Abstract
Objectivo
Para o perfil expressão do RNA no câncer gástrico por subsites anatômicas como um passo inicial na identificação de subtipos moleculares e fornecendo alvos para a detecção precoce e terapia.
métodos
Foram realizadas análises transcriptoma usando o Affymetrix GeneChip U133A em adenocarcinomas cárdia (n = 62) e adenocarcinomas noncardia gástricas (n = 72) e os seus tecidos normais correspondentes em pacientes na província de Shanxi, e validados selecionados genes desregulados com estudos de ARN adicionais. A expressão de genes desregulados também foi relacionado para a sobrevivência dos casos.
Resultados
Análise de Componentes Principais mostraram que as amostras agrupadas por tumor vs. localização normal, anatômica e características histopatológicas. Emparelhados testes t de tumor tecidos /normais identificados 511 genes cuja expressão foi desregulado (
P Art 4.7E-07 e pelo menos duas vezes diferença de magnitude) em cárdia ou cancros gástricos noncardia, incluindo quase um -metade (n = 239, 47%) em ambos desregulado cárdia e noncardia, um-quarto desregulado no cárdia única (n = 128, 25%), e cerca de um-quarto em noncardia única (n = 144, 28%). estudos de ARN adicionais confirmaram os resultados de perfis. Expressão foi associada com a sobrevivência caso por 20 genes em cárdia e 36 genes em cancros gástricos noncardia.
Conclusões
Os genes desregulados identificadas aqui representam um ponto de partida abrangente para futuros esforços para compreender a heterogeneidade etiológica, desenvolver biomarcadores de diagnóstico para a detecção precoce, e testar terapias molecularmente-alvo para câncer gástrico
Citation:. Wang G, Hu N, Yang HH, Wang L, Su H, Wang C, et al. (2013) Comparação de Gene Expression global de gástrico Cardia e cancros Noncardia a partir de uma população de alto risco na China. PLoS ONE 8 (5): e63826. doi: 10.1371 /journal.pone.0063826
editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura
Recebido: 03 de janeiro de 2013; Aceito: 05 de abril de 2013; Publicado em: 22 de maio de 2013
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Esta pesquisa é financiada pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, o Instituto Nacional do Câncer, da Divisão de Cancer Epidemiology and Genetics e do Centro de Pesquisa do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Carol Giffen é empregado por Management Information Services, Inc. Não há patentes, produtos no desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
O câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum e a segunda causa mais frequente de morte por cancro em todo o mundo [1]. Como resultado de sua grande população e altas taxas, a China responde por 42% de todas as mortes por câncer gástrico no mundo a cada ano [1]. Província de Shanxi é uma das regiões com maior taxa de incidência de câncer gástrico na China [2], [3]. Na verdade, o câncer gástrico continua a ser a principal causa de morte por câncer em homens (36%) e mulheres (28%) nesta região [4], apesar do declínio na incidência para este cancro no norte da China.
taxas de câncer gástrico na China são mais elevadas no norte e fatores de risco para ambos cárdia e cancros gástricos noncardia ter sido previamente estudada lá. o aumento da idade, sexo masculino, história familiar de câncer do trato gastrointestinal superior, a exposição ao tabaco, e
infecção por Helicobacter pylori
foram todos fatores de risco consistentes para ambos adenocarcinoma gástrico da cárdia (CGC) e adenocardinoma noncardia gástrica (GNCA) [ ,,,0],5] – [13]; Além disso, novas evidências suporta o aumento do risco de dano térmico do alimento quente [6]. Diet, especialmente micronutrientes, parecem desempenhar um papel protetor importante, como evidenciado pelos resultados de um grande, ensaio clínico randomizado realizado em Linxian que mostraram redução GCA e mortalidade GNCA a partir da combinação de antioxidantes do selênio, vitamina E e beta-caroteno [14 ], [15]; outros estudos nutricionais com base em questionários também apoiar o papel da nutrição na etiologia do câncer gástrico [6].
cânceres gástrico são histologicamente classificados em difusa e tipos intestinais [16] Para tanto cárdia e noncardia. Anatomicamente, o cárdia situa-se entre a extremidade do esófago e do corpo do estômago, e é uma pequena zona macroscopicamente indistinta imediatamente distai em relação à junção gastro-esofágica. Funde distalmente no fundo e é distinguível somente por seu padrão histológico
.
