visualizadas usando um sistema ECL (Pierce). β-actina (Cell Signaling) serviu como um controlo de carga.
A imuno-histoquímica
Os espécimes de tumor de ratinhos nus foram desparafinizadas, reidratadas e antigénio recuperado. As secções foram incubadas com um anticorpo contra Ki67 (1:500, Abcam) durante a noite a 4 ° C. Anti-IgG de coelho conjugado com HRP e coloração DAB foram utilizadas para visualizar o anticorpo Ki67. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, finalmente. As lâminas foram fotografadas por um microscópio óptico Olympus (Tóquio, Japão) usando o software cellSens dimensão. As células Ki67-positivas foram contadas manualmente e a percentagem de células Ki67-positivas foram avaliadas por campos. Cinco campos separados foram contados para cada seção.
Análises Estatísticas
Os dados foram expressos como a média ± SD. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, versão 16.0, Chicago, IL, EUA), one-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey. Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
Res Inibe a viabilidade das células GC em um dependente de Sirt1 Manner
Três linhas de células GC (AGS, BGC-823 e SGC-7901) foram examinados em nossos experimentos. A cultura das células em veículo (0,1% de DMSO) não afectou a viabilidade das células (dados não apresentados). No entanto, quando tratados com diferentes concentrações de res durante 24 h, a proliferação celular foi inibida dependentemente da dose a 25, 50, 100 e 200 um Res (Figura 1A). De nota, proliferação de AGS foi obviamente inibida quando tratados com 10 uM Res, que não foi observado nas outras duas linhas celulares (Figura 1A). Em todas as três linhas de células, a presença de 100 uM Res foi suficiente para induzir a inibição de mais de 50% de crescimento (56,78% de AGS, 54,87% para BGC-823 e 52,16% para a SGC-7901, respectivamente). Portanto, 25 e 50 um Res foram utilizados para experiências posteriores. Para determinar o papel funcional da SIRT1 no tratamento Res, nós derrubado expressão Sirt1 usando uma siRNA específico. A inibição eficaz da expressão Sirt1 foi verificada por Western blot (Figura 1B). Os resultados do ensaio de MTS mostraram que em células Sirt1-empobrecido, Res não inibiu a proliferação das células (Figura 1C). Estes dados indicam que Res é capaz de inibir a proliferação de células de GC e que o efeito inibitório pode ser resgatado por depleção Sirt1.
células GC (A) foram tratados com ou sem Res na concentração indicada durante 24 h . A viabilidade celular foi então medido por ensaios de MTS. (B) A expressão de Sirt1 às 72 h após transfecção de controlo ou ARNsi específica foi determinada por Western blot. ‘Ci’ representa o controle siRNA, e ‘Si’ representa o Sirt1 siRNA. (C) Quarenta e oito horas após o siARN transfecção, as células foram tratadas com GC 50 um Res durante 24 h. Em seguida, foram realizados os ensaios MTS. Os dados representam a média ± SD, * representa P 0,05, ** representa P 0,01 e *** representa P . 0.001
Res diminui o potencial clonogênica de células GC em um Sirt1- modo dependente
para as células tumorais, a formação de colónias foi encontrado para ser um parâmetro mais sensível do que a viabilidade para avaliar o efeito de um fármaco. Assim, os esforços foram então realizados para determinar o efeito da Res sobre o potencial clonogénico das células GC. Res, na concentração de 25 uM, levou a uma redução significativa no número de focos bem como os tamanhos das células de GC. Após o tratamento com 50 uM Res, o potencial clonogénico diminuído ainda mais. No entanto, knockdown de Sirt1 antes do tratamento Res aumentou o número de focos para um nível comparável ao do grupo de veículo (Figura 2).
