Abstract

Fundo

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a quinta neoplasia mais comum ea terceira causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Sorafenib é o único medicamento para pacientes com carcinoma hepatocelular em estádio avançado (HCC), que tem sido demonstrado que confere uma vantagem de sobrevivência para os pacientes com carcinoma hepatocelular; No entanto, tem muitos efeitos colaterais. Assim, as estratégias terapêuticas alternativas com maior segurança e eficácia terapêutica para a gestão do HCC devem ser desenvolvidos.

métodos e resultados

Nós demonstramos que um extrato de

Graptopetalum paraguayense

( GP) regulada negativamente os níveis de vários onco-proteínas, incluindo AURKA, AURKB, e FLJ10540 expressão, em células de carcinoma hepatocelular. Para isolar os componentes activos nos extractos GP, preparámos extractos e fracções avaliaram os seus efeitos sobre a expressão de onco-proteínas em células de carcinoma hepatocelular. A fracção designada HH-F3 foi enriquecida em ingredientes activos, exibiu efeitos citotóxicos, e suprimiu a expressão dos onco-proteínas em células de carcinoma hepatocelular. A estrutura do composto activo principal em HH-F3 verificou-se ser semelhante à dos compostos de proantocianidinas derivadas de

Rhodiola rósea

. Além disso, um novo composto distinta rica em 3, 4, porções benzílicos 5-tri-hidroxi foi identificado nas preparações HH-F3. Estudos mecanísticos indicou que HH-F3 apoptose induzida em células de carcinoma hepatocelular, promovendo a perda de potencial de membrana mitocondrial e à produção de espécies reactivas de oxigénio. HH-F3 também aumentou a expressão de PTEN e diminuiu a fosforilação de AKT Ser473 no de uma forma dependente da concentração, em células de carcinoma hepatocelular. Além disso combinação de GP ou HH-F3 e sorafenib sinergicamente inibe a proliferação de células Huh7. O tratamento de um modelo de rato com dietilnitrosamina (DEN) induzida por câncer de fígado com extratos de GP e HH-F3 reduziu os teores de colágeno hepáticas e inibiu o crescimento tumoral.

Conclusões

Estes resultados indicam que GP extratos e HH-F3 pode proteger o fígado por suprimir o crescimento do tumor; Consequentemente, estes compostos podem ser considerados para o tratamento de HCC

citação:. Hsu W-H, Chang, C-C, Huang K-W, Chen Y-C, Hsu S-G, Wu L-C, et ai. (2015) Avaliação da erva medicinal

Graptopetalum paraguayense

como um tratamento para o cancro do fígado. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10.1371 /journal.pone.0121298

Editor do Academic: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, TAIWAN

Recebido: 19 Agosto, 2014; Aceito: 29 de janeiro de 2015; Publicação: 07 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Hsu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Ciência Taiwan sob os números de concessão NSC102-2627-B-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001-, e MOST103-2627-B-030-001-; o Ministério dos Assuntos Económicos de Taiwan conceder números 99-CE-17-A-S1-152, 100-EC-17-A-S1-152, e 101-EC-17-A-S1-152); e por uma concessão do Ministério da Educação, o objectivo para o Plano Universidade Top (103AC-T503). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o alcoolismo, hepatite viral e esteatohepatite não-alcoólica são as três principais causas de inflamação crónica do fígado e lesões. inflamação crónica do fígado pode conduzir a fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC), que é a forma mais comum de cancro do fígado e é responsável por 70% a 85% das neoplasias malignas hepáticas primárias em adultos. Mais de 80% dos pacientes com carcinoma hepatocelular são diagnosticados numa fase avançada da doença em que o tratamento cirúrgico não é indicado. Em geral, os pacientes com HCC irressecável têm um mau prognóstico e raramente se beneficiar de tratamentos não cirúrgicos, como a quimioterapia sistemática ou quimioembolização [1, 2].