Além de ser anatomicamente adjacentes, CGC e carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) ambos ocorrem a taxas epidêmicas nesta população, compartilhar algum risco etiológico fatores, e antes do uso generalizado de endoscopia e biópsia, foram diagnosticadas como uma doença única referido como “câncer de esôfago” ou “doença engolindo em seco” [17]. A capacidade para diagnosticar GCA e com precisão distingui-lo de CICAc conduziu a um aumento na incidência de cancro gástrico nesta região [18]. A razão para as altas taxas de GCA e CICAc nesta área geográfica e sua relação com o outro permanece obscuro, mas há quase certamente exposições ambientais etiologicamente importantes comuns, e um estudo de associação do genoma recente de DNA germinal encontraram um gene comum (
PLCE1
) associado com o risco tanto para GCA e CICAc [19].
adenocarcinomas gástricos são um grupo heterogêneo de tumores. GATS mostrar biológico, epidemiológico e clínico-patológicas características que mais se assemelham adenocarcinomas de esôfago (CAEs) do que GNCAs, sugerindo que os tumores resultantes no estômago podem ter etiologias distintas. Por exemplo, vários estudos detectaram substancialmente mais elevado
TP53
taxas de mutação em casos com GCA que GNCA, enquanto o TP53
espectro de mutação no GCA se assemelhavam mais de perto EAC [20]. Uma série de outras alterações genéticas têm sido relatados no câncer gástrico, incluindo
CDH1
[21],
β-catenina
[22],
TFF1
[23], e
Met
[24], mas nenhum estudo comparou estas alterações por subsite anatômica. Além disso, embora vários expressão do gene de câncer gástrico profiling estudos já foram relatados [25] – [31]., Ninguém tem GCA diretamente comparados e casos GNCA de uma região geográfica de alto risco através de um protocolo comum
O objetivo deste estudo foi identificar diferenças genômicas entre câncer gástrico pelos subtipos anatômicas para ajudar a nossa compreensão das etiologias destes dois cancros distintos e facilitar o desenvolvimento de estratégias direcionadas apropriados para a detecção precoce, prognóstico e terapia.
Materiais e Métodos
1. Seleção dos pacientes e acompanhamento
Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards do Hospital de Câncer de Shanxi na China e do National Cancer Institute (NCI) dos EUA. Pacientes internados no Hospital de Câncer de Shanxi, entre 1998 e 2001, com um diagnóstico de GCA ou GNCA e os candidatos considerados para a ressecção cirúrgica curativa foram identificados e recrutados para participar do estudo. Nenhum dos pacientes teve terapêutica prévia, e Shanxi foi a casa ancestral para todos. Depois de obter o consentimento informado, os pacientes foram entrevistados para obter informações sobre fatores de risco demográficos e de câncer de estilo de vida e dados clínicos e amostras foram obtidas.
O câncer gástrico aqui foi definida por histologia (apenas adenocarcinomas foram incluídos) e locais anatômicos foram definidos como adenocarcinoma gástrico da cárdia (CGC) e adenocarcinoma gástrico noncardia (GNCA). cancros cárdia foram cancros gástricos localizados nas três centímetros proximal do estômago (C16.0), enquanto cancros noncardia eram aqueles no restante do estômago (fundo, corpo, antro, piloro (C16.1-8), e localização não especificada (C16.9) com base em códigos de site da Classificação Internacional de Tumores malignos (edição sétimo)) [32].
Entre 2005 e 2007, todos os pacientes (ou suas famílias) deste estudo foram re-contactado para determinar estado vital. Para aqueles que morreram, foram determinados data e causa da morte.