A colónia experiências de formação foram realizados em triplicado e repetidas três vezes. Os gráficos representativos são mostrados em (A). A análise quantitativa é demonstrada como um histograma em (B). ‘Ci’ representa o controle siRNA, e ‘Si’ representa o Sirt1 siRNA. Os dados representam a média ± DP, os resultados estatísticos estão indicados por asteriscos e *** representa P . 0,001
Res induz a acumulação de células de GC na fase G1 em uma maneira dependente da Sirt1
Para examinar o efeito inibidor da Res em células de GC, foi realizada a análise do ciclo celular. Observou-se que 25 e 50 um Res aumentou a proporção de células em fase G1 em ambos BGC-823 e células SGC-7901 (Figuras 3A e 3B). A indução da prisão fase G1 pela Res também foi dependente da dose. Res a uma concentração de 50 pM mostrou um efeito mais forte do que o fez a 25 uM. O aumento do número de células na fase G1 foi acompanhada por uma diminuição nas populações de células, principalmente nas fases S. A depleção de Sirt1 antes do tratamento Res diminuiu a indução de fase G1 Res (Figuras 3A e 3B). Para confirmar os resultados anteriores, foi examinada a expressão de reguladores do ciclo celular da fase G1, incluindo ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 e p16 em células BGC-823. Como mostrado na Figura 3C, em Res-tratados células BGC-823, os níveis de proteína de activadores do G1 /transição S (ciclina D1, CDK4 e CDK6) diminuída, enquanto que os níveis de proteína de inibidores de CDK (CDKIs) (p21 e p16) aumentou. Por outro lado, estas alterações não foram encontrados em células BGC-823 Sirt1-esgotados quando eles foram tratados com 50 mm Res. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de RT-QPCR de ciclina D1, CDK4 e p21 (Figura 3D).
A distribuição do ciclo celular das células foi analisada por citometria de fluxo. Os gráficos representativos são mostrados em (A). A análise quantitativa é demonstrada como histogramas em (B). (C) Os níveis de proteína de reguladores do ciclo celular foram detectados por Western blot. (D) Os níveis de ARNm de reguladores do ciclo celular foram detectados por RT-QPCR. ‘Con’ representa um tratamento veículo, ‘R’ representa resveratrol, ‘Ci’ representa o controle siRNA, e ‘Si’ representa o Sirt1 siRNA. Os dados representam a média ± DP, * representa a P 0,05 e *** representa P . 0,001
A falta de células sub-G1 indicaram que o tratamento não Res desencadear a apoptose nas células GC (Figura 3A), o que foi consistente com os resultados de experiências de marcação TUNEL de células BGC-823 (Figura S1A). Os níveis de proteína de moléculas relacionadas com a apoptose, tais como Bcl-2, Bax e caspase-3, a partir de cada grupo foram comparáveis (Figura S1B). Tomados em conjunto, os nossos resultados mostram que induz a paragem do Res fase G1 em células de GC num modo dependente da Sirt1 e não induz a apoptose.