sinalização anormal no PI3K /PTEN /AKT contribui para o desenvolvimento de uma variedade de doenças hepáticas, incluindo a doença não alcoólica do fígado gordo (esteatose hepática), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática alcoólica (ALD), hepatite viral e HCC [3]. A via PI3K /PTEN /AKT é activado pela supressão epigenética de PTEN e /ou mutações em ou amplificação dos componentes individuais da via em aproximadamente 40-50% dos pacientes com carcinoma hepatocelular [4-6]. Experimentalmente, a supressão de PTEN ou a sobre-expressão de AKT nos fígados dos ratos resultados na esteatose e o desenvolvimento do tumor [7, 8]. Estas observações experimentais sugerem fortemente que a via PI3K /PTEN /Akt desempenha um papel importante na hepatotumorigenesis.

sorafenib, um inibidor de cinase de multi-alvo que foi aprovado para o tratamento de HCC em 2007 [9], é a quimioterápico único padrão para pacientes com HCC em estágio avançado [10]. Esta droga demonstrou inibir a proliferação de células de tumor, bloqueando a /Raf via de Ras /MAPK, e angiogénese, bloqueando tanto VEGFR e sinalização PDGFR, retardando assim o crescimento de novos vasos sanguíneos dentro do tumor [11]. Em um estudo duplo-cego, ensaio clínico controlado randomizado (RCT) com um endpoint primário de sobrevivência geral [12], sorafenib aumentou o tempo de sobrevivência de pacientes com HCC de 7,9 para 10,7 meses [13]. Sorafenib é a única droga que tem sido demonstrado que confere uma vantagem de sobrevivência para os pacientes com carcinoma hepatocelular; No entanto, tem muitos efeitos colaterais. Atualmente, as opções de tratamento para pacientes com HCC avançado são limitadas. Assim, as estratégias terapêuticas alternativas com maior segurança e eficácia terapêutica para a gestão do HCC devem ser desenvolvidos.

Plantas medicinais têm sido usadas há milhares de anos para tratar uma ampla gama de doenças, incluindo doenças inflamatórias e doenças crônicas do fígado (incluindo a hepatite, a fibrose hepática e carcinoma hepatocelular). Neste estudo, nós nos concentramos em

Graptopetalum paraguayense

(GP), uma erva tradicional chinesa que possui vários benefícios à saúde. De acordo com a sua prescrição chinês arcaico, GP é capaz de aliviar distúrbios hepáticos, pressão arterial mais baixa, branquear a pele, aliviar a dor, o tratamento de infecções, inibir a inflamação e melhorar a função cerebral [14-16].

In vitro

estudos têm demonstrado que os extractos de folhas de inibir a tirosinase e GP enzima conversora de angiotensina e de eliminar os radicais livres [14-16]. Extractos da haste de GP cultivadas com células da linha celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 também têm mostrado exibir propriedades antioxidantes e anti-proliferativas [17]. extractos à base de água de GP também têm demonstrado ter antioxidantes e anti-inflamatórios propriedades que protegem as células de danos no fígado CCl oxidativo

4 induzida por [18]. Dados do nosso estudo microarray perfil anterior mostrou que a expressão de vários genes relacionados com o metabolismo, crescimento e /ou manutenção das células foi restaurado para níveis próximos do normal em ratos tratados com DMN tratados com GP [19]. Nosso estudo anterior também mostrou que a administração de GP mitigados lesão hepática induzida por químicos e fibrose

in vivo

e suprimiu células hepáticas estreladas (HSC) e ativação de células Kupffer

in vitro

.

Os resultados acima mencionados sugerem que GP pode representar uma opção terapêutica para tratar a inflamação hepática e fibrose [20]. Neste estudo, demonstramos que GP e sua fração HH-F3 tem efeitos anti-câncer no modelo de rato de dietilnitrosamina (DEN) induzida por câncer de fígado. Nós subsequentemente mostram que os extractos de GP e HH-F3 induzir morte celular apoptótica em células de carcinoma hepatocelular, o que sugere que GP e HH-F3 poderia ser usado para a prevenção ou tratamento da HCC.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Huh7 e PLC5 foram obtidas do Dr. Zhong-Zhe Lin, National Taiwan University Hospital, Taiwan. A linha celular HepG2 foi adquirido a partir de American Type Culture Collection (ATCC, https://www.atcc.org/en.aspx). linhas celulares Mahlavu foram fornecidos pelo Dr. Muh-Hwa Yang, do Instituto de Medicina Clínica, Universidade Nacional Yang-Ming, Taiwan. hepatócito humano foi adquirido a ScienCell Research Laboratories (https://www.sciencellonline.com/~~number=plural).