2. Recolha de Amostras
tumor e tecidos normais correspondentes obtidos durante a cirurgia foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -130 ° C até à sua utilização. Casos foram escolhidos para este estudo com base em três critérios: (i) diagnóstico histológico de GCA ou GNCA confirmada por patologistas, tanto do Hospital do Câncer Shanxi eo NCI; (Ii) amostras de tumores que eram pelo menos 50% do tumor; e (iii) a qualidade RNA de tecido /quantidade suficiente para o teste.
3. Preparação de amostras e Chip Hibridização
O RNA total foi extraído de tumor congelado e combinados tecidos normais utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. purificação de RNA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante para o kit RNeasy Mini (Qiagen Inc, Valência, CA) e RNase DNase Conjunto de digestão (Qiagen Inc, Valência, CA). qualidade e quantidade de ARN foram determinados usando o RNA 6000 LabChip /Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Germantown, MD):
microarrays experimentos foram realizados utilizando 8 ug de ARN total.; detalhes de transcrição reversa, rotulagem, e hibridação foram de acordo com o protocolo do fabricante (https://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx; acessada 2013 Apr 14). Resumidamente, os procedimentos incluídos síntese de cDNA primeiro cordão, a síntese de cDNA vertente segunda, cDNA de cadeia dupla de limpar,
in vitro
transcrição, purificação cRNA, e fragmentação. Vinte ug biotinilado ARNc foram usadas em cada hibridização matriz. As amostras foram hibridizados em Affymetrix GeneChip genoma humano fichas U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Após a hibridação a 45 ° C durante a noite, as matrizes foram posteriormente desenvolvidos com estreptavidina conjugada com ficoeritrina por fluídica estação (GeneChip Fluídica estação 450, Santa Clara, CA) e foram digitalizados (scanner GeneChip 3000, Santa Clara, CA) para se obter níveis de expressão de genes quantitativa . tumor emparelhado e amostras de tecidos normais de cada paciente foram processados simultaneamente em todo o processo experimental. A chamada média actual para as 124 fichas dos 62 pacientes GCA foi de 50,0%; para os 144 fragmentos procedentes das 72 pacientes GNCA foi de 51,5%.
4. Análise Estatística
Existem 22,283 conjuntos de sondas no Affymetrix GeneChip Human Genome U133A (HG_U133A). O multiarray Média (RMA) algoritmo robusto [33], [34] implementado em Bioconductor em R (https://www.bioconductor.org; acessada 2013 Apr 14) foi utilizado para a correção de fundo e normalização em todas as amostras. Todos os métodos estatísticos foram desenvolvidos em número de acesso R. O GEO para estes dados de matriz é GSE29272.
Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizado para agrupamento análise de todas as amostras com câncer gástrico aqui analisados. Para o PCA somente, nós também incluiu dados de um estudo conjunto expressão recentemente publicado de casos CICAc para comparação [35].
Foi aplicado pareado testes t para cada um dos 22,283 sondas para identificar genes que foram diferencialmente expressos entre tumores e suas amostras normais pareados, mas nós apresentamos resultados apenas para os 21,130 sondas que mapearam a 13,003 genes. Para ter em conta as comparações múltiplas, foram selecionados genes que mostraram diferenças significativas com
P
-Valores menos de 4.73E-07 (igual a 0,01 dividido por 21.130, ou seja, um ajuste conservador Bonferroni). Além do
P
corte -valor, genes diferencialmente expressos tinha para mostrar, pelo menos, uma diferença de duas vezes na magnitude expressão genética entre os tecidos tumorais e normais (alteração, quer ≥2 ou seja, dobrar ou ≤0.50) .
para identificar genes desregulados cuja expressão foi associada com pessoal (sexo e história familiar de câncer gastrointestinal superior ou UGI) características e clínica (estágio do tumor, grau, metástase linfonodal), realizamos testes t desemparelhados para diferenças de expressão génica entre amostras utilizando o rácio da expressão do gene do tumor dividida pela expressão normal do gene combinado. A
P
limiar -valor (
P Art 0,005) foi usado para significância para estas análises; não há critérios de mudança de dobra foram aplicadas.