Res Induz a senescência das células GC num modo dependente da Sirt1
em nossas mãos, Res resulta em parada de crescimento, em vez de aumento da apoptose. Portanto, fizemos mais esforços para explorar se Res poderia induzir a senescência em células GC. coloração de p-gal, um marcador específico para células senescentes de mamífero, foi usado. Após o tratamento Res, encontramos aumento das frações de células foram coradas com β-Gal. No entanto, o pré-tratamento com Sirt1 ARNip bloqueado senescência celular induzida Res (Figura 4). Resultados semelhantes foram obtidos a partir de ambos BGC-823 e células SGC-7901, o que sugere que dependentes Res no Sirt1 para induzir a senescência celular em células de GC. coloração
β-Gal foi realizada para detectar células senescentes. Os gráficos representativos são mostrados em (A). Ampliação: 200 x, bar para 100 um. A análise quantitativa é demonstrada como um histograma em (B). ‘Ci’ representa o controle siRNA e ‘Si’ representa o Sirt1 siRNA. Os dados representam a média ± DP, os resultados estatísticos estão indicados por asteriscos e *** representa P . 0,001
Res inibe o crescimento tumoral in vivo de um modo dependente-Sirt1
em seguida, foram realizados estudos adicionais para determinar os efeitos da sobre Res BGC-823 crescimento de xenoenxertos em ratinhos nus. Para o
in vivo
estudo, foram utilizadas células lentiviral-shRNA BGC-823 transduzidas estáveis. Dos quatro SIRT1 shRNA-lentivírus, LV-1 e LV-4 exerceu efeitos de silenciamento óbvios na expressão Sirt1 (Figura S2). Depois de quatro semanas de rastreio, a expressão de Sirt1 foi mantida a diminuição dos níveis nas células de lentivírus shRNA-BGC-823 estáveis (Figura S2). LV-1-lentivírus shRNA células estáveis BGC-823 foram utilizados em estudos xenoenxertos subsequentes causa dos efeitos inibidores mais fortes de expressão Sirt1 em comparação com o LV-4. Todos os animais sobreviveram até ao fim das nossas experiências, e nenhuma diferença óbvia foi encontrado no seu peso corporal (dados não mostrados). Quatro semanas após a implantação, as medições dos volumes do tumor indicaram que o tratamento Res reduziu significativamente o crescimento de BGC-823 xenoenxertos (Res vs controlo: 0.5728 ± 0,2276 centímetros
3 vs. 1.4288 ± 0,1741 centímetros
3, P 0,001) . transdução estável do controle shRNA-lentivírus não afetou significativamente o volume do tumor (Res vs Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 cm
3 contra 0,68 ± 0,0672 cm
3, P = 0,603). No entanto, nos xenoenxertos Sirt1-esgotados, os efeitos inibitórios da Res no crescimento do tumor foram resgatados (Res + Si vs Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 cm
3 vs 0,68 ± 0,0672 cm
3, P 0,001, Res + Si vs controle: 1.2313 ± 0,1777 cm
3 contra 1,4288 ± 0,1741 cm
3, P = 0,123) (Figura 5A). Nos xenoenxertos tratados com Res, o marcador de proliferação, Ki67, diminuiu significativamente (Figura 5B) (% de células Ki67-positivas, Res vs controlo: 3 ± 1,8 vs 44,67 ± 3,79, P 0,001). A senescência foi observada em xenoenxertos de ratinhos tratados com Res indicados por β-Gal coloração (Figura 5B). No entanto, não apoptose óbvia foi induzida pela Res nos xenoenxertos (Figura s1d) e não foram observadas alterações nos reguladores de apoptose, tais como Bcl-2, Bax e caspase-3 (Figura S1C). Estes resultados foram consistentes com os
in vitro
experimentos. Além disso, as mudanças na expressão dos reguladores do ciclo celular, incluindo ciclina D1, CDK4, CDK6, p21 e p16 foram semelhantes ao que observamos
in vitro
(Figura 5C). Todas as mudanças observadas no Ki67, β-Gal e os reguladores do ciclo celular foram anuladas por Sirt1 esgotamento (Figuras 5B e C) (% de células Ki67-positivas, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, P 0,001, Res + Si vs controle: 46,32 ± 6,03 vs 44,67 ± 3,79, P = 0,946)
() camundongos nus a foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e havia 8 ratos para cada grupo.. Células BGC-823 (1 × 10
6) com diferentes tratamentos foram injectadas subcutaneamente em cada grupo. Após a implantação, o tamanho do tumor foi medido semanalmente. Os volumes tumorais foram calculados pela fórmula (comprimento) x (largura
2) /2. (B) As células proliferam nos espécimes de tumor dos diferentes grupos foram detectados por imunoquímica Ki67. A senescência foi indicada por uma coloração β-Gal. Os gráficos representativos são mostrados. Ampliação: × 400, bar para 20 mm. (C) proteína total das amostras tumorais foi extraída, e a expressão dos reguladores do ciclo celular foram detectados por Western blot. ‘C’ representa o controle, ‘R’ representa resveratrol, ‘Ci’ representa o controle estável lentiviral-shRNA células BGC-823, e ‘Si’ representa os BGC-823 células estáveis Sirt1 lentiviral-shRNA.