GP e

Rhodiola rosea

extração, purificação e caracterização

folhas GP foram moídos e liofilizados num pó a -20 ° C e armazenado em um inibidor de humidade a 25 ° C antes da extracção. Em primeiro lugar, 1,5 g de GP em pó foi submetida a vórtice, com 10 ml de 100% de metanol (MeOH) durante 5 min e centrifugadas a 1500

g

durante 5 min. O sobrenadante foi removido e vários extractos foram preparados por re-suspensão dos aglomerados em 10 ml de H

2O, 100% de acetona, metanol a 100%, 100% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol, com 100% de DMSO ou 30 % de DMSO. A suspensão foi agitada em vórtex durante 5 min, centrifugado duas vezes a 1500

g

durante 5 min, centrifugou-se novamente em 9300

g

durante 5 min e filtrou-se através de um filtro de 0,45 mícrons numa câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente. O sobrenadante DMSO 30% ou foi armazenado a -20 ° C como uma solução 150 mg /ml de stock (referido como 30% de DMSO extractos GP) ou fraccionada em quatro fracções (F1-F4), utilizando uma coluna de Sephadex LH-20 (GE Healthcare bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia) coluna (Método I). Para simplificar os protocolos de preparação, diálise direta dos 30% extratos DMSO GP contra água também foi realizada (Método II). ensaios colorimétricos sobre a 30% de DMSO GP extrai para a identificação de taninos hidrolizáveis ​​e condensadas foram realizadas [21]. As células de carcinoma hepatocelular foram tratados com os extractos, e os níveis de proteína AURKA, AURKB FLJ10540 e foram analisados ​​por Western blot; Foram identificadas moléculas activas na fracção F3 (referido como a fracção HH-F3). A fracção HH-F3 foi ainda analisado por HPLC com um detector de UV (Shimadzu SPD-M10A), uma coluna de HPLC de fase normal (coluna Phenomenex Luna 5u de sílica (2) 100A, 4,6 x 250 mm) e

1H- e

13C-RMN os espectros para identificar a estrutura das moléculas activas. extractos GP e a fracção HH-F3 foram também submetidos a diálise em presença de água usando uma membrana de diálise (MWCO 12-14,000) (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) para se obter compostos activos.

Rhodiola rósea

plantas foram liofilizadas num pó e armazenados em um inibidor de humidade a 25 ° C antes da extracção. Uma amostra de 1,5 g de

Rhodiola rósea

pó foi dissolvido em 10 ml de H

2O, centrifugou-se a 1500

g

durante 5 min e filtrou-se através de um filtro de 0,45 ^ M no laminar fluir capô à temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas a -20 ° C, tal como 150 mg /ml de stock soluções.

Western blot

Os lisados ​​de células de carcinoma hepatocelular foram sujeitos a SDS-PAGE para resolver as proteínas expressas e transferidas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas usando um sistema de transferência Bio-Rad. Após transferência, as membranas foram coradas com Ponceau S para confirmar a eficiência e uniformidade da transferência de proteína. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado sem gordura a 5% à temperatura ambiente durante 30 minutos e incubadas com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. Subsequentemente, as membranas foram lavadas três vezes (10 minutos cada) com solução salina 1x com Tris contendo Tween-20 (TBST) e incubaram-se com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 2 h. foram adicionados e os sinais de anticorpo secundário sobre as membranas foram visualizadas com um sistema de análise de imagem luminescente Fujifilm LAS4000:; HRP solução de peróxido de substrato /reagentes luminol (razão 1 misturados na proporção de 1 Immobilon Ocidental Substrato quimioluminescente, Millipore). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-PTEN, anti-AKT, anti-p70S6K, anti-caspase 3 e anti-PARP (Cell Signaling); anti-BCL2, anti-Bcl-x e anti-caspase 9 (GeneTex); anti-AURKA e anti-AURKB (BD Biosciences); e anti-FLJ10540 (Abnova). Todos os anticorpos foram utilizados a uma diluição de 1:. 1000