Para avaliar a relação da expressão do gene de sobrevivência, de Kaplan-Meier (KM) parcelas foram usadas para visualizar as diferenças de sobrevivência por alto (acima de mediana) vs baixa (abaixo de mediana) a expressão do gene testes de estado e de log-rank foram usadas para testar as diferenças, utilizando o sinal de sondas de tumor para cada um dos genes diferencialmente expressos identificados-na análise de teste-t emparelhado tumoral /normal, descrito acima. Genes cuja expressão foi significativamente relacionado com a sobrevivência em testes de log-rank foram ainda avaliadas em modelos de risco proporcional de Cox em alta vs baixa expressão com ajuste para as características demográficas e clínicas dos tumores (ou seja, idade, sexo, fase, classe, metástase). Para todas as análises de sobrevivência, foi utilizado um de dois lados
P
-valor. 0,05 como o nosso limite de significância estatística
5. Validação de genes diferencialmente expressos utilizando-quantitativa em tempo real RT-PCR
Foram selecionados um total de 21 genes diferencialmente expressos (12 para GCA e 9 para GNCA) para validação usando quantitativa Real-Time RT-PCR ( qRT-PCR). Para a validação técnica, os ensaios de qRT-PCR foram realizadas utilizando o mesmo tumor e RNAs normais analisados no experimento de microarranjo para um subconjunto de GATS (n = 41) e de 62 GNCAs (n = 50 de 72). Para a validação de replicação, os ARN de tumor e normais correspondentes de um novo conjunto de GNCAs (n = 44) foram testados.
O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando 3 ug de RNA total com oligo (dT)
18/12 (500 ug /ml) numa reacção de 20 ul com sistema Superscript II de transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os produtos de ADNc foram então diluídas em 1:100. As reacções de PCR em tempo real foram realizadas utilizando um 7000 Sequence Detection System ABI Prism (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos os iniciadores e sondas de sete genes-alvo e uma desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato gene de controlo interno (
GAPDH) foram adquiridos de Applied Biosystems. reacções de qRT-PCR foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante, como previamente descrito [36]. As condições dos ciclos térmicos incluído um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg cada, 60 ° C durante um minuto, e 72 ° C para um min. a expressão do gene foi analisada usando 2
-ΔΔCT algoritmo.
Resultados
1. As características dos pacientes
Um total de 62 GCA e 72 pacientes GNCA foram analisados usando a matriz Affymetrix U133A. Os dados pessoais e clínicos para os pacientes estudados estão resumidos na Tabela 1 (Características clínicas para casos individuais aqui estudados são apresentados na Tabela S1). A idade média ao diagnóstico foi de meio-de-final dos anos 50, predominou o sexo masculino, e cerca de um quarto tinha uma história familiar de gastrointestinal superior câncer (UGI) (ie, esofágica ou câncer gástrico em primeiro, segundo ou parentes de terceiro grau). Para ambos GCA e GNCA, a maioria dos casos estudados foram fase tardia, de alto grau, e intestinais tipo de célula tumores com metástase ganglionar. A sobrevida média para os casos GCA foi de 20,3 meses, e para os casos GNCA foi de 27,8 meses, com base em um total de 50 e 52 mortes, respectivamente.
2. Análise de Componentes Principais de Gene Expression Microarray dados
Foi utilizado Análise de Componentes Principais (PCA) para obter uma compreensão da expressão gênica global destas amostras. Nesta análise, foram avaliados 124 amostras de 62 pacientes GCA (cada um com tumor e um par normal) e 144 amostras de 72 pacientes GNCA (cada um com tumor e um par normal), bem como 106 amostras de pacientes CICAc (cada um com tumor e um par normal de ) a partir de um estudo anterior [35]. PCA revelou dois grandes conjuntos de amostras que separam todos os cânceres gástricos combinados (GCA em vermelho, GNCA em azul) a partir de ESCC (verde) no eixo PC1 (Figura 1). Os dois grupos foram ainda divididos em tecidos normais e tumorais por PC2 (tumor e normal são denotadas por N e T, respectivamente). A diferença entre GCA (vermelho) e GNCA (azul) também foi notável, especialmente para os tecidos normais. Em seguida, concentrou-se nas análises de câncer gástrico. APC da ACG (Figura 2) e GNCA (Figura 3) mostrou novamente a separação das amostras em tumor (T) e grupos normais (N).