Discussão
Res, um polifenol natural, está actualmente a ser avaliado como um agente anticancerígeno promissor. Embora tenha sido comprovado para conferir efeitos anti-proliferativos contra vários tipos de cancro tanto em cultura de células e modelos de xenoenxerto [9] – [11], os seus efeitos quimiopreventivos em GC e o mecanismo subjacente não ter sido bem estudado. Neste estudo, foi demonstrado que Res inibiu a proliferação de linhas de células de GC (AGS, BGC-823 e SGC-7901). A actividade anti-crescimento foi observado após as células foram tratadas com 25 um Res durante 24 h, e o efeito inibidor foi dependente da dose. A uma concentração de 50 uM Res, os rácios de inibição para estas três linhas de células foram de 41%, 34% e 32%, respectivamente. Quando a concentração da Res aumentou ainda mais, foram reforçados os efeitos inibidores. Ambos os 100 e 200 um Res inibiu o crescimento de mais de 50% em comparação com o grupo de veículo. Além disso, a dose mais elevada de Res é grande demais para alcançar
in vivo
e, portanto, não faz sentido em um ambiente clínico [13], [14]. Portanto, as duas mais baixas concentrações eficazes de 25 e 50 um Res foram utilizados nos estudos subsequentes. A actividade de inibição de crescimento da Res parece ser específico para a célula, como o IC50 difere de acordo com o tipo de célula e varia de 27 uM a 180 uM [9], [10], [15], [16]. Alguns destes estudos mostraram também que a Res exerce os efeitos inibidores de um modo dependente do tempo [15], [16]. A concentração e duração do tratamento Res utilizado em nosso estudo foram consistentes com a maioria dos relatos de outros grupos [8], [9], [16]. Para o
In vivo
estudo, o método de administração que é utilizada gavagem porque este é o método que é comumente utilizado em murganhos como uma alternativa à injecção intraperitoneal [15], [17]. Além disso, estudos em ratos revelaram que a Res é absorvido eficientemente após a administração oral e podem ser encontrados em todo o corpo [17], [18]. Quando usado
in vivo
, Res diminuiu significativamente a proliferação de células como caracterizada pela expressão Ki67, o que é consistente com os resultados de nossos
in vitro
experimentos.
Res pode abrandar a proliferação das células cancerosas através de diversos mecanismos, entre os quais, regulação do ciclo celular é um passo importante [9], [15], [19]. Nosso
in vitro
dados demonstraram que o tratamento de células GC com Res induz prisão fase G1. A fase G1 é a primeira das quatro fases do ciclo celular que ocorre na divisão celular eucariótica. G1 é uma fase importante do ciclo celular em particular, porque é o ponto no qual uma célula compromete-se a um ciclo de divisão. Progressão através fase G1 exige a formação e ação de ciclina D-CDK4 ou -CDK6 complexos. Estes complexos então fosforilar o retinoblastoma, o que leva à libertação dos factores de transcrição E2F e a transcrição de genes a jusante envolvidos na progressão da fase S. As atividades dos complexos D-CDK ciclina são regulados por inibidores a montante, incluindo os membros da tinta (p15, p16 e p18) e as famílias CIP (p21, p27 e p57) [20], [21]. Na mesma linha, acompanhada com a prisão fase G1, observou-se a regulação negativa da ciclina D1, CDK4 e CDK6 ea regulação positiva de p21 e p16 em células GC tratados com Res. Nosso
in vivo
resultados dos níveis destes reguladores do ciclo celular nas amostras tumorais de expressão são consistentes com o
in vitro