Viabilidade ensaio

As células foram semeadas em placas de 24 poços (4.000-5.000 células /poço) durante a noite e depois tratou-se com o 30% DMSO GP extrai ou a fração HH-F3 para 0, 24, 48 ou 72 horas. Após o tratamento, as células foram suavemente lavadas 3 vezes com 1x de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na a 10 mM

2HPO

4, KH 2 mM de

2 PO?

4) e, em seguida, incubadas com 0,5? g /ml de 3- (4,5-cimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich) durante 2 horas. O meio foi removido e os cristais de azul profundo foram dissolvidos com 100% de DMSO, à temperatura ambiente durante 10 minutos. Os valores de DO foram medidos a 570 nm com um leitor de ELISA.

contagem celular

As células foram semeadas em placas de 12 poços (10.000-20.000 células /poço) e incubadas durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com a fracção de HH-F3 para 0, 24, 48 ou 72 horas. As células foram então tripsinizadas, tratou-se com 0,4% de azul de tripano e contadas.

análise do ciclo celular e citometria de fluxo

Depois de as células terem sido tratadas com tripsina e lavadas três vezes com PBS, que foram centrifugados a 800

g Compra de 5 min. As células foram então ressuspensas em etanol a 70% em PBS e manteve-se a -20 ° C durante mais de 16 horas. As células foram centrifugadas a 800

g

durante 5 minutos, e os peletes de células foram ressuspensas em PBS frio contendo 100 ug /ml de ARNase A (Sigma-Aldrich) durante 20 min. As células foram então coradas com 20 ug /mL de iodeto de propídio (PI, Sigma-Aldrich) durante 20-30 min, e o teor de ADN foi medido e analisados ​​utilizando um software de análise de BD e FACSCanto Fluxo Jo, respectivamente.

ensaio da membrana mitocondrial potencial

O potencial da membrana mitocondrial foi analisado usando 5, 5 ‘, 6, 6′-tetracloro-l, 1′, 3, 3’-iodeto tetraethylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1) adquirido a partir de Cayman Chemical Co. as células em cultura foram semeadas em placas de 96 poços pretas a uma densidade de 7000 células /poço, incubadas durante a noite e tratadas com ou sem a fracção de HH-F3 durante 48 horas. A solução de coloração de JC-1 foi adicionado a cada poço e misturou-se suavemente a 37 ° C durante 15-30 minutos no escuro. As placas foram centrifugadas a 400

g

à temperatura ambiente durante 5 min e o sobrenadante foi removido de cada poço. O tampão de ensaio de JC-1 foi adicionada a cada poço, as placas foram centrifugadas durante 5 min a 400

g

à temperatura ambiente e o sobrenadante foi removido de cada poço. Finalmente, JC-1 de tampão de ensaio foi adicionado a cada poço, e as placas foram analisadas utilizando um leitor de placa fluorescente.

Medição de níveis de ROS

A geração intracelular de radicais superóxido (O

2

-) foi avaliada por fluorescência hidroetidina (AAT BioQUEST, Inc.). As células foram tratadas com ou sem a fracção de HH-F3 durante 48 horas. Hidroetidina (10 uM) foi adicionado a cada poço e misturou-se suavemente durante 30-60 min a 37 ° C no escuro. fluorescência celular foi monitorizada a um comprimento de onda de excitação de 520 nm e um comprimento de onda de emissão de 610 nm. níveis de peróxido intracelulares foram medidos usando diclorofluoresceína (DCFH) diacetato (gene marcador Technologies, Inc.). Depois de as células terem sido tratadas com a fracção de HH-F3 durante 48 horas, o meio foi aspirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram então incubadas com DCFH a uma concentração final de 20 uM em meio isento de soro durante 30-60 min a 37 ° C no escuro, lavou-se novamente com PBS e mantidas em 200 ul de meio de cultura. fluorescência celular foi monitorada em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm.

Animais, o ambiente experimental, e protocolo

O Animal Care e Use comissão da Faculdade de Medicina , Universidade Nacional de Taiwan, aprovou todos os protocolos experimentais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações de cuidados de animais da universidade.