PCA revelou dois grandes conjuntos de amostras de separação do cancro gástrico (CC [ ,,,0],GCA] em vermelho, N = 62; BC [GNCA] em azul, N = 72) da CE [CICAc] (verde, N = 53) no eixo PC1. PC2 divididos ainda aglomerados em tumor (T) e as amostras normais (N). (Nota sobre a comparabilidade dos resultados de expressão: Os casos de ESCC, GCA, e GNCA foram inscritos simultaneamente a partir de um único hospital usando um protocolo comum; amostras foram colhidos, processados, armazenados e transportados de forma idêntica, e análises laboratoriais foram realizadas durante o mesmo período de tempo, no mesmo laboratório, pelo mesmo pessoal técnico, usando a mesma plataforma, ea mesma abordagem técnica.).
Red “t” representa tumor e verde “n” representa combinado tecido normal.
Red “t” representa tumor e verde “n” representa combinado tecido normal.
3. Identificação de genes para cima ou para baixo-regulado em GCA e GNCA
Para GCA, um total de 367 genes foram diferencialmente expressos entre tumores e suas amostras normais correspondentes. Destes genes, 199 genes foram supra-regulados e 168 foram regulados negativamente (Figura 4). Para GNCA, um total de 383 genes foram diferencialmente expressos entre tumores e amostras não tumorais correspondentes, incluindo 192 genes regulados positivamente e 191 genes regulados jusante (Figura 4).
4. Comparação de Expressão Gênica em GCA e GNCA
Foram comparados os dois conjuntos de genes que apresentaram diferenças significativas na expressão gênica para GCA e GNCA e identificados 239 genes que foram desregulados em ambos os GCA e GNCA, entre os quais 113 estavam se – e 126 sub-regulada (Figura 4 e Tabela S2). Além disso, descobrimos que 128 genes foram desregulados apenas no GCA (86 para cima e 42 sub-regulada) (Figura 4 e Tabela S3), e 144 genes foram desregulados somente em GNCA (79 para cima e para baixo 65-regulado) ( Figura 4 e Tabela S4).
Entre os 113 genes regulados positivamente em ambos GCA e GNCA foram genes associados com checkpoint do ciclo celular (por exemplo,
CDC2, TOP2A
), a sinalização Wnt (por exemplo, ,
SULF1
,
SFRP4, LEF1, LAMB1
), adesão (por exemplo,
FN1
), e da via TGF-β (por exemplo,
COL1A1
,
COL1A2
,
COL3A1). Em contraste, os 126 genes regulados negativamente comuns a ambos GCA e GNCA foram enriquecidos em processos envolvidos no metabolismo (por exemplo,
AADAC
,
CA2
,
CA9
), digestão (por exemplo,
ATP4A, ATP4B
), e o desenvolvimento do tecido gastrointestinal (por exemplo,
GIF
,
MUC5A
,
MUC6
,
TFF1
,
TFF2
) (Tabela S2). Estes resultados sugerem que ACG e GNCA compartilhar muitos caminhos etiológicos comuns.
Genes-regulada apenas no GCA estavam envolvidos na regulação do checkpoint do ciclo celular (por exemplo,
CCNB1
,
CCNB2
,
CCNE1, CDC25B, SFN
), CXC quimiocinas (por exemplo,
CXCL1
,
CXCL10
), e matriz extracelular (por exemplo,
MMP9, MMP11
); enquanto GCA-somente genes regulados negativamente foram associados com a desintoxicação (por exemplo,
GPx3
) e oncogenes (por exemplo,
FOS
,
junho
) (Tabela S3).
Entre genes alterados significativamente em GNCA somente, genes up-regulamentados incluídos aqueles relacionados à epitelial-a-mesenquimal de transição (por exemplo,
CALD1
,
IGFBP4
) e actina filamentos ( por exemplo,
DES, FNLA
). Por outro lado, os genes regulados negativamente funcionava na desintoxicação (por exemplo,
CYP2C9
) e superfícies epiteliais (por exemplo,
MUC1
) (Tabela S4).