resultados. Os nossos resultados também são consistentes com os dos estudos anteriores [15], embora alguns outros têm relatado que a prisão da fase S é induzida pela Res [9], [19]. Persistência de paragem do crescimento pode levar à apoptose em células ou senescência. Uma vez que ambas as vias de sinalização p21 e p16 participam na progressão da senescência mediada por vários tipos de stress [22], [23], foi realizada a coloração β-Gal. Res tratamento aumentou significativamente a frequência de células senescentes GC de uma forma dependente da dose. O programa de senescência celular representa uma importante barreira contra a iniciação do câncer e desenvolvimento [24], [25]. Embora estudos anteriores mostram que, através da atenuação do estresse oxidativo e a melhoria do metabolismo, Res exerce efeitos anti-envelhecimento, tanto
in vitro
e
in vivo
[26] – [28], os efeitos opostos têm sido mostrados em cancro. Res foi encontrada para induzir a senescência inibição do crescimento semelhante em vários tipos de cancros [29], [30]. O duplo papel de Res na senescência celular, retardando o envelhecimento em tecidos normais e acelerando a senescência em tumores, o torna um candidato ideal para a prevenção e tratamento do câncer.
A apoptose é um outro efeito comum que geralmente é observado no Res-tratada células cancerosas [9], [11], [15], [16]. A evidência experimental indica que a apoptose pode ser mediada por várias vias diferentes e várias moléculas reguladoras. Entre estes reguladores, as proteínas que compreendem a família Bcl-2 é importante. Existem ambas as proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL) e proteínas pró-apoptóticas (Bax, má, Bak e Bcl-xs) nesta família. Um aumento da Bcl-2 rácio Bax pró-apoptótica /anti-apoptótica aumenta a permeabilidade da membrana mitocondrial, provoca a libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citosol e, por sua vez, resulta na activação da caspase-9 e a jusante alvo da caspase-3 [31]. Apesar desta via apoptótica intrínseca, os ligandos pró-apoptóticos, como FasL, através da ligação aos seus receptores, causar a activação de caspase-8 e efectores a jusante, tais como a caspase-3. A activação de caspases efectoras induz a clivagem de diversos substratos celulares e provoca directamente a apoptose [31] – [33]. Apesar de numerosos relatórios anteriores indicaram que a apoptose foi responsável pela inibição do crescimento induzida por Res, não observamos a apoptose em células óbvio GC tratados com Res. Esta ausência de apoptose pode ser devido à concentração e duração do tratamento Res adaptado na nossa experiência, porque os estudos de diferentes grupos Res mostram que exerce efeitos e dosagem e dependente da duração [34], [35]. Em adição, como os efeitos de res são também especifica para a célula [36] – [38], as células GC utilizados no nosso estudo podem ser resistentes a apoptose induzida por Res
Res tem múltiplos alvos.; entre os quais, a classe III NAD
+ – dependente deacetilase SIRT1 é o mais estudado. Embora um estudo bioquímico indicou que Res não foi um activador directo de Sirt1 [39], Res ainda tem sido considerada como um agonista clássico de Sirt1. Numerosos estudos demonstram que os ER exerce efeitos diversos em diferentes modelos de um modo dependente-Sirt1 [40], [41]. Em nosso experimento, Sirt1-esgotamento reverteu a inibição do crescimento da Res ambos
in vitro
e
in vivo
. A prisão fase G1 e senescência induzida pelo tratamento Res foram resgatados por Sirt1-esgotamento. Estes resultados indicam que os efeitos de inibição da Res em CG são dependentes Sirt1. De acordo com os estudos anteriores, Sirt1 pode regular a expressão génica através de dois mecanismos diferentes. Em primeiro lugar, directamente, Sirt1 medeia directamente a desacetilação de uma proteína e, em seguida, aumenta a sua ubiquitinação e subsequente degradação de proteassoma ubiquitina [42].