Foram utilizados cento e vinte ratos seis semanas de idade machos Wistar albinos (150-180 g). Todos os animais foram deixados a aclimatizarem-se durante sete dias, e desde Chow padrão e água

ad libitum

durante o período experimental.

Os ratos foram distribuídos aleatoriamente para o grupo normal (N = 10), o dietilnitrosamina grupo (DEN) (N = 30), o grupo GP baixa dosagem (N = 30) ou o grupo de dose elevada GP (N = 30). Cinco ratos foram incluídos no grupo tratado com HH-F3. Para todos os grupos, excepto o grupo normal, a única fonte de água potável durante 63 dias era uma solução aquosa de 100 ppm (v /v) de DEN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) que foi mudado diariamente; , começando no dia 64, os ratos foram fornecidas com água da torneira por mais 14 dias. A solução foi preparado DEN cada semana e consistiu de uma dose individualizada calculada de acordo com o peso ganho /perda experimentado pelo animal em resposta à dose anterior. Os tumores hepáticos foram observados a partir do dia 42, e fibrose do fígado foi observada a partir do dia 63. Durante o período experimental, os animais foram pesados ​​semanalmente para calcular o ganho de peso; Além disso, a quantidade de água consumida pelos ratos foi medido a cada semana. Os ratos no grupo de baixa dose recebeu 0,6 g /rato de pó liofilizado GP; os ratos no grupo de alta dose recebida 1,8 g /rato de pó liofilizado GP; os ratos do grupo HH-F3 recebeu 0,036 g /rato de liofilizado em pó HH-F3 todos os dias durante três semanas, começando no dia 42.

procedimento de colheita e avaliação morfológica do

fígado

Todos os animais foram sacrificados no dia 84. Os animais foram mantidos em jejum durante a noite e sacrificados por CO

2 inalação. Após os ratos foram sacrificados, seus corpos, fígado e baço foram pesados; uma laparotomia mediana foi realizada e as condições dos órgãos foram observadas na necropsia. Todos os lóbulos do fígado foram colhidas imediatamente e cuidadosamente examinados para descrever a superfície do fígado e para caracterizar o desenvolvimento de focos no fígado, nódulos persistentes (SNP) ou de cancro em cada ponto de tempo. Posteriormente, o fígado foi cortado em secções de 5 mm. Todos os nódulos macroscopicamente visíveis na superfície do fígado e nas secções de 5 mm foram contados e medidos.

Carga tumoral avaliação

Para estabelecer o curso do desenvolvimento do tumor nos animais expostos ao DEN, todos lóbulos do fígado foram colhidas imediatamente, e todos os nódulos macroscopicamente visíveis na superfície do fígado e nas secções de 5 mm foram contados e medidos. fardos tumor no fígado foram determinadas pela estimativa dos montantes dos volumes de todo o tumor nódulos superior a 3 mm de diâmetro para cada animal; as cargas de tumor foram então comparados entre os grupos.

taxa de fluxo biliar

, os animais foram anestesiados Antes do sacrifício com 80 mg /kg de cetamina e a sua taxa de fluxo biliar foi medida com um PE10 tubo de silicone colocada no ducto biliar comum e ligado a um tubo de polietileno calculada. O fluxo biliar para dentro do tubo foi medida em intervalos de 5 min.

histopatológico

avaliação

Depois que o sangue tinha sido drenado, fatias de tecido 5 mm de espessura, contendo tumores foram dissecados de cada lóbulo da fígado. Secções (5 mm) foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina para análise histopatológica utilizando publicou os critérios de diagnóstico.

coloração imuno-histoquímica para a α-actina de músculo liso (α-SMA)

As amostras de fígado foram fixado com formalina, embebidos em parafina e seccionados em secções 5 mícrons. Os cortes foram desparafinados, re-hidratados e tratada com peróxido de hidrogénio a 0,03% durante 10 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Após duas lavagens com PBS, as secções foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo monoclonal anti-humano de rato α-SMA (diluição 1:50, Dako Cytomation, Dinamarca). Para a coloração α-SMA, as secções foram lavadas e incubadas com um anticorpo de coelho secundário IgG anti-ratinho (diluição 1: 200) à temperatura ambiente durante 1 h. As secções foram então desenvolvidas de forma semelhante. Após a coloração, as secções foram contrastadas com hematoxilina para microscopia análises. A percentagem de áreas α-SMA-positivos (mm