5. Relação entre a expressão genética e paciente Pessoal /Características clínicas
Em GCA, foram encontrados genes diferencialmente expressos estar relacionado com história familiar de câncer UGI (Tabela S5a) e metástases em linfonodos (Tabela S5b), mas não outra características (isto é, o sexo, estádio do tumor, grau tumoral; dados não mostrados). Sessenta e sete genes foram significativamente desregulada (47 para cima e 20 sub-regulada) em pacientes com história familiar de câncer de UGI (n = 16 casos) em comparação com pacientes sem essa história (n = 46 casos), mas dobram mudanças foram, em geral pequena: a maior mudança vezes entre os genes regulados positivamente foi de 1,39 (isto é,
JDP1
), enquanto quatro genes regulada para baixo (
LMO4
,
ABHD2, LAMA3
,
MAP17
) foram reduzidas em um terço ou mais (Tabela S5a). Para características clínicas, foram identificados 57 genes que foram significativamente desregulados (9 cima e 48 sub-regulada) em pacientes com CGC linfonodos positivos (n = 50 casos) em comparação com pacientes negativos dos nódulos linfáticos (n = 12 casos); 11 destes genes (seis jusante e cinco-regulada) alcançou variação de 1,5 vezes (Tabela S5b).
Para GNCA, 37 genes tinham níveis significativamente diferentes de expressão na história familiar positiva (n = 16) versus (n = 56) (Tabela casos negativos S6A), mas as mudanças dobra foram todos inferiores a 1,5. Também foram identificados genes diferencialmente expressos-significativos para várias características clínicas tumorais, incluindo a fase tardia (III /IV) versus o início (I /II) (n = 90 genes), e em comparação com baixo grau elevado (3) (1/2) ( n = 89 genes) (Tabelas S6B e S6c). Metástase linfática, o mais forte preditivo característica clínica de sobrevivência, também foi associado com níveis de expressão em 57 genes (Tabela S6d).
6. Gene Expression and Survival
Foi avaliada a relação da expressão do ARN de sobrevivência para cada um dos genes /sondas sobre o micro-arranjo. Para GCA, 20 genes foram significativamente associados com a sobrevivência (nominal
P
-valor 0,05) por testes de log rank (Tabela 2). Um exemplo ilustrativo da curva de sobrevivência para um desses genes (
MMP9)
é mostrado na Figura 5. Onze genes permaneceu significativa após ajuste para co-variáveis em modelos de Cox. Análises semelhantes para GNCA mostrou que 36 genes foram significativamente associados com a sobrevivência em testes de log rank, incluindo 27 que permaneceu significativa após o ajuste covariável (Tabela 3); uma curva de sobrevivência para um dos 36 (
ESRRG
) é mostrado na Figura 6.
linhas vermelhas
ponteadas indicam elevada (acima da mediana) e quebradas expressão linhas azuis indicam baixa (abaixo da mediana ) expressão.
linhas vermelhas
pontilhadas indicam alta (acima da média) expressão e quebrados linhas azuis indicam baixa (abaixo da mediana) expressão.
7. Validação de genes diferencialmente expressos utilizando-quantitativa em tempo real RT-PCR
Realizamos experimentos de validação técnica por 12 genes em 41 dos casos 62 GCA cujas amostras ainda tinha quantidade RNA suficiente após a conclusão do estudo de matriz. Quatro-regulada (
SULFI, CDC2, TOP2A, BUB1B) Comprar e oito regulada para baixo (
CA9, CCKBR, PIK3C2G
,
FOS, junho, KLF4
,
KLK11, NUCB2
) genes foram ensaiados utilizando quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR). Nossos resultados mostraram que os padrões de expressão gênica foram muito semelhantes aos resultados da experiência matriz RNA (Tabela 4 e Tabela S7).
Para GNCA, nove genes diferencialmente expressos (cinco para cima e quatro down-regulamentado) foram selecionados para validação por qRT-PCR. pares de amostras para 50 de 72 casos analisados no chip RNA foram avaliados para a replicação técnica e mostrou resultados semelhantes aos da matriz (Tabela 5 e Tabela S8A). Além disso, tumorais correspondentes /amostras de indivíduos normais a partir de um novo conjunto de 44 casos GNCA foram testados para a validação de replicação. Os resultados foram consistentes com aqueles a partir dos dados de matriz expressão (Tabela 5 e Tabela S8b).
Discussão
GCA é um dos poucos tumores malignos que tem aumentado acentuadamente nos países desenvolvidos nos últimos anos anos por razões que são ainda não explicada, e os eventos moleculares que cercam este câncer gástrico são ainda desconhecidas [37], [38]. Para entender melhor os eventos moleculares no câncer gástrico e seus subtipos anatômicas, nós perfilado expressão gênica em GCA e pacientes GNCA a partir de uma população de alto risco na China usando alta densidade microarrays expressão RNA. Foram identificados 511 genes cuja expressão foi desregulado no cancro gástrico em geral, incluindo quase a metade (n = 239, 47%) desregulados em ambos GCA e GNCA, um-quarto desregulado na ACG única (n = 128, 25%), e cerca de um quarto em GNCA única (n = 144, 28%). Associações com história familiar de UGI dica câncer em susceptibilidade genética na etiologia, enquanto as associações com características clínicas e sobrevida sugerir potenciais alvos terapêuticos para uma avaliação mais aprofundada.
Os genes regulados positivamente comuns identificados estão envolvidos em muitas vias relacionadas com a o desenvolvimento de cancro, incluindo o ciclo celular, o crescimento e a proliferação celular, checkpoint do ciclo celular, a remodelação da matriz extracelular, e a angiogénese (por exemplo, Wnt ciclo celular de sinalização e de vias de pontos de verificação, tais como
SULF1, SFRP4, LEF1, TOP2A,
e
CDC2
[26], [26], [27], [39] – [41], e da via integrina sinalização (
ARPC1B
,
COL1A1
,
COL4A1
,
FN1
, e
LAMB1))
. Alguns genes estão também relacionadas com respostas imunitárias adaptativas (por exemplo,
CD14) e metástases de tumores (por exemplo,
CD9
). Os genes regulados negativamente comuns encontrados em GCA e GNCA são consistentes com outros estudos sobre o câncer utilizando microarrays gástricos, tais como
AKR1B10
,
ALDH3A1
,
ATP4B,
CA2
,
IGFBP2
,
KLF4
,
MUC5AC
,
MUC6
,
TFF1
, e
TFF2
[25], [29], [39]. Os genes regulados por baixo do nosso estudo são principalmente envolvidos em vias metabólicas, o desenvolvimento do sistema digestivo, ou a integridade da mucosa. Vários genes são pensados para ter funções específicas no epitélio gástrico, tais como
PGC
e
GIF
, o que implica que desdiferenciação é uma característica comum da carcinogênese [26].
BUB1B
é um gene checkpoint fuso-montagem. Um recente relatório de um caso com várias neoplasias gastrointestinais, incluindo adenocarcinomas gástricos, identificaram uma mutação intrônica homozigoto germinativa no
BUB1B
, com baixos níveis de
BUB1B
mRNA e proteínas em linfócitos e fibroblastos, sugerindo que
BUB1B
é um gene de susceptibilidade para este tumor [40]. Em nosso estudo
BUB1B
foi regulado para cima em ambos os GCA (2,56 vezes) e GNCA (2,11 vezes), que fica em frente ao relatório caso citado, sugerindo que seria útil para investigar
BUB1B
estado de mutação em nossa GCA e pacientes GNCA.
Para genes desregulados significativamente em GCA única, notamos um par de exemplos interessantes aqui.
SOX9
mostrou uma mudança 2,13 vezes em doentes GCA mas nenhum aumento significativo nos casos GNCA.