2 /cm

2 da secção do fígado) foi determinada utilizando um sistema de câmera digital HC-2500 (Fuji Photo Film), Adobe Photoshop versão 5.0J e Imagem-Pro Plus versão 3.0.1J

Ensaio de teor de hidroxiprolina no fígado

amostras de fígado foram pesados, e 20 mg de as amostras congeladas foi hidrolisado em 20 ml de HCl 6 N e cuidadosamente solo.; HCl 6 N foi então adicionado para obter um volume total de 30 ml /mg de tecido. O tecido triturado foi hidrolisada a 120 ° C durante 16 horas. Depois de um breve período de arrefecimento em gelo e centrifugação a 8000

g

durante 10 min, o sobrenadante foi removido e colocado num novo tubo; o volume perdida por evaporação foi reabastecido com água. Foi adicionado um volume igual de NaOH a 6 N e misturados, e o pH da solução foi ajustado a pH 4-9 usando papel de tornassol. Quarenta microlitros de solução da amostra neutralizada foi adicionado aos poços de uma placa com 96 poços de ELISA e oxidado usando uma solução contendo 5 ml de 7% da cloramina T (Sigma-Aldrich) e 20 ml de tampão de acetato /citrato. Cento e cinquenta mililitros de solução de Ehrlich foi adicionado. A mistura final foi incubada a 60 ° C durante 35 min e à temperatura ambiente durante 10 min; a absorvência foi então determinada a 560 nm. Soluções padrão contendo 100, 80, 60, 40, 20 e 0 mg /ml de autêntica 4-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich) foram tratados de um modo semelhante. A curva padrão era linear nesta gama de concentrações (

R

= 0,99). O nível de hidroxiprolina do fígado foi expresso como mg de hidroxiprolina /g de peso húmido do fígado. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

A análise estatística

Todos os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média. Níveis de significância foram avaliados por bicaudal

t

-teste ou one-way análise de Student pareado de variância (ANOVA).

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Os efeitos anti-proliferativa de diferentes preparações GP em Huh7 e células Mahlavu

Para testar o potencial efeitos biológicos do GP, vários GP extractos foram preparadas utilizando água, butanol, acetona, metanol, etanol a 100%, etanol a 70%, etanol a 50%, 100% de DMSO ou 30% de DMSO e utilizado para tratar as células de carcinoma hepatocelular humano. A inibição do crescimento induzida por os diferentes extractos GP foi examinada. Os dados dos ensaios MTT indicaram que o DMSO 30% extratos reduziram significativamente a viabilidade das células Huh7 e Mahlavu (Fig 1A); Mais especificamente, as concentrações de 500 e 250 ug /ml resultou numa inibição de 50% da viabilidade celular (IC

50) 72 horas pós-tratamento para Huh7 e Mahlavu células, respectivamente (Figura 1B).

Huh7 e células Mahlavu foram tratados com extractos GP preparadas em água, butanol, acetona, metanol, etanol a 100%, etanol a 70%, etanol a 50%, 100% de DMSO, ou 30% de DMSO a concentrações de 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 e 1500 ug /ml durante 72 horas. A viabilidade das células tratadas foi determinada utilizando ensaios MTT. Os extractos 30% DMSO GP foi associada com a maior inibição de crescimento de células Huh7 e Mahlavu após 72 horas. células Huh7 e Mahlavu (B) foram tratadas com concentrações de 0, 250, 500, 750 e 1000 ug /ml de DMSO a 30% GP extrai por 24, 48, e 72 horas, e ensaios MTT foram conduzidos. A IC