SOX9
(localizado em 17q24.3-q25.1) pensa-se que desempenham um papel essencial na determinação do sexo e marca a população de células precursoras de células durante a substituição fisiológicos, incluindo o processo regenerativo após a lesão [41], [42 ]. A expressão de
SOX9
já havia sido relatada em vários órgãos como pâncreas e intestino [41], mas não no estômago. Um estudo recentemente publicado descobriu que “
Sox9
marca uma população de células-tronco adultas putativa que contribui para a auto-renovação e reparação do fígado, pâncreas exócrina e intestino, três órgãos de origem endodérmico” [41].
COL2A
é um alvo de regulamentação candidato do
SOX9
[42]. Em nossos casos GCA,
COL2A1
foi regulada para baixo (dobre a mudança 0,27), o que pode ser um resultado de
SOX9
-regulação.
Alguns dos differentially- genes expressos relatados em GCA também foram desregulado em um padrão semelhante como carcinomas de células escamosas de esôfago (CEE) examinaram a partir desta mesma população de alto risco, tais como
CDC25B
e
COL1A2
[43]. Esta semelhança sugere que, apesar de suas diferenças no tipo de célula, CGC e CICAc deste população de alto risco da China provavelmente compartilham fatores genéticos e /ou ambientais comuns em sua etiologia. Evidência para uma influência genética comum é evidente pelos resultados de um estudo de associação do genoma recente, que encontrou um locus de susceptibilidade compartilhado em
PLCE1
tanto para GCA e CICAc [19].
Entre os genes significativamente desregulada em GNCA somente,
DES
é o único que mostrou uma direcionalidade expressão diferente em GNCA (3,24 mudança vezes) do que GCA (0,85 mudança vezes).
DES (Desmin
em 2q35) codifica a desmina, uma proteína do citoesqueleto músculo-específica encontrada nos músculos lisos, cardíacas e do coração. Foram identificados vários genes associados com filamentos de actina, tais como
FNLA
,
ACTN1,
SVIL
e
TPM1
. Vários genes desregulados somente em GNCA também foram relacionados com a matriz extracelular, tais como
EMILIN1
e
TNC
. Estudos sobre
TNC
indicou que up-regulação da
TNC
interrompido substrato celular de adesão [44].
Outro objetivo deste estudo foi investigar como perfis de expressão gênica no tumores diferiu entre os pacientes com diferentes fenótipos clínicos. Embora tenhamos identificado um grande número de associações em nossa designado
P
-valor limite de 0,005, apenas três permaneceu significativa após correção de Bonferroni para comparações múltiplas (ie,
P Art 2.36E-06 ). As associações mais significativas foram de
COL11A1
e
ITGAX
com o estágio do tumor em GNCA, e
UNG jogue com metástase, também em GNCA.
COL11A1
[45] e
ITGAX
[46] têm ambos sido previamente relacionado ao estágio do tumor para outros tipos de câncer (por exemplo, melanoma, cancro do pulmão de células não pequenas), mas não há relatos para
UNG
e metástase.
Nós também procurou avaliar a sobrevivência através da expressão genética para genes que foram significativamente desregulado. Entre os 20 genes relacionados com a sobrevivência GCA e os 36 genes relacionados com a sobrevivência GNCA eram apenas três genes que se sobrepunham –
CTSB
,
LEPR
, e
LipF
. As associações estatísticas mais significativas observadas com a sobrevivência (
P Art 0,01 em testes de log-rank) foram para o
COL11A1, CTSB
, e
MMP9 Compra de GCA, e
ADA
,
ESRRG
, e
LHFP Compra de GNCA. Embora nenhum estudo ainda têm relatado sobre
COL10A1
,
ADA
, ou
LHFP Comprar e sobrevivência do cancro,
CTSB
[47] e
MMP9
[48] ambos foram previamente associados com a sobrevivência no cancro gástrico, enquanto
ESRRG
expressão tem sido associada com a sobrevivência no cancro da próstata [49].
Conclusão
Este é o primeiro relatório centrou-se sobre a expressão gênica global em GCA e GNCA em uma população de alto risco de Shanxi China.