50 concentrações de 30% de DMSO GP extrai para a inibição do crescimento das células Huh7 e Mahlavu foram cerca de 500 e 250 ug /ml, respectivamente, após 72 horas de tratamento. células (C) e Huh7 HepG2 foram tratadas com os extractos preparados GP em 30% de DMSO, água ou butanol (BuOH) durante 48 horas. Os níveis de AURKA, AURKB e FLJ10540 foram medidos por análise de Western blot. Os níveis de expressão de AURKA, AURKB e FLJ10540 em células HepG2 e Huh7 foram suprimidos pelos 30% extratos DMSO GP, mas não pelas frações preparadas em água ou butanol. (D) As células HepG2 foram tratadas com 75 ng /ml de nocodazole o agente de sincronização (CON), durante 18 horas; as células foram depois tratadas com 750 ug /ml de DMSO a 30% ou extrai GP controlo de veículo (30% de DMSO) durante mais 3 horas. Western blotting foi realizado usando anti-FLJ10540, anti-AURKA e anticorpos anti-AURKB. As células HepG2 (E) foram tratados com os 30% extratos DMSO GP e suas frações (HH-F1, HH-F2, F3 e HH-HH-F4) durante 3 horas. AURKA AURKB e os níveis de expressão em células HepG2 foram suprimidos pela fracção HH-F3, mas não pelas outras fracções. células (F) Huh7, Mahlavu PLC5 e foram tratadas com várias concentrações de HH-F3 durante 48 horas. A expressão de proteínas e AURKA FLJ10540 foi avaliada por análise de imunotransferência. HH-F3 reduziu os níveis de proteína AURKA FLJ10540 e de uma forma dependente da concentração.

GP reduz AURKA, AURKB FLJ10540 e os níveis de expressão de proteínas, tanto durante a interfase e a mitose em células estreladas hepáticas activados e linhas celulares de carcinoma hepatocelular

AURKA, AURKB e FLJ10540 são oncogenes que são comumente overexpressed em HCC [22-24]. Acidentalmente, verificou-se que os 30% de DMSO extractos GP inibiu os níveis de expressão de proteína de FLJ10540, AURKA AURKB e em linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HepG2 e Huh7) de uma forma dependente da concentração (Fig 1C, S1 FIG). Em contraste, os extractos de GP preparadas em água ou butanol não inibiram os níveis de expressão de proteína de AURKA ou AURKB em células HepG2 após 72 horas de tratamento (Figura 1C). É sabido que os níveis de AURKA, AURKB e FLJ10540 expressão são mais elevados durante a metafase do que durante a interfase [25-27]. Por conseguinte, investigado se os extractos 30% DMSO GP poderia inibir a expressão destas proteínas durante a mitose em células de carcinoma hepatocelular. As células HepG2 foram primeiro tratados com 75 ng /ml de nocodazole durante 18 horas; estas células foram então tratadas com 30% de DMSO GP extrai durante 3 horas (sem lavagem do nocodazol). AURKA, AURKB FLJ10540 e os níveis de expressão eram elevados durante a mitose. Em células tratadas com os 30% de DMSO extractos GP, os níveis de AURKA, AURKB FLJ10540 e de expressão de proteínas diminuíram durante a interfase e da metafase (Figura 1D); Em contraste, não foram observadas alterações significativas nos níveis de expressão de outras proteínas mitóticas (PIN1, HURP e PLK) (dados não mostrados).

HH-F3 suprime a expressão de proteínas em linhas de células AURKA HCC

em seguida, usando uma coluna LH-20 Sephadex, obteve-se quatro fracções de 30% os extractos DMSO (GP S2A FIG). análise de transferência de Western realizadas 3 horas pós-tratamento revelaram que apenas a terceira fracção (HH-F3) suprimiu a expressão de AURKA e AURKB em células HepG2 (Figura 1E). Em seguida, as células Huh7, Mahlavu PLC5 e foram tratadas com ou sem 25, 50 e 75 ug /ml da fracção HH-F3 durante 48 horas. A expressão de AURKA e FLJ10540 em todas as três linhas de células de carcinoma hepatocelular foi significativamente suprimida por HH-F3 (Figura 1F). Para investigar se os efeitos inibidores de HH-F3 ocorreu ao nível da transcrição, examinamos a variação nos níveis de expressão do gene de

FLJ10540

e

AURKA

,

AURKB

e

AURKC

(membros da família de cinases Aurora de genes). As células HepG2 foram tratadas com 50 ug /ml da fracção HH-F3 durante 6 horas, e os níveis de expressão do gene e da proteína foram medidas por microarranjo (chip de U133A, Affymetrix) e Western blot, respectivamente. Houve quase nenhuma alteração nos níveis de expressão do gene de qualquer um dos genes acima referidos, após o tratamento com HH-F3; No entanto, foram observadas reduções nos níveis de proteína (dados não apresentados). Estes resultados sugerem que a fracção HH-F3 regulada a expressão de FLJ10540 e as moléculas da família da quinase Aurora ao nível da tradução, em vez de ao nivel da transcrição.

A identificação dos componentes activos do Gp

para simplificar os protocolos de preparação, foi utilizado outro método (método II) por diálise direta dos 30% extratos DMSO GP contra água. As propriedades físico-químicas dos compostos obtidos utilizando o Método II estão listados na Tabela S1, e estes dados indicam que as fracções obtidas com o Método I (o método utilizado para preparar inicialmente HH-F3) e o Método II eram idênticos. Após a liofilização, cor-de-rosa característica e prata metálica-como brilho parcial da fração HH-F3 foi observada. De acordo com os sinais aromáticos ampliadas em

1H e

13C Os espectros de RMN, os principais componentes da fracção de HH-F3 foram identificados como compostos polifenólicos; mais especificamente, taninos. Um ensaio colorimétrico (OD

500) para a quantificação do tanino condensado utilizando catequina como padrão mostrou que o teor total de tanino da fracção HH-F3 foi de aproximadamente 68% (dados não mostrados). A impressão digital por HPLC da fracção de HH-F3 (S2 Fig 2B) revelou que esta fracção continha dois grupos de compostos (Grupos A e B), com gamas diferentes de pesos moleculares; Grupo B continha uma grande e um componente menor. Estes resultados revelaram a fracção do HH-F3 foi rico em taninos condensados ​​e continha compostos com pesos moleculares elevados.

(A) de hepatócitos humanos foram tratados com várias concentrações de 30% de DMSO extractos GP /HH-F3 para 72 hrs. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (DP) de três experiências independentes. Huh7, células Mahlavu e PLC5 foram tratados com 5, 25, 50 e 75 ug /ml da fracção HH-F3 em para 24, 48 e 72 horas, em seguida, submetidos ao ensaio MTT (B) e de tripano ensaio de azul (C). A IC

50 concentrações de HH-F3 para a inibição do crescimento de células Huh7, Mahlavu e PLC5 foram de aproximadamente 50, 37,5 e 75 ug /ml, respectivamente, após 72 horas de tratamento.

porque não há ainda compostos poliméricos têm sido isolados a partir de GP, os compostos polifenólicos de

Rhodiola rósea

(raiz de ouro), uma outra erva da família Crassulaceae, foram utilizados como compostos de referência para a identificação estrutural de compostos no HH- fracção F3.

R

.

rosea

foi relatado para conter taninos condensados ​​(CTS). As propriedades químicas dos compostos principais na sub-fracção HH-F3a, tanto a partir de Métodos I e II, foram muito semelhantes aos dos TCs

R

.

rosea

(raiz de ouro). Além disso, como compostos CT são frequentemente encontrados em muitas espécies de uva comum,

Vitis vinifera

CTs foram também utilizados como compostos de referência. S1 tabela resume as propriedades físico-químicas do proantocianidina polimérica de

R

.

rosea Comprar e

Vitis vinifera

. A sua elevada proporção de 3, 4, 5-tri-hidroxi substituintes benzílicos de HH-F3a (identificada pelos

13C desvios químicos a 105 ppm e 109 ppm para o C-2 ‘/6’ e C-2 “/6” de a unidade de EGCG, respectivamente; espectros não mostrado) era muito semelhante ao do composto encontrado em

R

.

rosea

, mas muito maior do que o composto encontrado na casca da uva e sementes (veja S1 Tabela). Por conseguinte, a CT apresentado em HH-F3a foi proposto como um proantocianidina polimérica com uma unidade de repetição e dominador prodelphinidin (4 → 8) -linkages (ver Fig S2C). Caracterização química de HH-F3a e elucidação estrutural da unidade de repetição após a degradação química por tiólise serão publicados separadamente.

A fração HH-F3 reduz a viabilidade das células HCC

Para investigar os efeitos * P * P